分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜、制备方法及应用

分离纯化glun2b蛋白用纤维膜、制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种分离纯化glun2b蛋白用纤维膜、制备方法及应用。

背景技术：

2.nmdar受体，是一种离子型谷氨酸受体，其与突触的可塑性和学习记忆密切相关。通过该受体本身、其共轭的离子通道及调节部位3者形成的复合体而发挥功能，对ca
2+
高度通透。每个nmdar受体上含有两个谷氨酸和两个甘氨酸结合识别位点，谷氨酸和甘氨酸均是受体的特异性激活剂。它是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸受体。nmdar受体不仅在神经系统发育过程中发挥着重要的生理作用，如可调节神经元的存活，调节神经元树突、轴突结构发育及参与突触可塑性的形成等；在神经元回路的形成中nmdar受体亦起着关键作用，有资料表明nmdar受体是学习与记忆过程中一类至关重要的受体。
3.突触部位存在glun2b的nmda受体能保持活性连续的细胞交流，大量动物实验证据暗示存在glun2b的nmda受体诱导兴奋性毒性细胞死亡和β淀粉样蛋白(aβ)突触功能障碍。因此，抑制glun2b-nmda受体被认为是阿兹海默症提供神经保护和改善认知功能的一个潜在策略。glun2b蛋白被神经科学广泛关注。但是在神经科学研究过程中，分离纯化glun2b蛋白难度较大。目前还没有简易可操作的标准化试剂盒及方法用于获得glun2b蛋白。

技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离纯化glun2b蛋白用纤维膜、制备方法及应用，该纤维膜制备方法简单，能够高效富集并纯化glun2b蛋白。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
6.一种分离纯化glun2b蛋白用纤维膜，所述分离纯化glun2b蛋白用纤维膜为pva-p-camkii纳米纤维膜，所述pva-p-camkii纳米纤维膜由磷酸化的camkii蛋白通过磷酯键与pva固体载体键合得到。
7.本发明还提供了一种上述分离纯化glun2b蛋白用纤维膜的制备方法，包括如下步骤：
8.s1.将pva(聚乙烯醇)和camkii蛋白(钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii)混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入pocl3、吡啶与氯仿的混合制剂，0-4℃反应20-30min，之后升温至10-15℃，继续反应20-30min，最后升温至18-20℃，继续反应20-30min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到pva-p-camkii复合物；
9.s2.将所述pva-p-camkii复合物溶于水，制得纺丝液，进行静电纺丝，得到纤维膜，将所述纤维膜用盐酸与戊二醛熏蒸交联得到pva-p-camkii纳米纤维膜。
10.进一步的，上述制备方法的步骤s1中，pva、camkii蛋白、pocl3、吡啶与氯仿的用量比例为(1-3)g:(20-45)mg:(10-15)ml:(250-320)μl:(10-15)ml。
11.进一步的，上述制备方法的步骤s2中，所述纺丝液中，pva-p-camkii复合物的质量百分比浓度为8-10％。
12.进一步的，上述制备方法的步骤s2中，所述静电纺丝条件为：电压15-20kv，距离10-15cm，进样速率0.3-0.7ml/h，温度25-35℃，收集板为硅油纸。
13.进一步的，上述制备方法的步骤s2中，所述熏蒸交联操作中，盐酸的用量为每dm2的纤维膜10-15ml，戊二醛用量为每dm2的纤维膜5-8ml。
14.本发明还提供了上述的分离纯化glun2b蛋白用纤维膜在分离纯化glun2b蛋白中的应用。
15.进一步的，上述应用中，所述分离纯化glun2b蛋白具体为：将pva-p-camkii纳米纤维膜浸渍于含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液中4℃振荡吸附20min，用pbs洗涤2次；再用含有egta的pbs缓冲液洗脱，经超滤离心管离心，pbs洗涤除去egta后，收集得到glun2b蛋白。
16.进一步的，上述应用中，所述含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液为含cacl2的神经组织膜蛋白提取液，其中，cacl2的浓度为2.0-2.5mmol/l。
17.进一步的，上述应用中，所述含有egta的pbs缓冲液中，egta的浓度为2.5-3.0mmol/l。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.本技术通过采用pva作为载体，将生物大分子camkii蛋白通过磷酯键键合到高生物亲和性大分子pva上，制备pva-p-camkii纳米纤维膜，实现了将生物大分子camkii蛋白固定到pva载体上的同时实现了camkii蛋白的磷酸化，即激活了生物大分子camkii蛋白，在ca
2+
存在时可以特异性结合glun2b蛋白。利用本发明制备得到的纳米纤维膜进行常规的层析方法，通过egta螯合关键离子，解离洗脱目标蛋白，获得蛋白凝析缩合物，分离纯化微量蛋白。操作简易，速度快捷。
具体实施方式
20.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
21.实施例1
22.1、将2g pva和32mg camkii蛋白混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入12ml pocl3、285μl吡啶与12ml氯仿的混合制剂，2℃反应28min，之后升温至12℃，继续反应25min，最后升温至19℃，继续反应25min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到pva-p-camkii复合物；
23.2、取0.9g步骤1制得的pva-p-camkii复合物溶于9.1ml水，制得纺丝液，进行静电纺丝，电压17kv，距离12cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃，收集板为硅油纸。取1dm2纳米纤维膜用12ml盐酸与7ml戊二醛熏蒸交联得到pva-p-camkii纳米纤维膜；
24.3、取balb/c小鼠海马区脑组织，采用膜蛋白提取试剂盒(碧云天p0033)按照标准程序提取得到神经组织膜蛋白提取液，加入2.1mmol/l cacl2，充分振荡溶解，得到含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液；
25.4、将步骤2得到的pva-p-camkii纳米纤维膜浸渍于步骤3得到的含ca
2+
的神经组织
膜蛋白提取液中，4℃振荡吸附20min，用pbs洗涤2次；再用含有2.8mmol/l egta的pbs缓冲液洗脱，经超滤离心管离心，pbs洗涤除去egta后，收集得到glun2b蛋白。
26.实施例2
27.1、将1g pva和45mg camkii蛋白混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入10ml pocl3、250μl吡啶与15ml氯仿的混合制剂，0℃反应20min，之后升温至10℃，继续反应30min，最后升温至18℃，继续反应20min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到pva-p-camkii复合物；
28.2、取0.8g步骤1制得的pva-p-camkii复合物溶于9.2ml水，制得纺丝液，进行静电纺丝，电压15kv，距离15cm，进样速率0.7ml/h，温度25℃，收集板为硅油纸。取1dm2纳米纤维膜用10ml盐酸与5ml戊二醛熏蒸交联得到pva-p-camkii纳米纤维膜；
29.3、取balb/c小鼠海马区脑组织，采用膜蛋白提取试剂盒(碧云天p0033)按照标准程序提取得到神经组织膜蛋白提取液，加入2mmol/l cacl2，充分振荡溶解，得到含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液；
30.4、将步骤2得到的pva-p-camkii纳米纤维膜浸渍于步骤3得到的含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液中，4℃振荡吸附20min，用pbs洗涤2次；再用含有3mmol/l egta的pbs缓冲液洗脱，经超滤离心管离心，pbs洗涤除去egta后，收集得到glun2b蛋白。
31.实施例3
32.1、将3g pva和20mg camkii蛋白混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入15ml pocl3、320μl吡啶与10ml氯仿的混合制剂，4℃反应30min，之后升温至15℃，继续反应20min，最后升温至20℃，继续反应30min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到pva-p-camkii复合物；
33.2、取1g步骤1制得的pva-p-camkii复合物溶于9ml水，制得纺丝液，进行静电纺丝，电压20kv，距离10cm，进样速率0.3ml/h，温度35℃，收集板为硅油纸。取1dm2纳米纤维膜用15ml盐酸与8ml戊二醛熏蒸交联得到pva-p-camkii纳米纤维膜；
34.3、取balb/c小鼠海马区脑组织，采用膜蛋白提取试剂盒(碧云天p0033)按照标准程序提取得到神经组织膜蛋白提取液，加入2.5mmol/l cacl2，充分振荡溶解，得到含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液；
35.4、将步骤2得到的pva-p-camkii纳米纤维膜浸渍于步骤3得到的含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液中，4℃振荡吸附20min，用pbs洗涤2次；再用含有2.5mmol/l egta的pbs缓冲液洗脱，经超滤离心管离心，pbs洗涤除去egta后，收集得到glun2b蛋白。
36.对比例1
37.1、将2g peo(聚氧化乙烯)和32mg camkii蛋白混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入12ml pocl3、285μl吡啶与12ml氯仿的混合制剂，0℃反应28min，之后升温至10℃，继续反应25min，最后升温至20℃，继续反应25min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到peo-p-camkii复合物；
38.2、取0.9g步骤1制得的peo-p-camkii复合物溶于9.1ml水，制得纺丝液，进行静电纺丝，电压17kv，距离12cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃，收集板为硅油纸。取1dm2纳米纤维膜用12ml盐酸与7ml戊二醛熏蒸交联得到peo-p-camkii纳米纤维膜；
39.3、取balb/c小鼠海马区脑组织，采用膜蛋白提取试剂盒(碧云天p0033)按照标准
程序提取得到神经组织膜蛋白提取液，加入2.1mmol/l cacl2，充分振荡溶解，得到含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液；
40.4、将步骤2得到的peo-p-camkii纳米纤维膜浸渍于步骤3得到的含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液中，4℃振荡吸附20min，用pbs洗涤2次；再用含有2.8mmol/l egta的pbs缓冲液洗脱，经超滤离心管离心，pbs洗涤除去egta后，收集得到glun2b蛋白。
41.对比例2
42.1、取balb/c小鼠海马区脑组织，采用膜蛋白提取试剂盒(碧云天p0033)按照标准程序提取得到神经组织膜蛋白提取液，加入2.1mmol/l cacl2，充分振荡溶解，得到含ca
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的神经组织膜蛋白提取液；
43.2、用步骤1制取的含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液上样，采用12％分离胶体系的凝胶电泳分离纯化，在166kda处切胶，溶胶后收集得到glun2b蛋白。
44.利用凝胶渗透谱法对实施例1-3和对比例1-2获得的glun2b蛋白样品进行检测，其浓度和纯度在表1中显示。
45.表1样品中glun2b蛋白的浓度与纯度
46.样品glun2b蛋白浓度(μg/ml)glun2b蛋白纯度(％)实施例153.4
±
2.395.8
±
2.1实施例248.7
±
1.993.4
±
2.6实施例345.5
±
2.292.2
±
1.8对比例129.0
±
2.034.5
±
4.7对比例222.5
±
1.562.3
±
3.5
47.根据表1可知，实施例方法制备的glun2b蛋白浓度达到45μg/l以上，纯度达到98.5％，显著优于对比例方法获得的glun2b蛋白。对比例1采用了peo代替了pva分子中缺乏有效的羟基，不能形成磷酯键，所以获得较低的glun2b蛋白浓度，也存在peo上的非特异性吸附导致纯度较低；对比例2采用了经典的凝胶电泳体系，但是由于其分辨率较低，而神经组织膜蛋白提取液中glun2b的丰度较低，只能依赖分子量进行分离，其glun2b蛋白浓度和纯度都无法达到较高水平。
48.本发明提供了一种分离纯化glun2b蛋白用纤维膜、制备方法及应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

技术特征：

1.一种分离纯化glun2b蛋白用纤维膜，其特征在于，所述分离纯化glun2b蛋白用纤维膜为pva-p-camkii纳米纤维膜，所述pva-p-camkii纳米纤维膜由磷酸化的camkii蛋白通过磷酯键与pva固体载体键合得到。2.一种权利要求1所述的分离纯化glun2b蛋白用纤维膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1.将pva和camkii蛋白混合冻干后研磨至5nm粉末，在氮气氛围下逐滴加入pocl3、吡啶与氯仿的混合制剂，0-4℃反应20-30min，之后升温至10-15℃，继续反应20-30min，最后升温至18-20℃，继续反应20-30min，加入丙酮洗涤3遍之后用氮气流吹干，得到pva-p-camkii复合物；s2.将所述pva-p-camkii复合物溶于水，制得纺丝液，进行静电纺丝，得到纤维膜，将所述纤维膜用盐酸与戊二醛熏蒸交联得到pva-p-camkii纳米纤维膜。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，pva、camkii蛋白、pocl3、吡啶与氯仿的用量比例为(1-3)g:(20-45)mg:(10-15)ml:(250-320)μl:(10-15)ml。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述纺丝液中，pva-p-camkii复合物的质量百分比浓度为8-10％。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述静电纺丝条件为：电压15-20kv，距离10-15cm，进样速率0.3-0.7ml/h，温度25-35℃，收集板为硅油纸。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述熏蒸交联操作中，盐酸的用量为每dm2的纤维膜10-15ml，戊二醛用量为每dm2的纤维膜5-8ml。7.权利要求1所述的分离纯化glun2b蛋白用纤维膜在分离纯化glun2b蛋白中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述分离纯化glun2b蛋白具体为：将pva-p-camkii纳米纤维膜浸渍于含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液中4℃振荡吸附20min，用pbs洗涤2次；再用含有egta的pbs缓冲液洗脱，经超滤离心管离心，pbs洗涤除去egta后，收集得到glun2b蛋白。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述含ca
2+
的神经组织膜蛋白提取液为含cacl2的神经组织膜蛋白提取液，其中，cacl2的浓度为2.0-2.5mmol/l。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述含有egta的pbs缓冲液中，egta的浓度为2.5-3.0mmol/l。

技术总结

本发明属于生物医学工程领域，公开了一种分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜、制备方法及应用。纤维膜由磷酸化的CaMKII蛋白通过磷酯键与PVA固体载体键合得到。制备方法包括：将PVA和CaMKII蛋白用三氯氧磷交联，制备PVA-P-CaMKII复合物；(2)利用PVA-P-CaMKII制备纺丝液，静电纺丝得PVA-P-CaMKII纳米纤维膜，即分离纯化GluN2B蛋白用纤维膜。具体应用为：将纤维膜浸渍于含Ca

技术研发人员：

汤佳鹏 鞠雨晴 姜辉 朱俐

受保护的技术使用者：

南通大学

技术研发日：

2022.11.18

技术公布日：

2023/2/23