OSER1基因在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用和方法

oser1基因在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用和方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及oser1基因在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用，还涉及提升动物生殖力或延缓生殖衰老的方法。

背景技术：

2.精子质量是影响动物繁殖力的决定性因素之一，对于动物的种繁衍至关重要。由于工业污染对生态的影响，近年来，有报道表明多种野生动物的精子质量显著下降，已经严重威胁到这些动物种的繁殖。而在人类中，精子质量的降低更加显著，精子浓度由50年前的0.99
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108个/ml下降到现在的0.16
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108个/ml，单位精液样本的精子总数由3.37
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108个/ml下降到0.39
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108个/ml(world health organization,2021)。1992年，哥本哈根大学的carlsen等人在顶级医学期刊bmj(british medical journal)上发表了1940-1990年间人类精子质量变化的调查研究，指出人类精液体积下降了19.21％，精液浓度下降了41.6％，首次报道了人类精子质量降低的直接证据(carlsen e.et al.,1992)。2017年，生殖领域顶级期刊《人类生殖学快讯》发表了一项有史以来最大规模调查人类精子数量变化的研究。通过对包含1973-2011年间42935名来自澳大利亚、新西兰、北美及欧洲等国家男性精液样本的研究数据进行汇总分析，发现近40年间男性精子浓度整体下降了52.4％，精子总数下降了59.3％(levine h.et al.,2017)。国际卫生组织(who)公布的最新数据显示1999-2010年间，人类正常精液量和精子浓度分别下降了25％，精子活力和精子正常形态率分别下降18％和11％。2010-2021年间，人类正常精液量继续降低6.6％，精子活力继续降低2％，精子存活率降低4％(world health organization,2021)。这些研究结果直接反应了人类精子质量正经历着普遍性的下降。因此，以优化精子质量为目标的研究对动物繁殖具有重要的研究意义和应用价值。
3.家蚕作为鳞翅目模式昆虫，成为现代遗传工程研究的优良材料。因此，急需开展影响家蚕精子质量的防御机制，以创制具有繁殖力强健性家蚕材料，也为动物体抗衰老和长寿调节研究提供潜在的分子靶标。

技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种过表达oser1基因或激活oser1功能在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用；本发明的目的之二在于提供一种提升动物生殖力或延缓生殖衰老的方法。
5.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.1、过表达oser1基因或激活oser1功能在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用，所述oser1基因的核苷酸序列如1)或2)所示：
7.1)如seq id no.1或seq id no.2所示；
8.2)与seq id no.1至少有70％的碱基相同，且与seq id no.1表达相同功能蛋白质
的核苷酸序列。
9.本发明优选的，所述oser1基因编码的氨基酸序列如1)或2)所示：
10.1)如seq id no.3所示；
11.2)将seq id no.3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有与该蛋白相同功能的衍生蛋白；或与seq id no.3氨基酸序列有至少50％的同源性且具有与该蛋白相同功能的衍生蛋白。
12.本发明优选的，所述过表达oser1基因的方法包括基因瞬时过表达、转基因过表达，或用促进oser1基因转录、翻译的小分子或化合物处理。
13.本发明优选的所述动物为家蚕。
14.本发明优选的，所述提升的宿主为细胞、非遗传性个体或遗传性个体。
15.2、一种提升动物生殖力或延缓生殖衰老的方法，在动物体中过表达oser1基因，或用促进oser1基因转录、翻译或功能激活的小分子或化合物处理；
16.所述oser1基因的核苷酸序列如1)或2)所示：
17.1)如seq id no.1或seq id no.2所示；
18.2)与seq id no.1至少有70％的碱基相同，且与seq id no.1表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
19.本发明优选的，所述过表达oser1基因的方法是构建含有oser1基因的重组表达载体，然后在动物细胞、非遗传性个体或遗传性个体过表达。
20.本发明优选的，所述含有oser1基因的重组表达载体含有由ie2启动子和sv40终止信号调控oser1基因表达的表达核。
21.本发明优选的，所述动物为家蚕。
22.本发明优选的，当动物为家蚕时，将含有oser1基因的重组表达载体纤维注射入蚕卵中，密封后，孵育，蚕卵孵化后，将蚁蚕饲养至蚕蛾，然后筛查转基因蚕蛾，交尾、制种，筛选oser1基因过表达家蚕纯合系。
23.本发明的有益效果在于：本发明公开了过表达oser1基因或激活oser1功能在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用，本发明通过构建家蚕bmoser1基因过表达载体，提升其表达量，可以使蚕蛾的生殖能力得到显著提升，从而延缓动物体的生殖衰老。因此可以利用oser1基因作为靶点用于在蚕业生产中培育高繁殖力的家蚕育种素材和新品种，同时为通过提升生殖力实现家蚕种扩繁效率提供一种新的途径。
附图说明
24.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
25.图1为家蚕bmoser1基因的过表达示意图；
26.图2为bmoser1转基因过表达阳性个体鉴定；
27.图3为bmoser1基因过表达系雄蛾生殖力被显著提升(a：蚕卵发育情况；b：可交配雄蛾数量)；
28.图4为bmoser1基因敲除系雌蛾生殖力被显著降低；
29.图5为bmoser1基因过表达显著延缓个体生殖衰老。
具体实施方式
30.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
31.实施例1、3p3
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egfp-piggybac过表达系统过表达bmoser1基因
32.(1)bmoser1基因cds的克隆及过表达载体构建
33.在ncbi在线工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行bmoser1基因的基因组序列(seq id no.1)和cds序列(seq id no.2)设计克隆引物，设计的引物如seq id no.3和seq id no.4所示，bmoser1基因编码的氨基酸序列如seq id no.5所示。
34.设计引物序列如下：
35.上游克隆引物：5
’‑
atgaccagag aagatgtagttttg-3’(seq id no.3)；
36.下游克隆引物：5
’‑
ttaaatatacatcatttccg-3’(seq id no.4)；
37.送往引物合成公司进行引物合成，提取家蚕胚胎的cdna为pcr扩增模板，利用合成的bmoser1克隆引物进行pcr扩增，并对bmoser1基因的cds进行克隆，克隆bmoser1的cds后，将其5’端连接ie2启动子，3’端连入sv40尾巴，形成一个完整的表达核，将该表达核装载进入3p3
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piggybac-egfp载体的asc i酶切位点中，形成bmoser1过表达载体，如图1所示。
38.(2)家蚕胚胎显微注射及过表达系阳性筛选
39.将bmoser1过表达载体和a3 helper辅助载体以1:1的比例混匀，使两者的终浓度在400ng/μl，用显微注射仪注射到刚产的蚕卵中，注射后将蚕卵上的注射孔用胶水密封后，湿度保持在65％-80％的状态下，放置25℃人工气候培养箱中催青，并随时跟进观察蚕卵发育进程。
40.待蚕卵点清后，集中感光，促进蚕卵整齐孵化，待蚕卵孵化后，将蚁蚕在适宜的温度和湿度条件下饲养至蚕蛾，然后利用荧光显微镜对每头蚕蛾的复眼进行荧光筛查，筛选复眼含有绿荧光的蚕蛾，如图2所示，进行交尾、制种，继续饲养几代筛选bmoser1基因过表达家蚕纯合系。
41.(3)家蚕胚胎显微注射及bmoser1敲除系阳性筛选
42.在silkdb3.0数据库查bmoser1基因，分析外显子数量及长度、翻译起始位点与终止位点等基因的结果和序列信息。利用chopchop(http://chopchop.cbu.uib.no/#)设计sgrna，选择切割效率得分高的两条sgrna(sgrna1：5
’‑
cttgtgaacacactcctagctgg-3’(seq id no.6)，sgrna2：5
’‑
atttcttcttactgacaccccgg-3’(seq id no.7))，在其两端分别添加上t7启动子和同源臂，送华大基因合成。体外转录合成grna，使用显微注射仪将grna与cas9蛋白的混合液注入野生型品系大造的蚕卵内，随后用胶水轻轻触碰注射的针孔使其封闭。将注射完成的蚕卵分别标注上注射样品、时间、蚕种类型等标记，置于25℃恒温保湿培养箱中催青孵育，注射当代为g0代。
43.饲养g0代，化蛾后剪翅膀提基因组检测，根据检测结果选择测序为套峰，即被成功编辑的个体制种，获得g1代，克隆检测g1代个体的具体编辑类型，筛选获得缺失71bp等8种编辑类型，后续通过不断自交的方式，成功获得从orf第114个碱基至第185个碱基总计缺失71bp以及缺失3bp的bmoser1纯合敲除系。
44.(4)bmoser1基因对家蚕个体生殖力的影响测定
45.将对照组家蚕和bmoser1过表达系及bmoser1敲除系家蚕分别在标准饲养条件下催青，饲养至上蔟和羽化，取新羽化的对照组品系大造雄蛾和实验组bmoser1过表达雄蛾，分别与大造雌蛾交配，每6小时更换一次雌蛾，直至该雄蛾无法与新更换的新羽化处女蛾成功交尾为止，记录其能够成功交配的雌蛾的数量及蚕卵发育情况。结果显示，bmoser1基因能够成功交配的雌蛾数量显著高于对照组，表明过表达系家蚕生殖力被显著提升，如图3所示；取新羽化的对照组品系大造雌蛾和实验组bmoser1敲除雌蛾，令对照组品系大造雄蛾分别与其交配，记录雌蛾产卵数量。结果显示，bmoser1基因敲除系家蚕产卵量显著低于对照组，表明oser1敲除系家蚕的生殖力被显著降低，如图4所示。
46.(4)bmoser1基因过表达系家蚕生殖衰老的测定
47.将对照组家蚕和bmoser1过表达系家蚕在标准饲养条件下催青，饲养至上蔟和羽化，取新羽化的对照组品系大造雄蛾和实验组bmoser1过表达雄蛾，分别与雌蛾交配，每6小时更换一次雌蛾，直至该雄蛾无法与新更换的新羽化处女蛾成功交尾为止，记录其从开始与第一只能产下正常受精卵的雌蛾交配至结束与最后一只能够产下正常受精卵雌蛾交配的时间跨度，即为每头雄蛾的有效生殖维持时长。结果表明，bmoser1基因过表达系家蚕生殖衰老速率被显著延缓，如图5所示。
48.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：

1.过表达oser1基因或激活oser1功能在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用，其特征在于：所述oser1基因的核苷酸序列如1)或2)所示：1)如seq id no.1或seq id no.2所示；2)与seq id no.1至少有70％的碱基相同，且与seq id no.1表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述过表达oser1基因在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用，其特征在于：所述oser1基因编码的氨基酸序列如1)或2)所示：1)如seq id no.3所示；2)将seq id no.3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有与该蛋白相同功能的衍生蛋白；或与seq id no.3氨基酸序列有至少50％的同源性且具有与该蛋白相同功能的衍生蛋白。3.根据权利要求1所述过表达oser1基因在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用，其特征在于：所述过表达oser1基因的方法包括基因瞬时过表达、转基因过表达，或用促进oser1基因转录、翻译的小分子或化合物处理。4.根据权利要求1～3任一项所述过表达oser1基因在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用，其特征在于：所述动物为家蚕。5.根据权利要求1所述过表达oser1基因在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用，其特征在于：所述提升的宿主为细胞、非遗传性个体或遗传性个体。6.一种提升动物生殖力或延缓生殖衰老的方法，其特征在于：在动物体中过表达oser1基因，或用促进oser1基因转录、翻译或功能激活的小分子或化合物处理；所述oser1基因的核苷酸序列如1)或2)所示：1)如seq id no.1或seq id no.2所示；2)与seq id no.1至少有70％的碱基相同，且与seq id no.1表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。7.根据权利要求6所述提升动物生殖力或延缓生殖衰老的方法，其特征在于：所述过表达oser1基因的方法是构建含有oser1基因的重组表达载体，然后在动物细胞、非遗传性个体或遗传性个体过表达。8.根据权利要求7所述提升动物生殖力或延缓生殖衰老的方法，其特征在于：所述含有oser1基因的重组表达载体含有由ie2启动子和sv40终止信号调控oser1基因表达的表达核。9.根据权利要求6～8任一项所述提升动物生殖力或延缓生殖衰老的方法，其特征在于：所述动物为家蚕。10.根据权利要求9所述提升动物生殖力或延缓生殖衰老的方法，其特征在于：将含有oser1基因的重组表达载体纤维注射入蚕卵中，密封后，孵育，蚕卵孵化后，将蚁蚕饲养至蚕蛾，然后筛查转基因蚕蛾，交尾、制种，筛选oser1基因过表达家蚕纯合系。

技术总结

本发明公开了过表达OSER1基因或激活OSER1功能在提升动物生殖力或延缓生殖衰老中的应用和方法，本发明通过采用过表达OSER1基因，升高其表达水平，结果显示可以增强个体生殖力，延缓生殖衰老，该结果为改善动物生殖力提供了新的分子靶点候选，也为延缓生殖衰老提供了新策略，对提高动物生殖力或延缓生殖衰老具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。

技术研发人员：

代方银 宋江波 李知泉 陈欣 童晓玲 周磊 韩民锦 胡海

受保护的技术使用者：

西南大学

技术研发日：

2022.08.17

技术公布日：

2023/3/2