一种防治中药材根腐病的纤维素链霉菌LQS-2、菌剂及应用

一种防治中药材根腐病的纤维素链霉菌lqs-2、菌剂及应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种防治中药材根腐病的纤维素链霉菌(streptomyces cellulosae)lqs-2、菌剂及应用。

背景技术：

2.枸杞、板蓝根、甘草、黄芪、党参和银柴胡等大宗中药材，既可以为农民致富增收，也有利于当地的生态环境。根腐病是发生于中药材栽植区的一种常见土传病害，由多种致病菌复合侵染引起，主要包括镰刀菌(fusarium)和链格孢菌(alternaria)等，严重制约了道地药材产业可持续发展，素有“植物癌症”之称。枸杞根腐病导致每年枯死的枸杞树达5％，病株率15％，严重地区的病株率37.6％，枯死株率达到26.5％；在低洼排水不良的地块，黄芪根腐病发病率为32％～41％，重病田达55％；板蓝根根腐病发病轻的药材区减产11.2％～21.6％，发病较重的减产35％以上，严重年份减产50％；银柴胡根腐病田间发病率在15％～30％，严重地块高达60％以上。
3.中药材发生根腐病后，其根部细胞和维管束组织受到破坏，植株无法从土壤中吸收水分和营养物质，致使地上部黄化、枯死，严重影响产量和品质。根腐病还会导致中药材根系化感自毒物质增加，根际微生态环境失去平衡，土壤养分和土壤酶活性降低，进而增加连作障碍危害，已成为制约中药材产业可持续发展的瓶颈问题。种植抗病品种和化学农药是防治中药材根腐病的最主要措施，由于抗病品种选育周期较长，化学农药的残留对生态环境和人类健康构成威胁。因此，探索环境友好、高效的中药材根腐病生物防控技术对于中药材产业高质量发展具有重要科学价值。
4.放线菌(streptomyces)作为一种重要的具生物研究价值的微生物资源，70％～80％的放线菌均能产生抗生素类物质，具有较好的生物防治效果，尤其是极端环境中的放线菌资源，由于其长期生长在极端环境，具有独特的基因类型和生理机制，其代谢产生的活性物质相较于其他普通环境更具有生防优势。纤维素链霉菌(streptomyces cellulosae)作为放线菌中的一种微生物，具有无污染、防病和促生效果显著，常常被用于植物病害的生物防治。但是目前可以促进根茎类中药材生长和根腐病防治的链霉菌剂较少，有必要开展适用于中药材生长和根腐病防治的纤维素链霉菌研究。

技术实现要素：

5.为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一种防治中药材根腐病的纤维素链霉菌lqs-2、菌剂及应用，对纤维素链霉菌lqs-2及其菌剂对促进中药材生长和防治中药材根腐病有良好的效果。
6.根据本发明的第一个方面，提供了一株纤维素链霉菌lqs-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为cgmcc no.25508。
7.根据本发明的第二个方面，提供了一种菌剂，包含本发明的第一个方面所述的纤
维素链霉菌lqs-2。
8.可选择地，所述菌剂为所述纤维素链霉菌lqs-2的培养液或所述纤维素链霉菌lqs-2的发酵液。
9.可选择地，所述菌剂为以下任一种菌剂：
10.用于促进中药材生长和防治中药材根腐病的菌剂；
11.或，用于促进中药材生长的菌剂；
12.或，用于防治中药材根腐病的菌剂。
13.可选择地，所述中药材为根茎类中药材。
14.根据本发明的第三个方面，提供了一种如本发明的第一个方面所述的纤维素链霉菌lqs-2或如本发明的第二个方面所述的菌剂在促进中药材生长中的应用。
15.根据本发明的第四个方面，提供了一种如本发明的第一个方面所述的纤维素链霉菌lqs-2或如本发明的第二个方面所述的菌剂在防治中药材根腐病中的应用。
16.根据本发明的第五个方面，提供了一种中药材的培育方法，包括将本发明的第一个方面所述的纤维素链霉菌lqs-2或本发明的第二个方面所述的菌剂施用于中药材。
17.可选择地，所述中药材为根茎类中药材。
18.本发明的有益效果如下：本发明的纤维素链霉菌lqs-2及其菌剂对促进中药材的生长具有良好效果，能够促进中药材的株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量的增长；本发明的纤维素链霉菌lqs-2及其菌剂对中药材根腐病具有良好的防效。
19.保藏信息
20.本发明分离鉴定的链霉菌(streptomyces)，命名为纤维素链霉菌(streptomyces cellulosae)lqs-2，己于2022年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为cgmcc no.25508。
附图说明
21.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
22.图1是纤维素链霉菌lqs-2在无氮培养基上的菌落形态图片。
23.图2是纤维素链霉菌lqs-2基于16s rdna测序的系统发育进化树。
24.图3是纤维素链霉菌lqs-2菌株与尖孢镰孢菌295的拮抗作用的图片。
25.图4是纤维素链霉lqs-2发酵液与镰孢菌的拮抗作用的图片。
26.图5是纤维素链霉菌lqs-2无菌上清液与镰孢菌的拮抗作用的图片。
27.图6是纤维素链霉菌lqs-2促进中药材生长的图片。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况
下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
29.根据一示例性实施例，本实施例提供了一株纤维素链霉菌lqs-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为cgmcc no.25508。
30.根据一示例性实施例，本实施例提供了一种菌剂，包含上述实施例中的纤维素链霉菌lqs-2。
31.其中，菌剂为纤维素链霉菌lqs-2的培养液或纤维素链霉菌lqs-2的发酵液。
32.其中，菌剂为以下任一种菌剂：用于促进中药材生长和防治中药材根腐病的菌剂；或，用于促进中药材生长的菌剂；或，用于防治中药材根腐病的菌剂。
33.其中，中药材为根茎类中药材。
34.根据一示例性实施例，本实施例提供了一种纤维素链霉菌lqs-2或其菌剂在促进中药材生长中的应用。
35.根据一示例性实施例，本实施例提供了一种纤维素链霉菌lqs-2或其菌剂在防治中药材根腐病中的应用。
36.根据一示例性实施例，本实施例提供了一种中药材的培育方法，包括将上述实施例中的纤维素链霉菌lqs-2或其菌剂施用于中药材。
37.具体的，中药材为根茎类中药材。
38.下面详细说明本发明的纤维素链霉菌lqs-2及其菌剂。
39.实施例1纤维素链霉菌lqs-2菌株的分离纯化
40.纤维素链霉菌lqs-2菌株的分离：选取2年生黄芪，于7～8月份进行样品采集，采集生长健壮的根际土壤，采样深度15cm～20cm，装入样品袋中封口、编号，低温(4℃)保存备用。称取新鲜土样1g，振荡制成10-2
菌悬液，梯度稀释成10-4
、10-5
、10-6
三个稀释度，将各梯度菌液于无氮固体培养基上涂布，28℃培养5d，选择分离较好的典型单一菌落反复划线纯化至纯种，摇菌富集培养，将富集培养的菌液与终浓度40％的甘油混合，超低温(-80℃)保存备用。
41.无氮液体培养基：葡萄糖10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso
4 0.1g，caco
3 5g，双蒸水1000ml，ph值为7.0；固体培养基加2％的琼脂粉，半固体培养基加0.5％琼脂粉。
42.发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期2022年8月8日，保藏编号为cgmcc no.25508。
43.实施例2纤维素链霉菌lqs-2菌株的鉴定
44.形态学鉴定依据《常见细菌系统鉴定手册》，结果见图1。结合分子生物学技术16s rdna测序对筛选出的拮抗菌进行种类鉴定，纤维素链霉菌lqs-2菌株鉴定为纤维素链霉菌(s.cellulosae)，结果见图2。
45.如图1所示，纤维素链霉菌lqs-2在无氮培养基平板上的菌落形态：菌落球形、卵圆形，表面光滑。培养初期菌落白，后期呈现黄柠檬，素渗透后呈现暗红。
46.实施例3镰孢菌拮抗菌的筛选
47.菌株的拮抗作用：在pda培养基平板上中央放置尖孢镰孢菌(fusarium oxysporum)295、轮枝镰孢菌(f.verticilliodes)173、茄病镰孢菌(f.solani)n18-1-2和串
珠镰孢菌(f.moniliforme)n19-2-2的菌饼，分别在病原菌菌落边缘两侧相距2cm处接种待测菌株菌饼(5mm)，置于培养箱28℃黑暗培养，4次重复。5天后测量病原菌菌落直径和抑菌带，计算相对菌丝抑菌率，结果见表1和图3。
48.发酵液的拮抗作用：在马铃薯琼脂平板培养基上中央放置尖孢镰孢菌、轮枝镰孢菌、串珠镰刀菌和茄病镰刀菌的菌饼(1cm)，菌饼两侧相距2cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入纤维素链霉菌lqs-2发酵液作对峙培养，以无菌lb液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图4。
49.无菌上清液的拮抗作用：将无菌上清液按照1:30比例与灭菌并冷却至50℃的pda培养基混匀，制成带有无菌上清液平板，待平皿凝固后，在带有无菌上清液平板中央放置病原菌菌饼(1cm)，然后培养皿置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图5。
50.液体菌剂制备：将纤维素链霉菌lqs-2接种于无氮液体培养基中，28℃、180rpm/min培养4d。
51.代谢产物(无菌上清液)制备：将已活化48h的供试菌株lqs-2单菌落分别接种至无氮液体培养基中，30℃、180rpm/min振荡培养96h后，发酵培养液在4℃、10000rpm/min离心20min去除沉淀物，上清液经过滤(0.22μm)除菌，即得无菌上清液。
52.相对抑菌率(％)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径
×
100％。
53.表1 lqs-2对3种镰刀菌的拮抗作用
[0054][0055]
实施例4纤维素链霉菌lqs-2菌株在温室条件下对中药材的促生试验
[0056]
种子处理：将黄芪、黄芩、银柴胡种子丹置于1％的次氯酸钠溶液中表面消毒30min，然后用无菌水冲去种子表面残留的次氯酸钠，在超净工作台上吹干表面水分。
[0057]
温室促生试验：将表面消毒后的中药材种子浸泡在纤维素链霉菌lqs-2培养液中28℃催芽48h，空白对照组浸泡在无菌水中。温室种植黄芪、黄芩和银柴胡，每个处理50g种子，种植面积约20m2。微生物菌剂ck和噁霉灵可湿性粉剂的处理方法与供试菌株相同。空白对照不施用药剂。试验设计包括：
⑴
空白对照ck：
⑵
纤维素链霉菌lqs-2发酵液；
⑶
噁霉灵可湿性粉剂yck；
⑷
微生物菌剂对照mck。种植30d调查黄芪、黄芩和银柴胡的生长情况，测量株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量，结果见表2、表3和表4。
[0058]
表2 lqs-2在温室条件下对黄芪的促生效果
[0059]
处理株高cm根长cm生物量g地上部生物量g地下部生物量gck5.336.070.150.110.02yck8.988.770.250.150.03mck8.766.520.250.140.03lqs-28.678.970.300.130.04
[0060]
表3 lqs-2在温室条件下对黄芩的促生效果
[0061]
处理株高cm根长cm生物量g地上部生物量g地下部生物量gck4.273.200.080.090.01yck5.494.040.150.110.02mck4.965.090.120.110.02lqs-25.255.440.130.090.02
[0062]
表4 lqs-2在温室条件下对银柴胡的促生效果
[0063]
处理株高cm根长cm生物量g地上部生物量g地下部生物量gck4.783.880.150.160.01mck5.215.860.220.170.03lqs-25.246.410.200.160.04
[0064]
噁霉灵可湿性粉剂yck催芽的银柴胡种子在培育过程中枯死，因此，表4中没有yck对银柴胡的促生数据。
[0065]
实施例5纤维素链霉菌lqs-2菌株在大田条件下对中药材的促生试验
[0066]
田间试验地点在宁夏隆德县葆易圣药业有限公司黄芪育苗基地，试验设计3组处理：ck为清水对照；b为纤维素链霉菌lqs-2发酵液；mck为抗重茬微生态制剂[中农绿康(北京)生物技术有限公司]。每组处理试验面积约30m2，药剂量约20l。2022年7月24日、7月30日和8月7日进行纤维素链霉菌lqs-2发酵液灌根，9月5日采样调查根长、株高、地下部生物量，结果见表5。
[0067]
表5lqs-2在大田条件下对黄芪的促生效果
[0068]
处理根长cm根粗cm鲜重g干重gck26.290.312.672.14mck26.630.475.863.67lqs-223.780.413.792.49
[0069]
实施例6纤维素链霉菌lqs-2对黄芪根腐病的田间防效
[0070]
田间试验地点在宁夏隆德县葆易圣药业有限公司黄芪育苗基地，试验设计3组处理：ck为清水对照；b为纤维素链霉菌lqs-2发酵液；mck为抗重茬微生态制剂[中农绿康(北京)生物技术有限公司]。每组处理试验面积约30m2，药剂量约20l。2022年7月24日、7月30日和8月7日进行纤维素链霉菌lqs-2发酵液灌根，9月5日采样调查根腐病的危害状况，调查标准见表6；计算病情指数和防治效果，结果见表7。
[0071]
表6根茎类中药材根腐病严重度分级标准表
[0072]
级别发病程度代表数值1不发病02病斑面积占根表面积1％～5％13病斑面积占根表面积6％～10％24病斑面积占根表面积11％～20％35病斑面积占根表面积21％～40％46病斑面积占根表面积41％～60％5
7病斑面积占根表面积61％～80％68病斑面积占根表面积80％以上7
[0073]
计算公式：防效(％)＝[(空白对照区病株率－处理区病株率)/空白对照区发病率]
×
100；发病率(％)＝[σ(每个病级的植株数
×
相对级数值)/(调查总植株数
×
最高级数值)]
×
100。
[0074]
表7lqs-2对黄芪根腐病的田间防效
[0075]
处理发病率/％病情指数防效/％lqs-264.2910.8639.98mck75.0010.1243.65ck97.0617.96/
[0076]
实施例7纤维素链霉菌lqs-2的固氮、溶磷和解钾效能测试
[0077]
纤维素链霉菌lqs-2菌株在lb平板上活化后，接种于液体lb培养基中(装液量：50ml/150ml三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养36h
–
48h后，取1ml浓度为108cfu/ml的菌液接入液体nfm培养液中，每个菌株3个重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min培养7d后，采用凯氏定氮法测定各培养液固氮率，结果见表8。
[0078]
纤维素链霉菌lqs-2菌株在lb平板上活化后接入于液体lb培养基中(装液量：50ml/150ml三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养4d后，取1ml浓度为108cfu/ml的菌液接入液体pko无机磷、蒙金娜有机磷培养液中，每菌株3重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min摇床培养10d后，采用钼锑抗比法测定溶磷率，结果见表8。
[0079]
纤维素链霉菌lqs-2在菌株lb平板上活化后，接种于液体lb培养基中(装液量：50ml/150ml三角瓶)，30℃、180r/min摇床培养36h
–
48h后，取1ml浓度为108cfu/ml的菌液接入液体钾长石培养液中，每个菌株3个重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、180r/min培养7d后，采用火焰原子吸收光谱法测定各培养液的解钾率，结果见表8。
[0080]
表8 lqs-2的固氮、溶磷和解钾效能
[0081]
菌株编号固氮率/％溶磷率/％解钾率/％lqs-20.017
±
.010.0120.008
[0082]
需要说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
…”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0083]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：

1.一株纤维素链霉菌(streptomyces cellulosae)lqs-2，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为cgmcc no.25508。2.一种菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的纤维素链霉菌lqs-2。3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为所述纤维素链霉菌lqs-2的培养液或所述纤维素链霉菌lqs-2的发酵液。4.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为以下任一种菌剂：用于促进中药材生长和防治中药材根腐病的菌剂；或，用于促进中药材生长的菌剂；或，用于防治中药材根腐病的菌剂。5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述中药材为根茎类中药材。6.如权利要求1所述的纤维素链霉菌lqs-2或如权利要求2所述的菌剂在促进中药材生长中的应用。7.如权利要求1所述的纤维素链霉菌lqs-2或如权利要求2所述的菌剂在防治中药材根腐病中的应用。8.一种中药材的培育方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的纤维素链霉菌lqs-2或如权利要求2所述的菌剂施用于中药材。9.如权利要求8所述的中药材的培育的方法，其特征在于，所述中药材为根茎类中药材。

技术总结

本发明公开了一种防治中药材根腐病的纤维素链霉菌(Streptomyces cellulosae)LQS-2、菌剂及应用，属于微生物技术领域。本发明的纤维素链霉菌(Streptomycescellulosae)LQS-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2022年8月8日，保藏编号为CGMCCNO.25508。本发明提供的纤维素链霉菌(Streptomycescellulosae)LQS-2对促进中药材的生长具有良好效果，能够促进中药材的株高、根长、生物量、地上部生物量和地下部生物量的增长；同时，本发明的纤维素链霉菌LQS-2对中药材根腐病具有良好的防效。中药材根腐病具有良好的防效。中药材根腐病具有良好的防效。