一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株及其制备方法与应用

1.本发明属于兽用生物制品领域技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株及其制备方法与应用。

背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)感染引起的一种以猪发热和全身器官出血为特征的急性、烈性、高度接触性传染病，强毒株死亡率接近100％。各阶段的家猪、野猪和软蜱是非洲猪瘟自然宿主，可在家猪和野猪之间直接传播，也可通过蜱虫叮咬传播，还可以通过污染了病毒的泔水、饲料和肉制品等跨区域和跨国家传播。当前没有商品化的疫苗和特效药物，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过捕杀手段进行控制，但这种方式不仅导致重大经济损失，也无法满足我国规模化养猪的需要。因此，研制有效、安全的疫苗十分迫切。
3.目前针对非洲猪瘟疫苗的研制主要通过三种方式：一、直接针对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二、筛选出病毒诱导免疫应答的抗原蛋白，进而制备亚单位疫苗；三、采用基因缺失手段敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用的方法，由于非洲猪瘟病毒感染具有抗体依赖的增强作用(ade)、免疫抑制等特征，导致灭活疫苗免疫猪无法提供有效的免疫保护作用；第二种方法限制因素是非洲猪瘟病毒基因组庞大、结果复杂，大部分功能未知，目前诱导的免疫应答的抗原还不清楚，已知的抗原还不能诱导有效的免疫保护作用。而目前最有希望突破的疫苗是基因敲除弱毒疫苗，通过对免疫抑制等毒力相关基因进行敲除，获得既具有免疫原性，又对猪没有致病作用的疫苗候选毒株，免疫猪后提供完全的保护作用。例如，中国专利cn110093324a提供了一种非洲猪瘟病毒七基因缺失弱毒株，该毒株是基于非洲猪瘟病毒pig/cn/hlj/2018株的七基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：cd2v基因编码产物和六个多基因家族基因(多基因家族360基因12l、13l、14l和多基因家族505基因1r、2r、3r)编码产物，接种仔猪免疫28天后，以asfv原始毒进行攻毒试验，获得100％免疫保护；又如中国专利cn114107228a公开了一种十二基因缺失的减毒非洲猪瘟疫苗，在asfv cn/gs 2018毒株中联合缺失了g-acd-001900、mgf110-9l、g-acd-0021和九个多基因家族基因(多基因家族360基因9l、10l、11l、12l、13l、14l和多基因家族505基因1r、2r、3r)，接种仔猪后，以亲本毒株进行攻毒试验，获得100％免疫保护。
4.研究非洲猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗需要考虑到对猪的免疫应答和保护，还要兼顾安全性能。在现有的技术中还需要考虑如下因素：(1)毒力基因敲除后是否带毒或排毒，这是基因缺失疫苗安全性的一个重要的指标；(2)非洲猪瘟病毒编码超过160个蛋白，毒力基因也众多，哪些毒力基因的缺失具有最佳的免疫保护性和安全性，这是一个长期艰巨的工作；(3)不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，而且多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险。
5.因此，在非洲猪瘟减毒疫苗的制备过程中，鉴定基因功能及其对致病性和免疫应答的影响，为敲除靶标基因的选择和基因敲除的构建提供依据，新的靶标基因的筛选至关重要，决定着疫苗候选株的安全性和免疫的有效性。在mgf505-7r基因的研究中，非洲猪瘟病毒pig/cn/hlj/2018株敲除mgf505-7r基因，免疫剂量为105had
50
感染猪后致死率显著降低，但仍然存在部分毒力,猪存活率约为60％(li et al.pmgf505-7r determines pathogenicity of african swine fever virus infection by inhibiting il-1βand type i ifn production.plos pathogens.2021)；非洲猪瘟病毒cn/gs/2018株敲除mgf505-7r基因，较低的免疫剂量(10had
50
)感染猪后全部存活，但仍然存在明显的临床症状，如体温升高、带毒等(li etal.african swine fever virus protein mgf-505-7r promotes virulence and pathogenesis by inhibiting jak1-and jak2-mediated signaling.journal of biological chemistry.2021)。
6.非洲猪瘟病毒pig/cn/hlj/2018株敲除h240r基因(asfv-δh240r)，h240r基因编码蛋白的功能丧失，感染猪肺泡巨噬细胞诱导更高水平的干扰素反应及抗病毒基因高表达。通过动物实验将105had
50 asfv-δh240r感染猪，感染后第6天体温升高，且免疫后猪血液中存在带毒现象。现在亟需一款完全减毒并且免疫原性好的疫苗病毒株。

技术实现要素：

7.本发明的目的是为了提供了一种构建非洲猪瘟减毒株的策略以及提供一种完全减毒并且免疫原性好的疫苗病毒株。
8.本发明提供一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株，所述重组减毒株是以非洲猪瘟病毒株为出发菌株，突变非洲猪瘟病毒的h240r和非洲猪瘟病毒的mgf505-7r基因获得的。
9.进一步地限定，所述非洲猪瘟病毒株为基因ii型非洲猪瘟病毒。
10.进一步地限定，所述非洲猪瘟病毒猪为pig/hlj/2018株。
11.进一步地限定，所述非洲猪瘟病毒的h240r基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述非洲猪瘟病毒的mgf505-7r基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.进一步地限定，所述非洲猪瘟病毒的h240r基因的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述非洲猪瘟病毒的mgf505-7r基因的氨基酸序列如seq id no.4所示。
13.本发明提供一种构建上述的重组减毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段突变非洲猪瘟病毒中的h240r基因和mgf505-7r基因。
14.进一步地限定，所述的方法具体步骤如下：
15.步骤1，构建缺失h240r基因的重组病毒：将h240r基因如seq id no.2所示，与p72-egfp质粒连接获得p72-egfp-h240r载体，mgf505-7r基因的sgrna与px330质粒连接获得px330-sgh240r载体，然后将p72-egfp-h240r载体和px330-sgh240r载体共转染到猪肺泡巨噬细胞中，然后将asfv/cn/hlj/18病毒感染上述获得的转染后的猪肺泡巨噬细胞中，获得缺失h240r基因的重组病毒；
16.步骤2：将mgf505-7r基因如seq id no.1所示，与p72-mcherry质粒连接获得p72-mcherry-mgf505-7r，靶向h240r基因的sgrna与px330质粒获得px330-sgmgf505-7r载体，然后将p72-mcherry-mgf505-7r和px330-sgmgf505-7r载体共转染到猪肺泡巨噬细胞中，然后
将步骤1获得的缺失h240r基因的重组病毒感染上述获得的转染后的猪肺泡巨噬细胞中，获得缺失h240r基因和mgf505-7r基因的重组病毒。
17.进一步地限定，所述p72-egfp载体是将seq id no.7序列与pbluescript ii ks(+)载体连接获的；所述p72-mcherry载体是将seq id no.8序列与pbluescript ii ks(+)载体连接获得的。
18.本发明提供一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株，所述重组减毒株是以非洲猪瘟病毒株为出发菌株，通过联合丧失非洲猪瘟病毒中h240r基因和mgf505-7r基因编码蛋白的功能制备非洲猪瘟病毒重组减毒株。
19.进一步地限定，以上述的重组减毒株为基础毒株，突变cd2v基因、mgf家族基因获得多基因缺失的病毒。
20.本发明提供一种非洲猪瘟的疫苗，所述疫苗含有上述的重组减毒株。
21.进一步地限定，所述疫苗为单价疫苗、二价疫苗或多价疫苗。
22.本发明提供上述的疫苗在制备或预防非洲猪瘟的药物中的应用。
23.本发明提供上述的疫苗在制备辅助或预防非洲猪瘟的保健品中的应用。
24.有益效果：本发明通过联合丧失h240r基因和mgf505-7r基因编码蛋白的功能，获得了一株安全性好的减毒非洲猪瘟病毒毒株；免疫所述减毒非洲猪瘟病毒毒株(每头猪肌肉注射105had
50
)猪不发病，且同居猪核酸和抗体均为阴性，说明无水平传播现象；攻毒实验表明所述减毒非洲猪瘟病毒毒株能对pig/cn/hlj/2018强毒株攻毒提供100％免疫保护，可作为安全和有效的防控非洲猪瘟的疫苗，具有极大的社会价值，并且，由于不同基因型的非洲猪瘟病毒中的h240r基因和mgf505-7r基因编码的蛋白序列具有高度同源(图1和图2)，因此，可以在不同基因型非洲猪瘟病毒中敲除h240r基因和mgf505-7r基因，也能够成功构建非洲猪瘟病毒减毒疫苗。但本发明并不局限于pig/cn/hlj/2018分离株。将不同基因型的非洲猪瘟病毒中的h240r基因和mgf505-7r基因编码的蛋白序列进行比较，发现h240r基因和mgf505-7r基因编码的蛋白具有高度同源(图1和图2)，因此，不同基因型非洲猪瘟病毒中h240r基因和mgf505-7r基因编码的蛋白具有相似的功能，敲除h240r基因和mgf505-7r基因的重组病毒，也能够成功构建非洲猪瘟病毒减毒候选疫苗。
附图说明
25.图1为不同基因型非洲猪瘟病毒中mgf505-7r基因编码蛋白的序列对比结果；
26.图2为不同基因型非洲猪瘟病毒中h240r基因编码蛋白的序列对比结果；
27.图3为asfv mgf505-7r基因缺失载体(表达红荧光)构建示意图；
28.图4为asfv h240r基因缺失载体(表达绿荧光)构建示意图；
29.图5为asfv-δh240r-δ7r表达红绿双荧光蛋白；
30.图6为asfv-δh240r-δ7r鉴定结果，其中，图a是h240r-jd-o-f/r引物对检测重组病毒asfv-δh240r-δ7r结果图，图b是7r-jd-o-f/r引物对检测重组病毒asfv-δh240r-δ7r结果图；
31.图7为asfv-δh240r的鉴定，其中，图(a)是荧光显微镜下观察重组病毒asfv-δh240r的结果，图(b)是h240r-jd-o-f/r引物检测asfv-δh240r的结果；
32.图8为asfv-δh240r免疫及对照毒株感染后猪体温变化图；其中，横坐标是感染后
inhibiting il-1βand type i ifn production.plos pathogens.2021)中的设计策略，通过基因合成的方式将p72启动子和红荧光蛋白(mcherry)融合，基因序列如seq id no.8所示，将合成的序列通过hindiii和bamhi连接到克隆载体pbluescript ii ks(+)中，构建的载体命名为p72-mcherry。
47.p72-egfp载体是将seq id no.7
48.aagcttttgttattatcaagatccttcgcataaaccgccatatttaataaaaacaataaattatttttataacattatatagccaccatggattacaaggatgacgacgataagacgcgtgcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggaccggaattcatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagaattc
49.p72-mcherry载体是将seq id no.8
50.aagcttttgttattatcaagatccttcgcataaaccgccatatttaataaaaacaataaattatttttataacattatatagccaccatggattacaaggatgacgacgataagacgcgtgcaacaaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggaccggaattcatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaagaattcttttttttttggatcc；
51.实施例1.构建减毒疫苗株的重组载体
52.h240r基因的核苷酸序列如seq id no.1所示：
53.atggctgcaaacattattgcaacaagagccgtgccaaagatggccagcaaaaaagagcatcaatactgtctgctagactcccaggaaaagcgtcatgggcattatcccttttcatttgaattaaagccttatgggcaaacaggcgcaaatatcataggagtacagggctcacttacccatgttatcaaaatgacagtatttccatttatgattccttttcctttacaaaaaactcatatagatgattttattggtggacgcatttatttattttttaaggaactggacatgcaagcagtttctgatgtaaatggaatgcaataccacttcgagttcaaggttgttcctgtaagccccaaccaagtagagctt
cttcctgtgaataataaatataaatttacatatgctataccggtagtgcaataccttaccccaatcttttatgatctttcgggaccgctagatttcccattagatactctttcggtccatgtggatatcctctccaatcatatacagcttcctatccaaaaccataacctaacaacgggtgatcgtgtttttatttctggatataaacacctgcaaacgattgaattatgtaaaaataacaagatttttatcaaaaatataccgccgctttcatccgaaaaaataaaactatatatactaaaaaatcgaatcagaattccgctatactttaaatctttaaaaacgtctaagtaa；
54.h240r基因的氨基酸序列如seq id no.3所示：
55.maaniiatravpkmaskkehqyclldsqekrhghypfsfelkpygqtganiigvqgslthvikmtvfpfmipfplqkthiddfiggriylffkeldmqavsdvngmqyhfefkvvpvspnqvellpvnnkykftyaipvvqyltpifydlsgpldfpldtlsvhvdilsnhiqlpiqnhnlttgdrvfisgykhlqtielcknnkifiknipplssekiklyilknririplyfkslktsk；
56.mgf505-7r基因的核苷酸序列如seq id no.2所示：
57.atgttctcccttcaggacctctgtcggaagaacaccttcttccttccaagtgattttagcaagcataccctgcatttgctggggttatactggaaggggcatggatctatccaaaggataaagaatgatggtgtgcttatagagcatgatcttactctttccatcaatgaagccttaattcttgcaggagaagagggaaacaatgaagtagtaaagctcttgttactatgggaaggaaatcttcattatgccatcataggagctttgaggactgagaactataacctagtatgtgagtaccatagtcaaattcaggactggcatgttctcctccctttgattcaagatccagaaacattcgaaaaatgtcatgatttaagccttgaatgtgatctttcatgccttctccaacatgctgtaaaatataacatgctttcgattcttgttaaatataaagaggatctactaaatgtactatttaggcaacaaattcaaggactatttattttagcatgtgaaaatcggaagcttgagattcttacgtggatgggtcaaaatctgccaattcctgatcctgagcctatttttagcattgctgttgtcacaaaagatttagaaatgttttccttagggtacaagattgtttttgaatacatggaaaaccaaggacttcatttaacccaggtagttcgtatggttatgctaaatcatcactttggcatggtaataaataaaggacttttaccctttgtgctggaaattttaaattatggtgggaatgtaaatagagccttatcttatgctgtcacacaaaataaaagaaagattttagaccatgttgttcgccaaaagaatataccccataaaaccattgaaagaatgttgcatctggctgtaaaaaagcatgctcccaggaaaactctgaacttgttactatcttacataaattacaaggtgaaaaatgttaaaaagttgttagaacatgtagtgaaatacaactctactcttgtgataagactcttgttagaaaaaaagaaaaacctgctggatgctactttgacaagatatgtcaaagattctacatactttcaggtgaaagaatttatgcaagacttctccatcagcccagaaaaattcattaaaatagctgtgcgggaaaagagaaatgtgttgatcaagggtatttctgaagatatttgggaaaatcccgcggaaagaatcaggaatcttaagcagatagtgtgtaccataaaatatgaaagtggaagacaattcctgataaatatcattcacaccatttaccagagttattctttgaaacctgaagaaattcttaaattggcaacattttatgtcaaacacaatgcaaccacccattttaaagatctctgcaaatatctttggctgaacagaagaacagaaagtaagaaactgtttttagagtgcttggaaattgctgataagaaggagtttcctgatattaaaagtattgtgagtgaatacattaactatttgtttactgcaggagctattaccaaggaagaaatcatgcaagcctatgctttggagtatgccatgtattaa；
58.mgf505-7r基因的氨基酸序列如seq id no.4所示：
59.mfslqdlcrkntfflpsdfskhtlhllglywkghgsiqrikndgvliehdltlsinealilageegnnevvkllllwegnlhyaiigalrtenynlvceyhsqiqdwhvllpliqdpetfekchdlslecdlscllqhavkynmlsilvkykedllnvlfrqqiqglfilacenrkleiltwmgqnlpipdpepifsiavvtkdlemfslgykivfeymenqglhltqvvrmvmlnhhfgmvinkgllpfvleilnyggnvnralsyavtqnkrkildhvvrqkniphktiermlhlavkkhaprktlnlllsyinykvknvkkllehvvkynstlvirlllekkknlldatltryvkdstyfqvkefmqdfsispekfikiavrekrnvlikgisediwenpaerirnlkqivctikyesgrqfliniihtiyqsyslkpeeilkla
tfyvkhnatthfkdlckylwlnrrteskklflecleiadkkefpdiksivseyinylftagaitkeeimqayaleyamy；
60.按照图3所示的asfv mgf505-7r基因缺失载体(表达红荧光)构建示意图构建asfv mgf505-7r基因缺失载体；
61.1.将mgf505-7r基因orf(ncbi登录号：mk333180.1)(相对于全长序列位置在第40763-42346位)左边约1000bp的基因组作为左同源臂序列(asfv基因组的5
’‑
ttaatttgggtagggaaa-3’序列左侧约1000bp)，mgf505-7r基因orf右边约1000bp的基因组作为右同源臂序列(asfv基因组的5
’‑
atttctgaatcagtaagcaa-3’序列右侧约1000bp)，左右同源臂用同源重组克隆试剂盒分别插入到p72-mcherry载体的xhoi和bamhi位点，构建成功的同源臂转移载体命名为p72-mcherry-mgf505-7r。采用kpni酶切质粒p72-mcherry-mgf505-7r，使其线性化后回收备用。
62.按照图4所示的asfv h240r基因缺失载体(表达绿荧光)构建示意图构建asfv h240r基因缺失载体；
63.2.将h240r基因orf(ncbi登录号：mk333180.1)(相对于全长序列位置在第155375-156100位)左边约1000bp的基因组作为左同源臂序列(asfv基因组的5
’‑
ttaaaccattgaattattta-3’序列左侧约1000bp)，h240r基因orf右边约1000bp的基因组作为右同源臂序列(asfv基因组的5
’‑
taacatttttatagtctact-3’序列右侧约1000bp)，左右同源臂用同源重组克隆试剂盒分别插入到p72-egfp载体的xhoi和bamhi位点，构建成功的同源臂转移载体命名为p72-egfp-h240r。采用kpni酶切质粒p72-egfp-h240r，使其线性化后回收备用。
64.3.将靶向mgf505-7r基因的sgrna(靶点序列为：5
’‑
gtataaccccagcaaatgca-3’，seq id no.5所示)和靶向h240r基因的sgrna(靶点序列为：5
’‑
gattggagaggatatccaca-3’，seq id no.6所示)分别插入到px330载体中，构建成功的载体命名为px330-sgmgf505-7r和px330-sgh240r。
65.实施例2.重组病毒asfv-δh240r-δ7r的构建及鉴定
66.1.将实施例1获得的线性化的p72-egfp-h240r载体和px330-sgh240r载体用转染试剂(x-treme gene hp)以1:1的比例共转染pams，12h后采用剂量为1moi的asfv/cn/hlj/18感染猪肺泡巨噬细胞(pams)，在24-36h后可观察到带有绿荧光的重组病毒，待细胞出现80％的病变时，置-20℃冰箱反复冻融3次，收集病毒液。
67.将收集的病毒液接种到新的pams上，2h后弃掉病毒液，在表面覆盖含有1％低熔点琼脂糖的1640培养液，48h后挑选含有绿荧光的噬斑，反复挑斑5-8次，直到获得纯的缺失h240r基因的重组病毒(asfv-δh240r)。
68.2.将实施例1获得的线性化的p72-mcherry-mgf505-7r和px330-sgmgf505-7r用转染试剂(x-treme gene hp)以1:1的比例共转染pams，12h后采用剂量为1moi的asfv-δh240r感染pams，在24-36h后可观察到带有红荧光的重组病毒，待细胞出现80％的病变时，置-20℃冰箱反复冻融3次，收集病毒液。
69.将收集的病毒液接种到新的pams上，2h后弃掉病毒液，在表面覆盖含有1％低熔点琼脂糖的1640培养液，48h后挑选含有红荧光的噬斑，反复挑斑5-8次，直到获得纯的缺失h240r基因和mgf505-7r基因的重组病毒(asfv-δh240r-δ7r)。
70.荧光显微镜下观察结果如图5所示，结果表明纯化的基因缺失重组病毒asfv-δh240r-δ7r在感染pams时同时表达红绿双荧光，这说明重组病毒构建成功。
71.病毒纯度检测：选取h240r-jd-o-f/r引物对(h240r-jd-o-f：gcaaacattattgcaacaag(seq id no.9)和h240r-jd-o-r：cagcctatttcggaactagg(seq id no.10))；7r-jd-o-f/r引物对(7r-jd-o-f：agagtagccatgtattaac(seq id no.11)和7r-jd-o-r：gaatatgctgtattaag(seq id no.12)进行纯净检测。用病毒基因组提取试剂盒(购自qiagen公司)提取重组病毒的基因组dna和亲本病毒dna，以此为模板，进行pcr扩增，结果如图6所示，如图6中的a所示，通过h240r基因两端的引物检测，重组病毒asfv-δh240r-δ7r病毒扩增片段为1048bp，呈现单一条带，与预期大小一致，而亲本毒株(asfv-wt)扩增片段为840bp；
72.采用mgf505-7r基因两端鉴定引物7r-jd-o-f/r，如图6中的b所示，重组病毒asfv-δh240r-δ7r病毒扩增片段为1122bp，呈现单一条带，与预期大小一致，而亲本毒株(asfv-wt)扩增片段为1770bp；扩增asfv-wt片段为1770bp，测序结果显示重组病毒asfv-δh240r-δ7r中h240r基因和mgf505-7r基因完全缺失，相应的位置被报告基因表达盒取代。结果表明成功构建缺失h240r和mgf505-7r基因重组病毒且无亲本病毒污染。
73.结果如图7所示，如图7中的(a)所示，荧光显微镜下观察重组病毒asfv-δh240r在感染pams时表达绿双荧光；通过h240r基因两端(h240r-jd-o-f/r)的引物检测，如图7中的(b)所示重组病毒asfv-δh240r病毒扩增片段为1048bp，呈现单一条带，与预期大小一致，而亲本毒株(asfv-wt)扩增片段为840bp，测序结果显示重组病毒asfv-δh240r中h240r基因完全缺失，相应的位置被报告基因表达盒取代。结果表明成功构建缺失h240r基因重组病毒asfv-δh240r且无亲本病毒污染。
74.实施例3.制备减毒疫苗
75.1.将重组病毒asfv-δh240r-δ7r作为疫苗。
76.2.以重组病毒asfv-δh240r-δ7r为基础毒株，突变cd2v基因、mgf家族基因减毒基因构建一种或多种基因缺失的病毒，作为疫苗。
77.利用以下实验验证实验效果：
78.一、病毒滴度的滴定
79.非洲猪瘟病毒的滴定采用半数血球吸附量(50％haemadsorption，had50)表示，根据参考文献(zhao d,liu r,zhang x,li f,wang j,zhang j,liu x,wang l,zhang j,wu x,guan y,chen w,wang x,he x,bu z.2019.replication and virulence in pigs of the first african swine fever virus isolated in china.emerg microbes infect 8:438-447.)进行操作，并作适当调整：在96孔细胞培养板中接种pbmc，将待检测样品进行10倍稀释，每孔接种0.02ml，病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的玫瑰花环进行判定，观察7天，根据reed and muench方法计算半数血球吸附量(had50)。重组病毒滴度测定合格，进行致病性评价。为了后面的致病性评价，测定滴度。
80.二、基因缺失毒株asfv-δh240r免疫试验
81.在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物安全四级实验室动物房中心进行毒力评价实验，采用7周龄大白和长白近交系spf猪(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物中心)，实验动物分为3组，其中基因缺失毒株asfv-δh240r组5头，asfv cn/hlj/18组4
头，对照猪4头。对照组是没有经过任何处理的猪，asfv cn/hlj/18组免疫剂量为103had
50
，asfv-δh240r组的免疫剂量为105had
50
。
82.免疫后持续观察动物的精神状态、采食情况，监测动物体温，采集口肛拭子、抗凝血和分离血清。参照文献(zhao d,liu r,zhang x,li f,wang j,zhang j,liu x,wang l,zhang j,wu x,guan y,chen w,wang x,he x,bu z.2019.replication and virulence in pigs of the first african swine fever virus isolated in china.emerg microbes infect 8:438-447.)，并通过定量pcr方法测定血液中asfv的含量。统计各组动物的存活率、体温变化及血液中asfv含量。
83.体温变化结果如图8所示，注射基因缺失毒株asfv-δh240r的猪在注射后第6天体温升高，第10天后体温恢复正常水平；而asfv cn/hlj/18组在注射后第3天体温升高，直至第10天全部死亡。
84.存活率结果如图9所示，注射基因缺失毒株asfv-δh240r的猪在注射后第17天有一头猪死亡，其余全部存活，存活率为80％；而asfv cn/hlj/18组在注射后第9天开始死亡，第10天全部死亡。
85.血液中的asfv基因组的含量检测结果如图10所示，注射基因缺失毒株asfv-δh240r的猪在注射后第4天检测到约106拷贝数的病毒dna，直至第28天；而asfv cn/hlj/18组在注射后第4天检测到约109拷贝数的病毒dna，直至全部死亡。
86.上述实验结果表明，基因缺失毒株asfv-δh240r显著致弱，但仍保留部分毒力。
87.三、基因缺失毒株asfv-δh240r-δ7r免疫试验
88.在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物安全四级实验室动物房中心进行毒力评价实验，采用7周龄大白和长白近交系spf猪(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物中心)，实验动物分为4组，免疫途径为肌肉注射，其中基因缺失毒株asfv-δh240r-δ7r组5头猪，基因缺失毒株asfv-δh240r-δ7r同居猪4头，asfv cn/hlj/18组4头，对照猪4头猪。对照猪是没有经过任何处理的猪，asfv cn/hlj/18组的免疫剂量为103had
50
，asfv-δh240r-δ7r组的免疫剂量为105had
50
，asfv-δh240r-δ7r同居猪是指跟asfv-δh240r-δ7r组同住一起但是不经过任何处理的猪。
89.免疫后持续观察动物的精神状态、采食情况，监测动物体温，采集口肛拭子、抗凝血和分离血清。参照文献(zhao d,liu r,zhang x,li f,wang j,zhang j,liu x,wang l,zhang j,wu x,guan y,chen w,wang x,he x,bu z.2019.replication and virulence in pigs of the first african swine fever virus isolated in china.emerg microbes infect 8:438-447.)，并通过定量pcr方法测定血液中asfv的含量。统计各组动物的存活率、体温变化及血液中asfv含量。
90.体温变化结果如图11所示，注射基因缺失毒株asfv-δh240r-δ7r的猪在注射后猪体温均为正常水平，没有体温升高现象；同居猪体温也为正常水平，没有体温升高现象；而asfv cn/hlj/18组在注射后第3天体温升高，直至第10天全部死亡。
91.存活率结果如图12所示，注射基因缺失毒株asfv-δh240r-δ7r的猪在注射后观察28天，所有猪没有临床症状，均为健康状态，存活率为100％；同居猪体征也为健康状态，存活率为100％；而asfv cn/hlj/18组在注射后第9天开始死亡，第10天全部死亡。
92.血液中的asfv基因组的含量检测结果如图13所示，注射基因缺失毒株asfv-δ
h240r-δ7r的猪在注射后第7天检测到极低的病毒基因组拷贝数，小于102的病毒dna，直至第28天；同居猪检测的的基因组拷贝数均小于10，直至第28天；而asfv cn/hlj/18组在注射后第4天检测到约109拷贝数的病毒dna，直至全部死亡。
93.血液中的asfv p30抗体检测结果如图14所示，注射基因缺失毒株asfv-δh240r-δ7r的猪在注射后第7天p30抗体升高，第11天抗体达到较高水平，直至第28天；同居猪没有检测到p30抗体，表明同居猪没有感染病毒。
94.上述实验结果表明，在亲本毒株asfv cn/hlj/18同时敲除h240r基因和mgf505-7r基因，是其编码的蛋白功能丧失后，获得的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株asfv-δh240r-δ7r的毒力完全致弱，未发生排毒现象，安全性较好。
95.四、动物攻毒实验
96.待免疫28天后，asfv-δh240r-δ7r免疫组和同居猪进行asfv强毒攻击，攻击剂量为10
2.5
had
50
，攻毒途径为肌肉注射。攻毒后，持续观察动物的精神状态、采食情况，监测动物体温，采集口肛拭子、抗凝血和分离血清。并通过定量pcr方法测定血液中asfv的含量。统计各组动物的存活率、体温变化及血液中asfv含量。asfv-δh240r-δ7r组的免疫剂量为105had
50
，asfv-δh240r-δ7r同居猪是指跟asfv-δh240r-δ7r组同住一起但是不经过任何处理的猪。
97.体温变化结果如图15所示，asfv-δh240r-δ7r免疫组进行asfv强毒攻击，攻毒后有1头猪在攻毒后第12天体温升高，第19天开始下降，其余4头猪体温均为正常水平；同居猪体温在攻毒后第4天显著升高，维持高温现象，直到第11天全部死亡。
98.存活率结果如图16所示，asfv-δh240r-δ7r免疫组进行asfv强毒攻击，攻毒后观察21天，所有猪均存活，存活率为100％；同居猪体温也为健康状态，存活率为100％；而同居猪攻毒后第10天开始死亡，第12天全部死亡，存活率为0。
99.血液中的asfv基因组的含量检测结果如图17所示，asfv-δh240r-δ7r免疫组进行asfv强毒攻击，攻毒后第1天至第7天检测到极低的病毒基因组拷贝数，小于102的病毒dna；第11天拷贝数开始上升，检测到病毒基因拷贝数猪维持在较低的水平，约为102至103之间；同居猪在攻毒后后第4天检测到约106拷贝数的病毒dna，直至全部死亡。
100.肺脏中干扰素检测结果如图18所示，asfv-δh240r-δ7r免疫组进行asfv强毒攻击，攻毒后第21天检测较高水平的ifn-β的转录，与同居猪相比差异极显著；同居猪在攻毒后后肺脏中检测到低水平的ifn-β的转录。
101.上述实验结果表明，在亲本毒株asfv cn/hlj/18同时敲除h240r基因和mgf505-7r基因，是其编码的蛋白功能丧失后，获得的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，asfv-δh240r-δ7r的毒力完全致弱，而且在亲本毒株asfv cn/hlj/18致死剂量攻击后，猪体温正常，猪存活率为100％。因此，本发明所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株asfv-δh240r-δ7r对亲本毒株asfv cn/hlj/18具有完全的免疫保护效果。

技术特征：

1.一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株，其特征在于，所述重组减毒株是以非洲猪瘟病毒株为出发菌株，通过联合丧失非洲猪瘟病毒中h240r基因和mgf505-7r基因编码蛋白的功能制备非洲猪瘟病毒重组减毒株。2.根据权利要求1所述的重组减毒株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒株为基因ii型非洲猪瘟病毒。3.根据权利要求2所述的重组减毒株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒株为pig/hlj/2018株。4.根据权利要求1所述的重组减毒株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒的h240r基因的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述非洲猪瘟病毒的mgf505-7r基因的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述非洲猪瘟病毒的h240r基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述非洲猪瘟病毒的mgf505-7r基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。5.一种制备减毒非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段突变非洲猪瘟病毒中的h240r基因和mgf505-7r基因。6.根据权利要求5所述的重组减毒株，其特征在于，所述基因工程手段包括基因缺失技术、基因突变技术、基因插入技术和基因编辑。7.一种非洲猪瘟的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求1-4任一项所述的重组减毒株。8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，以权利要求1-4任一项所述的重组减毒株为基础毒株，突变cd2v基因、mgf家族基因获得多基因缺失的病毒。9.根据权利要求7或8所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为二价疫苗或多价疫苗。10.权利要求1-4任一项所述的重组减毒株、权利要求5或6所述的方法在制备用于预防或非洲猪瘟的疫苗和药物中的应用。

技术总结

本发明公开一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株及其制备方法与应用，属于兽用生物制品领域技术领域，本发明的目的是为了提供了一种构建非洲猪瘟减毒株的策略。本发明提供一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株，所述重组减毒株是采用基因工程手段在非洲猪瘟病毒株Pig/CN/HLJ/2018中联合缺失了H240R基因和MGF505-7R基因编码蛋白的功能，获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选苗株。所述减毒候选疫苗株免疫猪后对猪完全致弱，且能够对Pig/CN/HLJ/2018强毒株攻毒提供100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。具有极大的社会价值。具有极大的社会价值。