一种用于定量检测拟禾本科根结线虫的多组合引物、试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种基于转录组学数据开发拟禾本科根结线虫qpcr定量检测引物组合，并将其应用于拟禾本科根结线虫定量检测试剂盒的制备。

背景技术：

2.水稻是世界上主要的粮食作物之一，其生长过程会受到200多种植物线虫的侵染和危害。近年来，随着水稻种植模式的调整和环境条件的改变，水稻重大病虫害频繁暴发成灾一直是水稻安全生产的重要阻碍。特别是高产低抗逆性作物品种的大面积推广、水稻种植模式的调整、全球气候变暖的影响以及人为不合理的防治等原因，水稻根结线虫病成灾问题日趋严重，成为水稻安全生产的重要阻碍，也是影响水稻稳定生产和国家粮食安全的重要因素。水稻根结线虫病作为一种新发生水稻重大病害在我国水稻主产区发生危害并迅速蔓延至我国多个省份，造成产量损失为 11%～80%，甚至绝收。水稻根结线虫病危害前期不显症状、一旦爆发危害严重，其病原拟禾本科根结线虫侵染水稻根系后导致根部产生根结，单个雌虫经过 22～26 天可产生 200～400 条后代，因此水稻连作 2～3 年便可导致病害大爆发。拟禾本科根结线虫繁殖能力强、世代重叠严重、对土壤环境适应性强，可在旱稻、低洼地水稻、灌溉地水稻、深水水稻种植区反复危害，加之目前可选防治药剂相对较少、成本较高，一旦发生难以根除，极大增加病害防治难度。因此，快速定量检测拟禾本科根结线虫可为准确预测水稻根结线虫病的发生趋势、选择积极防治策略提供有效手段。
3.实时荧光定量pcr技术（quantitative real-time pcr，qpcr）因其快速、灵敏度高、定量检测等特点，已广泛应用于临床疾病诊断和植物病害诊断等检测领域。在植物线虫定量检测方面，引物开发多以核糖体dna内转录间隔区（its）、核糖体18s rrna、核糖体28s rrna、核糖体基因间隔区（igs）、线粒体dna的coi基因等为检测靶标，依据其序列差异涉及特异性引物。本发明专利首次采取基于转录组学数据开发禾本科根结线虫qpcr定量检测引物的策略，旨在为拟禾本科根结线虫的定量检测提供充足的特异性检测引物、试剂盒及配套检测方法。

技术实现要素：

4.要解决的问题我国新发水稻重大病害—水稻根结线虫病危害程度及蔓延趋势日趋严重，且缺乏有效的防治手段，亟需配套的快速定量检测技术为病害流行和预测提供有效支持。此外，目前植物线虫实时荧光定量检测引物多以its、18s rrna、28s rrna、igs、mtdna等基因为检测靶标，如靶标基因相对保守，则较难获得高质量的特异性引物。
5.针对上述两个问题，本发明专利首次采取转录组学高通量开发策略，选取拟禾本科根结线虫高表达基因在genbank进行nucleotide blast比对，选取与已知植物线虫基因
序列相似度低于20%的基因为靶标，利用beacon designer8软件设计qpcr特异性引物，进而以特异性好、扩增效率高的引物为基础研发禾本科根结线虫定量检测试剂盒，极大丰富了拟禾本科根结线虫的定量检测的技术，为水稻根结线虫病的流行和预测提供有效技术支持。
6.技术方案为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
7.一种基于转录组数据开发策略的拟禾本科根结线虫的qpcr引物开发，包括以下步骤：（1）选取拟禾本科根结线虫转录组数据中高表达基因在genbank进行nucleotide blast比对，选取与植物线虫已知基因序列相似度低于20%的基因为检测靶标；（2）利用beacon designer8软件设计qpcr引物；（3）利用普通pcr对步骤（2）所获得qpcr引物进行特异性分析，选取特异性较高的qpcr引物。
8.一种用于定量检测拟禾本科根结线虫的多组合引物，所述的多组合引物为如下四组所示，用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合a：（a）seq id no：1和seq id no：2；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合b：（b）seq id no：3和seq id no：4；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合c：（c）seq id no：5和seq id no：6；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合d：（d）seq id no：7和seq id no：8。
9.上述所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物中，所述的qpcr引物组合a组中，对拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.3467x+22.269，r2=0.9997。
10.上述所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物中，所述的qpcr引物组合b组中，对拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.4647x+23.108，r2=0.9984。
11.上述所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物中，所述的qpcr引物组合c组中，对拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.4697x+22.151，r2=0.9999。
12.上述所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物中，所述的qpcr引物组合d组中，对拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.268x+23.696，r2=0.9953。
13.一种含有上述所述的多组合引物用于定量检测拟禾本科根结线虫的试剂盒。
14.一种用于定量检测拟禾本科根结线虫的检测方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品dna；（2）以步骤（1）待检测dna作为模板，采用权利要求1所述的多组合引物进行qpcr扩增反应；（3）收集数据，分析qpcr扩增曲线、溶解曲线及定量检测结果。
15.上述所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的检测方法中，步骤（2）中qpcr扩增反应的反应体系以20μl计为：
待检测dna模板1.0μl；10μmol/l权利要求1所述的qpcr引物的上游引物0.8μl；10μmol/l权利要求1所述的qpcr引物的下游引物0.8μl；tb greenpremixextaq
tm
（tlirnasehplus）10μl；ddh2o补足至20μl。上述所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的检测方法中，步骤（2）中qpcr扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，40个循环；65℃5s，95℃5s。
16.上述所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的检测方法中，步骤（3）中分析qpcr数据分析为利用扩增循环阈值和标准曲线对拟禾本科根结线虫进行定量。
17.有益效果相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明所述qpcr引物、试剂盒及检测方法，具备特异性强、灵敏度高、检测效率高、定量检测的优点，极大丰富了拟禾本科根结线虫的定量检测的技术，为水稻根结线虫病的流行和预测提供有效技术支持。首先，本发明首次采取基于转录组学数据的qpcr引物开发策略，获得4个仅存在于拟禾本科根结线虫的特有基因，并以此为靶标基因获得4对特异性强、扩增效率高的qpcr引物，为拟禾本科根结线虫的定量检测提供充足的备选qpcr引物。其次，基于上述4组特异性qpcr研发的试剂盒应用范围较广，可用于单条线虫、感病植物组织、发病土壤中拟禾本科根结线虫的检测。此外，本发明检测试剂盒且具有很高的检测灵敏度，其灵敏度较普通pcr高10倍，且可实现对线虫的定量检测，为拟禾本科根结线虫的定量检测和水稻根结线虫病的测报提供有力支持。
附图说明
18.图1为实施例2拟禾本科根结线虫qpcr检测方法及标准曲线建立的结果图；图2为实施例3拟禾本科根结线虫4组qpcr引物特异性检测结果图；图3为实施例4用于检测拟禾本科根结线虫单条雌虫灵敏度结果图；图4为实施例5用于感病根组织内拟禾本科根结线虫定量检测的结果图；图5为实施例6用于发病土壤中拟禾本科根结线虫定量检测的结果图。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
20.以下实施例中使用的qpcr反应板购自生工生物工程（上海）有限公司，商品编号f603101-0001，tb green premix ex taq
tm
(tli rnaseh plus) 购自宝生物工程 (大连)有限公司，商品编号rr420a；mollusc dna kit购自美国omega公司，商品编号d3373-01；dneasy powersoil kit购自德国qiagen公司，商品编号12888-100；plant genomic dna kit购自天根生化（北京）科技有限公司，商品编号s7110。
21.实施例1基于转录组开发策略的拟禾本科根结线虫qpcr引物开发选取85个拟禾本科根结线虫2龄幼虫转录组中高表达基因在genbank进行nucleotide blast比对，选取20个与其它植物线虫基因序列相似度低于20%的基因为检测
靶标，并利用beacon designer8软件设计qpcr引物。将拟禾本科根结线虫dna作为处理组1，将南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫、水稻潜根线虫、水稻干尖线虫和肾形肾状线虫的dna等量混合作为处理组2。分别以处理组1和处理组2为模板，对上述设计的xx对qpcr引物进行普通pcr，初步筛选到可以特异性扩增处理组1而对处理组2无扩增的qpcr引物4对，引物序列如下：用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合a：上游引物mg356f（seq id no.1）：5’－tgggtaatgtctttgcta－3
’ꢀ
；下游引物mg356r（seq id no.2）：5
’ꢀ
－gcttgtagagaattgtcg－3
’ꢀ
；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合b：上游引物mg1178f（seq id no.3）：5
’ꢀ
－cgatccgtgttataaaca－3
’ꢀ
；下游引物mg1178r（seq id no.4）：5
’ꢀ
－ctgctcagattcaatcata－3
’ꢀ
；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合c：上游引物mg2315f（seq id no.5）：5
’ꢀ
－tggacttgatgtgttcaa－3
’ꢀ
；下游引物mg2315r（seq id no.6）：5
’ꢀ
－ttcccataattttcgaatattaatg－3
’ꢀ
；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合d：上游引物mg4562f（seq id no.7）：5
’ꢀ
－cggtggtcttataacaac－3
’ꢀ
；下游引物mg4562r（seq id no.8）：5
’ꢀ
－gtacgaggattaaatataattgg－3
’ꢀ
。
22.实施例2拟禾本科根结线虫qpcr检测方法及标准曲线的建立本实施例的用于拟禾本科根结线虫的定量检测方法，包括以下步骤：（1）拟禾本科根结线虫dna提取及标准液制备：收集已纯化的拟禾本科根结线虫2龄幼虫，接种于已生长2周的感病水稻根部并在温室中培养30天。于体视显微镜下扒开水稻根部根结，使根结内部的卵充分释放于ddh2o中，于26℃培养箱中孵化2天。收集孵化的大量2龄幼虫，用mollusc dna kit提取线虫dna，检测浓度并稀释至100 ng/μl。将100 ng/μl 的dna按10倍梯度稀释，获得浓度分别为10 ng/μl 、1ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl、10-6
ng/μl的标准液。
23.（2）以步骤（1）制备的dna标准液作为dna模板，分别采用实施例1中所述的4组qpcr引物进行qpcr扩增反应；步骤（2）中qpcr扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，40个循环；65℃5s，95℃5s；步骤（2）中qpcr扩增反应的反应体系以20μl计为：dna标准液1.0μl；10μmol/l上述所述的qpcr引物的上游引物0.8μl；10μmol/l上述所述的qpcr引物的下游引物0.8μl；tb greenpremixextaq
tm
（tlirnasehplus）10μl；ddh2o补足至20μl。（3）按步骤（2）流程进行qpcr扩增，分析扩增曲线、溶解曲线，建立拟禾本科根结线虫dna浓度对数值（x）与ct值（y）的标准曲线。扩增曲线ct值小于35且有典型s型扩增曲线，
5*lysis buffer，65℃处理1h，95℃处理10min，－20℃保存备用；（2）以单条雌虫dna提取液20μl作为母液，取1μl作为初始浓度并以1/20计，按10倍梯度依次稀释为1/20x10-1
、1/20x10-2
、1/20x10-3
、1/20x10-4
、1/20x10-5
、1/20x10-6
、1/20x10-7
条雌虫作为待检测dna模板，采用实施例1中所述的qpcr引物、实施例2所述qpcr检测方法对单条雌虫灵敏度进行测试；如图3中（a）所示，qpcr引物组合a对拟禾本科根结线虫单条雌虫定量检测的标准曲线为y=-3.913x+21.064，线性相关系数r2=0.9895，检测极限为1/20x10-3
条雌虫；如图3中（b）所示，qpcr引物组合b对拟禾本科根结线虫单条雌虫定量检测的标准曲线为y=-5.6067x+20.622，线性相关系数r2=0.9999，检测极限为1/20x10-1
条雌虫；如图3中（c）所示，qpcr引物组合c对拟禾本科根结线虫单条雌虫定量检测的标准曲线为y=-3.0083x+24.643，线性相关系数r2=0.9601，检测极限为1/20x10-2
条雌虫；如图3中（d）所示，qpcr引物组合d对拟禾本科根结线虫单条雌虫定量检测的标准曲线为y=-1.8533x+24.834，线性相关系数r2=0.9926，检测极限为1/20x10-2
条雌虫；如图3中所示，标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”分别指1/20、1/20x10-1
、1/20x10-2
、1/20x10-3
、1/20x10-4
、1/20x10-5
、1/20x10-6
、1/20x10-7
条雌虫。
28.实施例5感病根组织内拟禾本科根结线虫定量检测本实施例的用于感病根组织内拟禾本科根结线虫定量检测的方法，包括以下步骤：（1）感病根组织样品处理及dna提取：取0.1g的健康水稻根组织与1000条拟禾本科根结线虫2龄幼虫混合制备感病根组织样品；利用plant genomic dna kit提取感病根组织dna并溶解至20μl，取1μl作为初始浓度并以每0.1g根组织中含有1000条2龄幼虫计，按10倍梯度依次稀释为每0.1g根组织中含有100条、10条、1条、10-1
条、10-2
条、10-3
条、10-4
条2龄幼虫。
29.（2）以步骤（1）所制备dna为待检测样品，采用实施例1中所述的qpcr引物、实施例2所述qpcr检测方法对感病根组织内拟禾本科根结线虫进行定量检测。
30.如图4中（a）所示，qpcr引物组合a对感病根组织内拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-2.8192x+31.682，线性相关系数r2=0.9837，扩增效率为126%，检测极限为每0.1g根组织含10-1
条2龄幼虫。
31.如图4中（b）所示，qpcr引物组合b对感病根组织内拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-2.9333x+33.568，线性相关系数r2=0.9921，扩增效率为119%，检测极限为每0.1g根组织含10条2龄幼虫。
32.如图4中（c）所示，qpcr引物组合c对感病根组织内拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.1668x+32.745，线性相关系数r2=0.9964，扩增效率为107%，检测极限为每0.1g根组织含1条2龄幼虫。
33.如图4中（d）所示，qpcr引物组合d对感病根组织内拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.0687x+32.439，线性相关系数r2=0.9673，扩增效率为112%，检测极限为每0.1g根组织含1条2龄幼虫。
34.如图4中所示，标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”分别指每0.1g感病根组织
中含有1000、100、10、1、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
条拟禾本科根结线虫2龄幼虫。
35.实施例6发病土壤中拟禾本科根结线虫定量检测本实施例的用于发病土壤中拟禾本科根结线虫的定量检测，包括以下步骤：（1）发病土壤的制备及dna提取：取0.5g的健康土壤与1000条拟禾本科根结线虫2龄幼虫混合制备发病土壤；利用dneasy powersoil kit提取发病土壤dna并溶解至20μl，取1μl作为初始浓度并以每0.1g发病土壤中含有1000条2龄幼虫计，按10倍梯度依次稀释为每0.1g发病土壤中含有100条、10条、1条、10-1
条、10-2
条、10-3
条、10-4
条2龄幼虫。
36.（2）以步骤（1）所制备dna为待检测样品，采用实施例1中所述的qpcr引物、实施例2所述qpcr检测方法对发病土壤内拟禾本科根结线虫进行定量检测。
37.如图5中（a）所示，qpcr引物组合a对发病土壤内拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.4376x+31.528，线性相关系数r2=0.9982，扩增效率为95%，检测极限为每0.5g土壤含10-2
条2龄幼虫。
38.如图5中（b）所示，qpcr引物组合b对发病土壤内拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-2.6031x+30.885，线性相关系数r2=0.9766，扩增效率为142%，检测极限为每0.5g土壤含10条2龄幼虫。
39.如图5中（c）所示，qpcr引物组合c对发病土壤内拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.4862x+32.359，线性相关系数r2=0.9984，扩增效率为94%，检测极限为每0.5g土壤含10条2龄幼虫。
40.如图5中（d）所示，qpcr引物组合d对发病土壤内拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.6472x+34.154，线性相关系数r2=0.9439，扩增效率为88%，检测极限为每0.5g土壤含1条2龄幼虫。
41.如图5中所示，标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”分别指的是每0.5g发病土壤中含有1000、100、10、1、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
条拟禾本科根结线虫二龄幼虫。
42.综上所述，由实施例1-6可见，本发明qpcr引物、试剂盒及检测方法，极大充实了拟禾本科根结线虫的定量检测的技术，具备特异性强、灵敏度高、检测效率高、定量检测的优点，为水稻根结线虫病的流行和预测、指导科学施药具有重要意义；其中，4组qpcr引物基于转录组学数据的开发策略，检测靶标基因为拟禾本科根结线虫的特有基因，为拟禾本科根结线虫的定量检测提供充足的备选qpcr引物；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测效率，兼具特异性强、灵敏度高的优点，且具有较广的应用场景，可用于单条线虫、感病植物组织、发病土壤中拟禾本科根结线虫的定量检测。
43.以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

技术特征：

1.一种用于定量检测拟禾本科根结线虫的多组合引物，其特征在于：所述的多组合引物为如下四组所示，用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合a：（a）seq id no：1和seq id no：2；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合b：（b）seq id no：3和seq id no：4；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合c：（c）seq id no：5和seq id no：6；用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物组合d：（d）seq id no：7和seq id no：8。2.根据权利要求1所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的多组合引物，其特征在于：所述的qpcr引物组合a组中，对拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.3467x+22.269，r2=0.9997。3.根据权利要求1所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物，其特征在于：所述的qpcr引物组合b组中，对拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.4647x+23.108，r2=0.9984。4.根据权利要求1所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物，其特征在于：所述的qpcr引物组合c组中，对拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.4697x+22.151，r2=0.9999。5.根据权利要求1所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的qpcr引物，其特征在于：所述的qpcr引物组合d组中，对拟禾本科根结线虫定量检测的标准曲线为y=-3.268x+23.696，r2=0.9953。6.一种含有权利要求1-5任意一项所述的多组合引物用于定量检测拟禾本科根结线虫的试剂盒。7.一种用于定量检测拟禾本科根结线虫的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提取待测样品dna；（2）以步骤（1）待检测dna作为模板，采用权利要求1所述的多组合引物进行qpcr扩增反应；（3）收集数据，分析qpcr扩增曲线、溶解曲线及定量检测结果。8.根据权利要求7所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的检测方法，其特征在于：步骤（2）中qpcr扩增反应的反应体系以20μl计为：
。9.根据权利要求7所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的检测方法，其特征在于：步骤（2）中qpcr扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，40个循环；65℃5s，95℃5s。10.根据权利要求7-9任意一项所述的用于定量检测拟禾本科根结线虫的检测方法，其特征在于：步骤（3）中分析qpcr数据分析为利用扩增循环阈值和标准曲线对拟禾本科根结线虫进行定量。

技术总结

本发明公开了一种用于定量检测拟禾本科根结线虫的多组合引物、试剂盒及其检测方法，属于生物安全技术领域。多引物组合为如下4组：用于检测拟禾本科根结线虫的qPCR引物组合A、引物组合B、引物组合C、引物组合D。还提供含有拟禾本科根结线虫定量检测引物的试剂盒。进一步提供基于定量引物建立的检测方法，可用于单条线虫、感病植物组织、发病土壤中拟禾本科根结线虫的定量检测。首次基于转录组学数据开发策略筛选4对特异性引物用于拟禾本科根结线虫的定量检测，4对引物均兼具特异性强、灵敏度高、检测效率高的优点，对水稻根结线虫病的早期诊断、拟禾本科根结线虫的定量检测和指导科学施药具有重要意义。学施药具有重要意义。学施药具有重要意义。