一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法与流程

1.本发明属于卡拉胶低聚糖制备领域，尤其涉及一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法。

背景技术：

2.卡拉胶(carrageenan)是由β-1，3-d-半乳糖和α-1，4-d-半乳糖为基本构架交替连接形成的一种亲水性硫酸海藻多糖，主要从海藻细胞壁中提取得到。根据是否含有3，6-内醚半乳糖及硫酸根含量的不同，工业上主要将卡拉胶分为κ-，ι-，λ-三种类型。卡拉胶低聚糖是卡拉胶降解后得到的产物,具有抗氧化，抗肿瘤，抗病毒，抗凝血，抑制血管生成等广泛的生物活性，在功能性食品和医药行业具有极大的开发应用潜能。
3.硒是生命活动的必需元素，在人类防癌、抗癌、延缓衰老、提高机体免疫力、预防心血管疾病、克山病和大骨节病等方面都发挥了重要作用。硒的存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠等，其活性和毒性范围较窄，生理活性低、毒性大，并具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制。而有机硒具有毒性低、副作用小的特性，能够更好地发挥硒的多种生理活性。有机硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有有机硒的多种活性，而且还具有多糖的各种生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，也更利于被机体吸收利用。
4.硒化卡拉胶低聚糖是以海洋藻类提取的天然硫酸脂多糖做母体，采用精确的分子对接技术，使微量元素硒与活性多糖在分子状态结合的一种新型的有机硒化合物，具有集活性多糖和人体必须的微量元素硒于一身的诸多生理功能。近十多年来，国内外许多科学家对开发有机硒以取代无机硒做了大量有益的工作，如今生产有机硒酵母、硒化卡拉胶低聚糖、硒蛋白等。但是酵母硒、硒蛋白在有机硒含量、生物活性、适应性等方面与硒化卡拉胶低聚糖相比存在许多不足。硒化卡拉胶低聚糖属于多糖类有机硒营养强化剂，其分子由多个糖环片段构成，分子量小。硒化卡拉胶低聚糖的分子结构特性决定了它易溶于水的性质，其溶解度在90％以上，这就大大方便了硒化卡拉胶低聚糖的使用，扩大了其应用范围，可广泛用于药品、保健品和食品中。
5.将卡拉胶制备成硒化卡拉胶低聚糖的方法目前主要有两条路线：第一种是卡拉胶先进行降解，得到卡拉胶低聚糖后与亚硒酸钠反应生成硒化卡拉胶低聚糖粗品，经纯化、干燥得到硒化卡拉胶低聚糖；第二种是卡拉胶先与亚硒酸钠反应生成硒化卡拉胶低聚糖粗品，经纯化、干燥得到硒化卡拉胶低聚糖。第一种路线卡拉胶低聚糖可通过化学法和酶解法制备，酶解法是以利用某些酶特异地开裂、改变分子结构的方式达到降解目的，由于在整个降解过程中无其他反应副产物生成而成为目前比较多用的方法，但由于卡拉胶无特异性酶，酶解用酶需要进行大量筛选比较。第一种路线用卡拉胶低聚糖与亚硒酸钠反应可用更温和的反应条件且收率高于卡拉胶与亚硒酸钠直接反应。第二种路线只能用化学法制备，反应过程不好控制且容易生成单糖等反应副产物，最终影响产品纯度，且降解得到的硒化卡拉胶低聚糖产品稳定性较差，易被过氧化氢破坏其分子结构，进一步导致产品收率及纯
度降低。

技术实现要素：

6.针对上述技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，以简化硒化卡拉胶低聚糖的制备方法，提高制备效率和收率，同时降低制备成本。
7.为了达到上述目的，本发明采取的技术方案如下：
8.一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，包括如下步骤：
9.s1、固定化酶处理：将质量分数1％壳聚糖溶解于体积分数2％乙酸水溶液中，取部分壳聚糖溶液逐滴加入质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合溶液中，在恒温4℃的环境下过夜，然后加入适量体积分数5％戊二醛水溶液搅拌充分后静置4h，水洗过滤加入半纤维素酶酶液和酸性木聚糖酶混合酶液搅拌均匀，4℃过夜后加入硅藻土吸附3h，水洗过滤即得固定化酶；
10.s2、卡拉胶降解：卡拉胶在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中溶解后，向其内加入固定化酶，反应12h，离心得到卡拉胶低聚糖溶液；
11.s3、硒化反应和后处理：向卡拉胶低聚糖溶液加入亚硒酸钠，稀盐酸催化反应，然后将反应得到的溶液纳滤膜除盐、浓缩，喷雾干燥后得到硒化卡拉胶低聚糖。
12.进一步限定，在步骤s1中，所述非特异性复合酶的混合比为半纤维素酶酶液：酸性木聚糖酶＝3:1，所述质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合比为4:1，所述硅藻土与混合酶质量比为7:1，所述固定化酶制备过程中戊二醛的加量为0.5-1.0％。
13.进一步限定，在步骤s1中，所述固定化酶制备过程中过夜时间至少为16小时。
14.进一步限定，在步骤s1中，所述固定化酶制备过程中水洗过滤的次数为2-4次。
15.进一步限定，在步骤s2中，所述卡拉胶用摩尔比1:1的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解。
16.进一步限定，在步骤s2中，所述卡拉胶酶解温度55-60℃。
17.进一步限定，在步骤s2中，离心后固体水洗过滤，以回收固定化酶重复使用。
18.进一步限定，在步骤s3中，所述卡拉胶低聚糖溶液和亚硒酸钠的反应温度为60-65℃，反应ph为5-6，且反应时间至少为3h。
19.进一步限定，在步骤s3中，所述纳滤膜截留分子量为≥300。
20.进一步限定，在步骤s3中，所述卡拉胶浓度为质量分数5％，所述亚硒酸钠加量与卡拉胶加量的质量比为1:2。
21.进一步限定，在步骤s3中，在喷雾干燥前加入质量分数0.3％羟丙纤维素作为稳定剂。
22.与现有技术相比，本技术技术方案所取得的技术效果如下：
23.(1)卡拉胶酶解法降解，选用固定化酶，酶活较高且可以重复使用，降低了生产成本，副产物少，卡拉胶低聚糖纯度高，有助于提高硒化后的产率；
24.(2)卡拉胶酶解用酶筛选后选用非特异性酶复合酶，有成本低和酶活高的特点，固定化酶制备选用交联法和吸附法结合，有效提高了酶活回收率，有助于提高固定化酶重复使用次数；
25.(3)卡拉胶低聚糖硒化未采用常规卡拉胶与硝酸和氯化钡反应催化的方式，以盐
酸替代硝酸，少量氯化钙代替氯化钡，硒化过膜后除去无机硒和其他杂质，得到的硒化卡拉胶低聚糖收率基本一致，减少了钡离子和无食品级原料的硝酸的引入，可得到纯度较高的硒化卡拉胶低聚糖；
26.(4)硒化卡拉胶低聚糖选用喷雾干燥有高温灭菌作用，加入了羟丙纤维素作为稳定剂包裹，减少了高温对硒化卡拉胶低聚糖的影响，同时得到干燥、均匀的固体粉末。
27.说明书附图
28.图1为硒化卡拉胶样品(kc2022030805-1)硒含量结果原子吸收光谱图谱；
29.图2为原子吸收光谱硒含量检测标准曲线数据-1；
30.图3为原子吸收光谱硒含量检测标准曲线数据-2；
31.图4为原子吸收光谱硒含量检测标准曲线图谱；
32.图5为原子吸收光谱硒含量检测标准曲线、试剂空白及硒化卡拉胶样品(kc2022030805-1)硒含量结果。
具体实施方式
33.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
34.一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，具体包括如下步骤：
35.s1、固定化酶处理：壳聚糖溶解于体积分数2％乙酸水溶液中，壳聚糖脱乙酰度≥93％。壳聚糖水溶液浓度质量分数为1％，取部分壳聚糖溶液逐滴加入质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合溶液中，二者混合比为4:1，4℃过夜(过夜时间为16小时以上)后加入适量体积分数5％戊二醛水溶液搅拌，戊二醛的加量为0.5-1.0％静置4h，水洗过滤加入半纤维素酶酶液和酸性木聚糖酶混合酶液搅拌均匀，二者混合比为3:1，4℃过夜(过夜时间为16小时以上)后加入硅藻土吸附3h，加入的硅藻土与混合酶质量比为7:1，水洗过滤重复进行2-4次后即得固定化酶，酶活力回收率为70-80％。
36.s2、卡拉胶降解：将化学名为κ-卡拉胶的卡拉胶在摩尔比1:1的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中溶解后，与固定化酶反应12h，卡拉胶酶解温度55-60℃，离心后固体水洗过滤得固定化酶可重复使用；离心后溶液即硒化卡拉胶低聚糖溶液。
37.s3、硒化反应和后处理：卡拉胶低聚糖溶液加入亚硒酸钠，卡拉胶浓度质量分数为5％，亚硒酸钠加量与卡拉胶加量质量比为1:2，稀盐酸催化反应，稀盐酸作为氧化剂同时调节反应ph为5-6，反应温度为60-65℃，反应时间不少于3小时，先通过纳滤膜除盐，纳滤膜截留分子量为≥300，再进行浓缩，最后经过喷雾干燥后即得硒化卡拉胶低聚糖，喷雾干燥前加入质量分数0.3％羟丙纤维素作为稳定剂，喷雾干燥进风口温度160-230℃，气扫温度80-130℃。
38.本技术方法制得的硒化卡拉胶低聚糖的收率为85％～95％，其有机硒含量为2％-5％。
39.为了更好的理解，现结合具体参数和若干优选的实施方式对本技术方案进行结果说明和阐述：
40.实施例一
41.s1、固定化酶处理：取1g壳聚糖溶解于100ml的体积分数2％乙酸水溶液中，取5ml壳聚糖溶液逐滴加入200ml体积比为4:1的质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％
乙醇水溶液的混合溶液中，4℃过夜16h后加入1ml的体积分数5％戊二醛水溶液搅拌均匀，静置4h，重复3次水洗过滤后加入到30ml含有3ml半纤维素酶酶液和1g酸性木聚糖酶的混合酶液中搅拌均匀，4℃过夜16h后加入8g硅藻土吸附3h，重复2次水洗过滤即得固定化酶。
42.s2、卡拉胶降解：5g卡拉胶在100ml质量分数0.8％，摩尔比为1:1的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中溶解后，与固定化酶55℃反应12h，离心后固体水洗过滤得固定化酶留用；离心后溶液得到的硒化卡拉胶低聚糖溶液备用。
43.s3、硒化反应和后处理：卡拉胶低聚糖溶液加入2.5g亚硒酸钠，加入体积分数1％稀盐酸调节ph等于5，在60℃的温度下反应3h，在通过纳滤膜截留分子量为300的纳滤膜除盐、浓缩，经旋蒸处理得到约200ml溶液，最后加入0.003g羟丙纤维素后溶液经小型喷雾干燥机喷雾干燥后即得硒化卡拉胶低聚糖，且喷雾干燥进风口温度160℃，气扫温度80℃。
44.本实施例制备的硒化卡拉胶低聚糖，外观呈淡黄粉末，收率87％。
45.实施例二
46.s1、固定化酶处理：取1g壳聚糖溶解于100ml的体积分数2％乙酸水溶液中，取5ml壳聚糖溶液逐滴加入200ml体积比为4:1的质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合溶液中，4℃过夜16h后加入1ml的体积分数5％戊二醛水溶液搅拌均匀，静置4h，重复3次水洗过滤后加入到30ml含有3ml半纤维素酶酶液和1g酸性木聚糖酶的混合酶液中搅拌均匀，4℃过夜16h后加入8g硅藻土吸附3h，重复3次水洗过滤即得固定化酶。
47.s2、卡拉胶降解：5g卡拉胶在100ml质量分数0.8％，摩尔比为1:1的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中溶解后，与固定化酶57.5℃反应12h，离心后固体水洗过滤得固定化酶留用；离心后溶液得到的硒化卡拉胶低聚糖溶液备用。
48.s3、硒化反应和后处理：卡拉胶低聚糖溶液加入2.5g亚硒酸钠，加入体积分数1％稀盐酸调节ph等于5.5，在62.5℃的温度下反应3h，在通过纳滤膜截留分子量为300的纳滤膜除盐、浓缩，经旋蒸处理得到约200ml溶液，最后加入0.003g羟丙纤维素后溶液经小型喷雾干燥机喷雾干燥后即得硒化卡拉胶低聚糖，且喷雾干燥进风口温度195℃，气扫温度105℃。
49.本实施例制备的硒化卡拉胶低聚糖，外观呈淡黄粉末，收率86％。
50.实施例三
51.s1、固定化酶处理：取1g壳聚糖溶解于100ml的体积分数2％乙酸水溶液中，取5ml壳聚糖溶液逐滴加入200ml体积比为4:1的质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合溶液中，4℃过夜16h后加入1ml的体积分数5％戊二醛水溶液搅拌均匀，静置4h，重复3次水洗过滤后加入到30ml含有3ml半纤维素酶酶液和1g酸性木聚糖酶的混合酶液中搅拌均匀，4℃过夜16h后加入8g硅藻土吸附3h，重复4次水洗过滤即得固定化酶。
52.s2、卡拉胶降解：5g卡拉胶在100ml质量分数0.8％摩尔比为1:1的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中溶解后，与固定化酶60℃反应12h，离心后固体水洗过滤得固定化酶留用；离心后溶液得到的硒化卡拉胶低聚糖溶液备用。
53.s3、硒化反应和后处理：卡拉胶低聚糖溶液加入2.5g亚硒酸钠，加入体积分数1％稀盐酸调节ph等于6，在65℃的温度下反应3h，在通过纳滤膜截留分子量为300的纳滤膜除盐、浓缩，经旋蒸处理得到约200ml溶液，最后加入0.003g羟丙纤维素后溶液经小型喷雾干燥机喷雾干燥后即得硒化卡拉胶低聚糖，且喷雾干燥进风口温度230℃，气扫温度130℃。
54.本实施例制备的硒化卡拉胶低聚糖，外观呈淡黄粉末，收率85％。
55.实施例四
56.s1、固定化酶处理：取100g壳聚糖溶解于10l的体积分数2％乙酸水溶液中，取500ml壳聚糖溶液缓慢搅拌加入20l体积比为4:1的质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合溶液中，静置16h后加入100ml的体积分数5％戊二醛水溶液搅拌均匀，静置4h，重复3次水洗过滤后加入到3l含有300ml半纤维素酶酶液和100g酸性木聚糖酶的混合酶液中搅拌均匀，静置16h后加入800g硅藻土吸附3h，重复2次水洗过滤即得固定化酶。
57.s2、卡拉胶降解：500g卡拉胶在10l质量分数0.8％摩尔比为1:1的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中溶解后，升温至60℃加入固定化酶反应12h，离心后固体水洗过滤得固定化酶留用；离心后溶液得到的硒化卡拉胶低聚糖溶液备用。
58.s3、硒化反应和后处理：卡拉胶低聚糖溶液加入250g亚硒酸钠，加入体积分数1％稀盐酸调节ph6,65℃反应3h，纳滤膜除盐、浓缩得5l溶液，加入0.15g羟丙纤维素后溶液经小型喷雾干燥机喷雾干燥后即得硒化卡拉胶低聚糖。
59.本实施例制备的硒化卡拉胶低聚糖，外观呈淡黄粉末，收率87％。
60.为了进一步理解，现提供一些研发时的相关图表对本方法进行佐证，需要说明的是图2-图4为相互关联的三幅图，图4反映的曲线由图2和图3中所获取数据制得的图谱线，且参考图1-图5以及表1所示，表1如下：
61.表1硒化卡拉胶样品(kc2022030805-1)硒含量结果
62.序号峰高(吸光度)试样浓度(％)10.24892.03320.24432.01030.25192.084平均值/2.043
63.分析可知，采用原子吸收分光光度法检测样品中硒含量，标准曲线过原点斜率0.01241，相关系数0.998，测量结果如图1-5和表1所示，平行测定三次，相对标准偏差1.86％，平行度较好，硒含量结果为2.043％，即表明本方法制备硒化卡拉胶的效果好。
64.需要指出的是，实施例中的参数给出的是优选参数，实际参数的选择可以在优选参数附近简单调整，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况调整上述参数进行实验，从而得到不同收率的硒化卡拉胶低聚糖，其他参数的调整，本技术不再赘述。
65.需要提前说明的是，在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
66.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的
具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：

1.一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、固定化酶处理：将壳聚糖溶解于体积分数2％乙酸水溶液中配置成质量分数1％壳聚糖溶液，取部分壳聚糖溶液逐滴加入质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合溶液中，在恒温4℃的环境下过夜，然后加入体积分数5％戊二醛水溶液搅拌充分后静置4h，水洗过滤加入半纤维素酶酶液和酸性木聚糖酶混合酶液搅拌均匀，4℃过夜后加入硅藻土吸附3h，水洗过滤即得固定化酶；s2、卡拉胶降解：卡拉胶在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中溶解后，向其内加入固定化酶，反应12h，离心得到卡拉胶低聚糖溶液；s3、硒化反应和后处理：向卡拉胶低聚糖溶液加入亚硒酸钠，稀盐酸催化反应，然后将反应得到的溶液纳滤膜除盐、浓缩，喷雾干燥后得到硒化卡拉胶低聚糖。2.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s1中，所述非特异性复合酶的混合比为半纤维素酶酶液：酸性木聚糖酶＝3:1，所述质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合比为4:1，所述硅藻土与混合酶质量比为7:1，所述固定化酶制备过程中戊二醛的加量为体积分数0.5-1.0％。3.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s1中，所述固定化酶制备过程中过夜时间至少为16小时。4.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s2中，离心后的固体水洗过滤，以回收固定化酶重复使用。5.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s2中，所述卡拉胶用摩尔比1:1的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解。6.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s2中，所述卡拉胶酶解温度55-60℃。7.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述卡拉胶低聚糖溶液和亚硒酸钠的反应温度为60-65℃，反应ph为5-6，且反应时间至少为3h。8.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述纳滤膜截留分子量≥300。9.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s3中，所述卡拉胶浓度为质量分数5％，所述亚硒酸钠加量与卡拉胶加量的质量比为1:2。10.根据权利要求1所述的一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法，其特征在于，在步骤s3中，在喷雾干燥前加入质量分数0.3％羟丙纤维素作为稳定剂。

技术总结

本发明属于卡拉胶低聚糖制备领域，尤其涉及一种制备硒化卡拉胶低聚糖的方法。包括如下步骤：S1、固定化酶处理：将壳聚糖溶解于体积分数2％乙酸水溶液中配置成质量分数1％壳聚糖溶液，取部分壳聚糖溶液逐滴加入质量分数10％氢氧化钠水溶液与体积分数95％乙醇水溶液的混合溶液中，在恒温4℃的环境下过夜，然后加入体积分数5％戊二醛水溶液搅拌充分后静置4h，水洗过滤加入半纤维素酶酶液和酸性木聚糖酶混合酶液搅拌均匀，4℃过夜后加入硅藻土吸附3h，水洗过滤即得固定化酶；S2、卡拉胶降解：卡拉胶在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中溶解后，向其内加入固定化酶。本方法简化了硒化卡拉胶低聚糖的制备方法，提高了制备效率，同时还提高了收率和降低了制备成本。率和降低了制备成本。