一种海藻糖合酶突变体及其制备和应用的制作方法

1.本发明属于基因工程和酶工程技术领域，特别是涉及一种海藻糖合酶突变体及其制备和应用。

背景技术：

2.海藻糖由两个葡萄糖分子以α-1,1糖苷键连接而成，它是一种非还原性双糖，甜度约为蔗糖的45％，素有“生命之糖”的美誉，广泛存在于各种生物体中，包括细菌、酵母、真菌和藻类以及一些昆虫、无脊椎动物和植物中，尤其在酵母中含量较多，面包和啤酒等发酵食品及虾类等也含有海藻糖。
3.海藻糖的无还原性、高度安全性、自身结构的稳定性以及它对生物膜、蛋白质等生物大分子的非特异性保护作用，使海藻糖显示出广阔的应用前景，越来越受到研究者的关注。美国fda在2000年将海藻糖列为安全食品，随后2001年欧洲european regulation system也将海藻糖列为安全品，我国卫生部在2005年正式批准海藻糖为新资源食品。目前，海藻糖已经被广泛运用于食品、化妆品和医药行业。
4.海藻糖生产方法有酵母提取法、双酶法和单酶法。早期海藻糖是从酵母中提取的，这种工艺提取收率低，生产效率非常低下，导致海藻糖价格高达700美元/kg，目前该工艺路线已经被淘汰。1995年日本林原生化株式会社发明了双酶法(麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶)生产海藻糖，此工艺还需要添加普鲁兰酶和环糊精糖基转移酶，转化温度低，容易染菌，生产极其不稳定。单酶法以麦芽糖为底物，利用海藻糖合酶一步转化获得海藻糖，此工艺可以连续转化，工艺简单。单酶法工艺存在以下问题：海藻糖合酶30-50℃条件下，转化率高达71-80％，随着转化温度的升高，转化率呈下降趋势，60℃条件下转化率下降到66％。本行业技术人员可知，50℃以下酶转化，容易染菌，导致生产不稳定以及收率下降。因此对海藻糖合酶进行分子生物学改造，提高其高温条件下海藻糖的转化率，有利于提高单酶法生产海藻糖的效率和稳定性。

技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术第一个问题是：提供一种海藻糖合酶突变体，将海藻糖合酶亲本第160、192、216、228或234位氨基酸中的一个进行点突变得到的；
6.本发明所要解决的技术第二个问题是：提供一种海藻糖合酶突变体的制备方法，设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体，然后转化进宿主细胞得到；
7.本发明所要解决的技术第三个问题是：提供一种海藻糖合酶突变体在海藻糖生产中的应用。
8.为解决上述技术问题，本发明具体的技术方案是：
9.一种海藻糖合酶突变体，是将氨基酸序列为序列表seq no.1(ncbi登录号为baa19934.1)的海藻糖合酶分别在第160、192、216、228或234位氨基酸中进行一个点突变得
到的；其中，突变体r160l为第160位氨基酸由精氨酸(arg)变成异亮氨酸(leu)，突变体d192a为第192位氨基酸由天冬氨酸(asp)变成丙氨酸(ala)，突变体t216n为第216位氨基酸由苏氨酸(thr)变成天门冬酰胺(asn)，突变体e228v为第228位氨基酸由谷氨酸(glu)变成缬氨酸(val)，突变体g234d为第234位氨基酸由谷氨酸(gla)变成天冬氨酸(asp)。
10.一种海藻糖合酶突变体制备方法，包括以下步骤：
11.a.在海藻糖合酶亲本氨基酸序列(ncbi登录号为baa19934.1)的基础上确定第160、192、216、228或234位氨基酸为突变位点，并设计定点突变的突变引物：
12.引入r160l突变的定点突变引物为：
13.正向引物：5
’‑
aggcctactactggcacctcttctactggca-3’(下划线为突变碱基)
14.反向引物：5
’‑
ggctggtgccagtagaagaggcggtgccagt-3’(下划线为突变碱基)；
15.引入d192a突变的定点突变引物为：
16.正向引物：5
’‑
gggccgacctgggggtggccggcttccgcct-3’(下划线为突变碱基)
17.反向引物：5
’‑
gcgtccaggcggaagccggccacccccaggt-3’(下划线为突变碱基)；
18.引入t216n突变的定点突变引物为：
19.正向引物：5
’‑
gcgagaacctccccgagaacattgaggcggt-3’(下划线为突变碱基)
20.反向引物：5
’‑
cgcttcaccgcctcaatgttctcggggaggt-3’(下划线为突变碱基)；
21.引入e228v突变的定点突变引物为：
22.正向引物：5
’‑
gcctgaggaaggccctggtggagcgctacgg-3’(下划线为突变碱基)
23.反向引物：5
’‑
ccggggccgtagcgctccaccagggccttcc-3’(下划线为突变碱基)；
24.引入g234d突变的定点突变引物为：
25.正向引物：5
’‑
aggagcgctacggccccgtcaagatcctcct-3’(下划线为突变碱基)
26.反向引物：5
’‑
tcggcgaggaggatcttgacggggccgtagc-3’(下划线为突变碱基)；
27.b.以表达载体tres/pet-24a(+)为模板，以步骤a的引物分别进行的pcr扩增，并将pcr产物经dpnⅰ消化后分别转入质粒载体；
28.c.将步骤b得到的质粒载体分别转化进宿主细胞，得到海藻糖合酶突变体，分别为突变体r160l、突变体d192a、突变体t216n、突变体e228v和突变体g234d。
29.优选的，所述的步骤b中表达载体tres/pet-24a(+)是含有海藻糖合酶基因的质粒tres/pmd18t和pet24a(+)质粒分别进行ndei和ecori双酶切，酶切产物割胶回收海藻糖合酶基因片段后，再用t4连接酶连接到切开的pet24a(+)质粒上得到。
30.优选的，所述的步骤b中的质粒载体为puc系列、pet系列或pgex系列中的任意一种。
31.进一步的，所述的步骤b中的质粒载体为pet系列质粒载体。
32.优选的，所述的步骤c中宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。
33.进一步的，所述的步骤c中宿主细胞为革兰氏阳性菌细胞或革兰氏阴性菌细胞。
34.进一步的，所述的步骤c中宿主细胞为bl21(de3)。
35.一种海藻糖合酶突变体的应用：海藻糖合酶突变体在海藻糖生产的应用。
36.由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
37.本发明通过对海藻糖合酶基因的点突变，并经转化表达后得到含有热稳定性提高的海藻糖合酶的突变体，将这些突变体用于生产海藻糖，于60℃条件下，突变体r160l、
d192a、t216n、e228v、g234d生产海藻糖的转化率分别达到76.6％、71.5％、69.4％、79.3％、76.1％，而野生型海藻糖合酶转化率仅为66.3％。因此具有很好的工业化前景。
具体实施方式
38.下面结合实施例，进一步阐述本发明。
39.下述实施例中涉及的检测方法如下：
40.海藻糖高效谱液相检测条件为：示差折光检测器，nh2柱(aps-2hypersil，thermo scientific)，流动相(水:乙腈＝1:4)，流速：0.8ml/min，柱温：40℃；
41.海藻糖酶活检测：将5ml稀释适当倍数的酶液与5ml用20mmol/lph 6.0磷酸缓冲液配制的20％(w/v)麦芽糖溶液混匀，预热10min，加入酶液，30℃反应30min，迅速取出沸水浴15min灭酶终止反应，通过hplc检测反应液中各组分的含量。
42.酶活单位定义：在上述反应条件下，1min生成1μmol海藻糖所需的酶量定义为1个酶活力单位。
43.实施例一：tres/pet24a(+)质粒的构建
44.将pet24a(+)质粒和含有海藻糖合酶基因(tres基因)的质粒tres/pmd 18t分别进行ndei和ecori双酶切，酶切产物割胶回收海藻糖合酶基因片段，再用t4连接酶连接到切开的pet24a(+)质粒上，连接产物转化e.colijm109感受态细胞，经37℃培养培养8h，挑转化子在含有30mg/l卡那霉素液体的lb培养基中震荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒tres/pet24a(+)。
45.实施例二：野生型海藻糖合酶的表达
46.将实施例一得到质粒tres/pet24a(+)转化e.coli bl21(de3)宿主菌，涂布到含卡那霉素(30mg/l)的lb平板，37℃培养8h，命名为tres/pet24a(+)/e.coli bl21(de3)。挑单菌落到含有30mg/l卡那霉素液体lb培养基中，37℃培养过夜，保存甘油管。
47.从保藏的甘油管中，接种tres/pet24a/bl21(de3)于lb液体培养基(含100mg/l卡那霉素)生长8h，按5％接种量将种子接入tb液体发酵培养基(含100mg/l卡那霉素)。大肠杆菌在37℃培养2h后，加入0.01mmol/l终浓度的iptg(异丙基硫代-β-d半乳糖苷)进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵24h后，将25ml发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用20mmol/l ph6.0 na2hpo
4-nah2po4缓冲液重新悬浮，混匀。用超声波细胞粉碎机破碎菌体的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3s，工作功率为20％)，破碎后得到粗酶液。
48.实施例三：海藻糖合酶突变体的制备
49.根据thermus thermophilus atcc33923海藻糖合酶的基因序列，分别设计并合成引入r160l、d192a、t216n、e228v、g234d突变的引物，对麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因tres进行定点突变：
50.引入r160l突变的定点突变引物为：
51.正向引物：5
’‑
aggcctactactggcacctcttctactggca-3’(下划线为突变碱基)
52.反向引物：5
’‑
ggctggtgccagtagaagaggcggtgccagt-3’(下划线为突变碱基)
53.引入d192a突变的定点突变引物为：
54.正向引物：5
’‑
gggccgacctgggggtggccggcttccgcct-3’(下划线为突变碱基)
55.反向引物：5
’‑
gcgtccaggcggaagccggccacccccaggt-3’(下划线为突变碱基)
56.引入t216n突变的定点突变引物为：
57.正向引物：5
’‑
gcgagaacctccccgagaacattgaggcggt-3’(下划线为突变碱基)
58.反向引物：5
’‑
cgcttcaccgcctcaatgttctcggggaggt-3’(下划线为突变碱基)
59.引入e228v突变的定点突变引物为：
60.正向引物：5
’‑
gcctgaggaaggccctggtggagcgctacgg-3’(下划线为突变碱基)
61.反向引物：5
’‑
ccggggccgtagcgctccaccagggccttcc-3’(下划线为突变碱基)
62.引入g234d突变的定点突变引物为：
63.正向引物：5
’‑
aggagcgctacggccccgtcaagatcctcct-3’(下划线为突变碱基)
64.反向引物：5
’‑
tcggcgaggaggatcttgacggggccgtagc-3’(下划线为突变碱基)
65.以实施例一得到的携带编码野生型海藻糖合酶基因的表达载体tres/pet-24a(+)为模板，利用快速pcr技术分别对上述定点突变体编码基因的pcr扩增：pcr反应体系均为：5
×
ps buffer 10μl，dntps mix(2.5mm)4μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna 1μl，primerstar hs(5u/μl)0.5μl，加入双蒸水至50μl。
66.pcr扩增条件均为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，60℃5s，72℃8.5min)；72℃继续延伸10min，4℃保温。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
67.菌株构建：pcr产物经限制性核酸内切酶dpnⅰ消化，连接到同样由dpnⅰ切割的质粒上，然后转化大肠杆菌jm109感受态，感受态细胞在lb固体培养基(含30μg/ml卡那霉素)培养过夜后，挑克隆于lb液体培养基(含30μg/ml卡那霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，最终得到能够表达突变体r160l、突变体d192a、突变体t216n、突变体e228v、突变体g234d的重组菌株。
68.实施例四：海藻糖合酶突变体的表达
69.将突变体r160l、突变体d192a、突变体t216n、突变体e228v、突变体g234d分别接种于lb液体培养基(含100mg/l卡那霉素)生长8h，按5％接种量将上述突变体分别接入到tb液体发酵培养基(含100mg/l卡那霉素)进行培养；在37℃培养2h后，分别加入0.01mmol/l终浓度的iptg(异丙基硫代-β-d半乳糖苷)进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵24h后，将25ml发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用20mmol/l ph6.0 na2hpo
4-nah2po4缓冲液重新悬浮，混匀。然后用超声波细胞粉碎机破碎菌体的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3s，工作功率为20％)，破碎后得到粗酶液。
70.实验例：转化产海藻糖能力
71.用50mmol/l ph 6.0磷酸缓冲液配制的20％(w/v)麦芽糖溶液，取200ml加入具塞三角瓶中，分别取实施例二得到的野生型海藻糖合酶粗酶液、实施例四得到的突变体r160l、突变体d192a、突变体t216n、突变体e228v、突变体g234d粗酶液0.5ml(根据发酵酶活确定添加量，添加量2.5u/g麦芽糖)体积，置于水浴摇床中，反应48h。反应结束，取样煮沸10min灭酶，hplc检测海藻糖含量，检测结果见表1。
72.表1不同温度条件下野生酶及突变体生产海藻糖的转化率(％)
[0073][0074]
结果如表1所示，与野生酶相比，在60℃下突变体海藻糖转化率显著提高。因此突变体可实现高温条件下海藻糖生产的转化率的提高；并且因为高温条件下生产过程不易染菌，所以具有良好的工业应用前景。
[0075]
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.一种海藻糖合酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列为序列表seq no.1的海藻糖合酶分别在第160、192、216、228或234位氨基酸中进行一个点突变得到的；其中，突变体r160l为第160位氨基酸由精氨酸变成异亮氨酸，突变体d192a为第192位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸，突变体t216n为第216位氨基酸由苏氨酸变成天门冬酰胺，突变体e228v为第228位氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸，突变体g234d为第234位氨基酸由谷氨酸变成天冬氨酸。2.如权利要求1所述的海藻糖合酶突变体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：a.在序列表seq no.1海藻糖合酶氨基酸序列的基础上确定第160、192、216、228或234位氨基酸为突变位点，并设计定点突变的突变引物：引入r160l突变的定点突变引物为：正向引物：5
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aggcctactactggcacctcttctactggca-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5
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ggctggtgccagtagaagaggcggtgccagt-3’(下划线为突变碱基)；引入d192a突变的定点突变引物为：正向引物：5
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gggccgacctgggggtggccggcttccgcct-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5
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gcgtccaggcggaagccggccacccccaggt-3’(下划线为突变碱基)；引入t216n突变的定点突变引物为：正向引物：5
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gcgagaacctccccgagaacattgaggcggt-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5
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cgcttcaccgcctcaatgttctcggggaggt-3’(下划线为突变碱基)；引入e228v突变的定点突变引物为：正向引物：5
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gcctgaggaaggccctggtggagcgctacgg-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5
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ccggggccgtagcgctccaccagggccttcc-3’(下划线为突变碱基)；引入g234d突变的定点突变引物为：正向引物：5
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aggagcgctacggccccgtcaagatcctcct-3’(下划线为突变碱基)反向引物：5
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tcggcgaggaggatcttgacggggccgtagc-3’(下划线为突变碱基)；b.以表达载体tres/pet-24a(+)为模板，以步骤a的引物分别进行的pcr扩增，并将pcr产物经dpnⅰ消化后分别转入质粒载体；c.将步骤b得到的质粒载体分别转化进宿主细胞，得到海藻糖合酶突变体，分别为突变体r160l、突变体d192a、突变体t216n、突变体e228v和突变体g234d。3.如权利要求2所述的海藻糖合酶突变体制备方法，其特征在于：所述步骤b中表达载体tres/pet-24a(+)是含有海藻糖合酶基因的质粒tres/pmd18t和pet24a(+)质粒分别进行ndei和ecori双酶切，酶切产物割胶回收海藻糖合酶基因片段后，再用t4连接酶连接到切开的pet24a(+)质粒上得到。4.如权利要求2所述的海藻糖合酶突变体制备方法，其特征在于：所述步骤b中的质粒载体为puc系列、pet系列或pgex系列中的任意一种。5.如权利要求4所述的海藻糖合酶突变体制备方法，其特征在于：所述步骤b中的质粒载体为pet系列质粒载体。6.如权利要求2所述的海藻糖合酶突变体制备方法，其特征在于：所述步骤c中宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。7.如权利要求6所述的海藻糖合酶突变体制备方法，其特征在于：所述步骤c中宿主细胞为革兰氏阳性菌细胞或革兰氏阴性菌细胞。
8.如权利要求7所述的海藻糖合酶突变体制备方法，其特征在于：所述步骤c中宿主细胞为bl21(de3)。9.如权利要求1所述的海藻糖合酶突变体的应用，其特征在于：所述海藻糖合酶突变体在海藻糖生产的应用。

技术总结

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，公开了一种海藻糖合酶突变体,该海藻糖合酶突变体是将海藻糖合酶亲本第160、192、216、228或234位氨基酸中的一个进行点突变得到的；具体是通过设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体，然后转化进宿主细胞得到；该海藻糖合酶突变体应用于海藻糖的生产。本发明海藻糖合酶突变体含有热稳定性提高的海藻糖合酶，用于生产海藻糖具有很好的工业化前景。景。