QPT基因工程改造的植物细胞及其利用方法与流程

qpt基因工程改造的植物细胞及其利用方法
技术领域
1.涉及一种qpt基因工程改造的植物细胞及其利用方法。

背景技术：

2.已知喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinic acid phosphoribosyl transferase，qpt)基因在烟草植物的烟碱生物合成中起重要作用，qpt1基因被确定为是植物生长的必需基因，并且发现qpt2基因在烟碱生物合成时期的表达量选择性地增加(ryan等人，2012)。
3.另一方面，在现有技术中，通过转基因(gmo)技术(rnai等)抑制烟草植物中与烟碱生物合成相关的基因的功能来降低烟碱含量。但由于以往技术的限制，不可能100％抑制基因功能，降低烟碱含量也是有限的。
4.因此，通过利用crispr/cas系统诱导qpt2基因突变，所述qpt2基因是与烟草植物的烟碱生物合成相关的基因，从而开发了“未引入外源基因的非转基因(non-gmo)”且“烟碱含量显著低的烟草”植物体。

技术实现要素：

5.发明要解决的问题
6.一方面提供一种植物细胞，其经基因工程改造以降低qpt(quinolinic acid phosphoribosyl transferase)基因或qpt蛋白的表达或活性。
7.一方面提供一种植物，其包括所述植物细胞。
8.一方面提供一种crispr/cas系统，所述crispr/cas系统包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。
9.另一方面提供一种生物碱生物合成抑制用组合物、烟碱生物合成抑制用组合物及qpt基因工程改造用组合物。
10.又一方面提供一种烟碱生物合成受到抑制的植物细胞的制备方法及植物细胞的qpt基因工程改造方法。
11.用于解决问题的手段
12.一方面提供一种植物细胞，其经基因工程改造以降低qpt(quinolinic acid phosphoribosyl transferase)基因或qpt蛋白的表达或活性。
13.所述“亲代细胞”是指未被人为工程改造以降低根据一方面的qpt基因或qpt蛋白的表达或活性的细胞，并且是指从植物中新鲜分离的细胞以及培养该细胞的细胞。
14.所述qpt基因可以是烟碱生物合成相关基因，另外，所述qpt基因可以是源自美花烟草(nicotiana sylvestris)的qpt基因，源自绒毛烟草(nicotiana tomentosiformis)的qpt基因和/或源自栽培烟草(nicotiana tabacum)的qpt基因。例如，所述qpt基因可以是选自由qpt1s、qpt1t、qpt2s和qpt2t组成的组中的至少一种以上的基因。所述qpt1s基因可以
是源自美花烟草(n.sylvestris)的qpt1基因，qpt2s基因可以是源自美花烟草(n.sylvestris)的qpt2基因，qpt1t基因可以是源自绒毛烟草(n.tomentosiformis)的qpt1基因，qpt2t基因可以是源自绒毛烟草(n.tomentosiformis)的qpt2基因。在本说明书中，所述qpt2s可以与ntqpt2s、ntqpt2syl或qpt2_syl混用，在本说明书中，所述qpt2t可以与ntqpt2t、ntqpt2tom或qpt2_tom混用。
15.所述qpt基因可以分别对应于目前在ncbi基因库(genbank)中注册的seq id no.(sequence id)，即aj748263、aj748262、nw_009541109.1、nw_015842103.1、nw_008919084.1、nw_015852968.1、nw_009350226、nw_015824186.1、nw_008919267.1、nw_015852968.1、nw_015842103.1、nw_015824186.1、nw_015852968.1、nw_015852968.1。另外，qpt基因可以分别对应于目前在ncbi基因库(genbank)中注册的基因id，即107825849、104240014、107829123、107829122、104217269、107820078、104121046、104121140。本领域技术人员能够利用所述seq id或基因id注册编号来容易地确认序列。注册于ucsc基因组浏览器(genome browser)或基因库(genbank)中的所述seq id no.的具体序列，可随时间经过有所变更。对本领域技术人员显而易见的是，本领发明的范围还延伸到所述变更的序列。更具体而言，所述qpt基因是响应于创伤或茉莉酸甲酯(methyl jasmonate)处理而表达的qpt2基因，并且可以包括一种以上的选自qpt2s和qpt2t基因的基因，所述创伤是用于诱导烟碱生物合成的信号。
16.另外，在本说明书中，术语“基因工程改造(genetic engineering)”或“基因工程改造的(genetically engineered)”是指，将一种以上的基因修饰(genetic modification)导入细胞的行为或由此制备的细胞。
17.可以通过物理方法对qpt基因的碱基序列进行修饰来诱导所述基因工程改造。所述物理方法例如可以是x射线照射、伽马射线照射等。
18.可以通过化学方法对qpt基因的碱基序列进行修饰或基因的表达的变化来诱导所述基因工程改造。所述化学方法例如可以是甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)处理、硫酸二甲酯(dimethyl sulfate)处理等。
19.可以通过基因编辑系统对qpt基因的碱基序列进行修饰来诱导所述基因工程改造。所述基因编辑系统例如可以是归巢核酸内切酶(meganuclease)系统、锌指核酸酶(zinc finger nuclease)系统、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，talen)系统、crispr/cas系统等。例如，所述基因工程改造可以通过rna干扰(rna interference，rnai)系统与从qpt基因转录的mrna结合并诱导基因表达的变化。
20.因此，对所述植物细胞进行的基因工程改造可通过选自由rna干扰(rna interference，rnai)系统、归巢核酸内切酶(meganuclease)系统，锌指核酸酶(zinc finger nuclease)系统、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，talen)系统、crispr/cas系统、x射线照射、伽马射线照射、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)处理、硫酸二甲酯(dimethyl sulfate)处理构成的组中的至少一种诱导。
21.术语qpt基因或由qpt基因编码的蛋白的“表达或活性减少”或qpt基因的“失活”，qpt蛋白的“表达或活性减少”或qpt基因的“失活”的基因工程改造的植物细胞是指，所述
qpt基因或由qpt基因编码的蛋白的表达或活性比在可比植物细胞或其亲代细胞中测得的qpt基因或由qpt基因编码的蛋白的表达或活性低，或没有表达活活性。即，在植物细胞中，qpt基因或由qpt基因编码的蛋白的表达或活性比原本的未被工程改造的植物细胞的表达或活性减少约20％以上、约30％以上、约40％以上、约50％以上、约55％以上、约60％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上或约100％。qpt基因或由qpt基因编码的蛋白的表达或活性减少的基因工程改造的植物细胞，可通过本领域公知的任意方法来确认。术语“失活(inactivation)”可以指产生根本不表达的基因或即使表达也没有活性的蛋白。术语“减少(depression)”是指，qpt基因相比于未被工程改造的物细胞以低的水准表达或即使表达由qpt基因编码的蛋白，其活性也偏低。
22.可通过qpt基因的核酸序列内修饰诱导所述基因工程改造，所述核酸序列内修饰可通过所述crispr/cas系统人为地进行。
23.所述crispr/cas系统所包括的所述第二多核苷酸可以是包括crrna(crispr rna)和反式激活crrna(transactivating crrna，tracrrna)的单导rna(single guide rna，sgrna)，所述第一多核苷酸可以是编码第二多核苷酸的基因。
24.一般来说，众所周知的基因编辑手段“成簇规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)系统”指，参与包括共同编码cas基因的序列、tracr(反式激活crispr)序列(例如，tracrrna或活性部分tracrrna)、tracr-mate序列(在内源性crispr系统中包括“直接重复”和tracrrna处理的部分直接重复)、指导序列(在内源性crispr系统中也称为“间隔区”)、指导rna或来自crispr基因座的其他序列和转录物的crispr相关(crispr-associated，以下称为cas)基因表达，或诱导其活性的转录物和其他元件。在一些实施方案中，crispr系统的一个以上的元件源自i型、ii型或iii型crispr系统。在一些实施方案中，crispr系统的一个以上的元件源自包括内源性crispr系统的特定有机体，例如，酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)。一般而言，crispr系统的特征在于促进在靶序列位点形成crispr复合物的元件(在内源性crispr系统中也称为原型间隔区)。在形成crispr复合物的情况下，“靶序列”或“靶基因”是指指导序列被设计成具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列之间的杂交增强了crispr复合体。本质上虽然不需要完美的互补性，但存在足够的互补性以引起杂交并促进crispr复合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如dna或rna多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施方案中，靶序列可以存在于真核细胞的细胞器中，例如线粒体或叶绿体。
25.所述crispr/cas系统可以包括cas蛋白和/或其变体。当所述cas蛋白与称为crispr rna(crrna)和反式激活crrna(trans-activating crrna，tracrrna)的两种rna形成复合物时，会形成活性核酸内切酶或切口酶(nickase)。所述cas蛋白的非限制性的例子包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(还称为csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1或其同源体或其修饰版本。已知存在这些酶，例如，酿脓链球菌cas9蛋白的氨基酸序列可以从swissprot数据库以登录号q99zw2获得。在一些实施方案中，未修饰的crispr酶，例如cas9，具有dna切割活性。
26.另外，所述crispr/cas系统，可包括：cas蛋白或编码所述蛋白的基因，所述cas蛋白选自由cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cpf1构成的组；核定位信号(nuclear localization signal，nls)蛋白或编码nls蛋白的基因。
27.具体地，所述crispr/cas系统可包括：所述第一多核苷酸；cas9(crispr associated protein 9)蛋白或编码cas9蛋白的基因；以及nls(nuclear localization signal)蛋白或编码nls蛋白的基因。
28.在一些实施方案中，可使用所述crispr酶为cas9蛋白的crispr/cas9系统。所述cas9蛋白可以是选自由源自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的cas9蛋白、源自空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)的cas9蛋白、源自嗜热链球菌(streptococcus thermophiles)的cas9蛋白、源自金黄葡萄球菌(streptocuccus aureus)的cas9蛋白和源自脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)的cas9蛋白构成的组中的至少一种cas9蛋白，具体地可以是源自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的cas9蛋白。在一些实施方案中，cas9蛋白为在真核细胞中的表达进行了密码子优化，并且当使用源自所述酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的cas9蛋白时，qpt基因或qpt蛋白的表达或活性可以最大程度地降低。
29.在一些实施方案中，cas9蛋白可以在cas9蛋白的5'-或3'-或两个末端部分包括核定位序列或信号(nuclear localization sequence or signal，nls)，用于在真核细胞的细胞核中定位，所述nls是可以是一个或多个。
30.在本说明书中，术语“核定位序列或信号(nuclear localization sequence or signal，nls)”是指用于将特定物质(例如，蛋白)转运到细胞核中的氨基酸序列，通常作用是通过核孔(nuclear pore)运输到细胞核中。所述核定位序列对于真核生物中的crispr复合物活性不是必需的，但包含此类序列可增强系统的活性，特别是靶向核中的核酸分子。
31.此外，rna基因剪刀(rna-guided crispr)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)相关核酸酶cas9对靶基因的敲除、转录激活和利用单个引导rna(sgrna)(即，crrna-tracrrna融合转录本)的抑制提供了突破性的技术，已知这种技术可以靶向许多基因位点。
32.cas9(或cpf1)蛋白是指crispr/cas系统中必不可少的蛋白元件，所述cas9(或cpf1)基因和蛋白的信息可以从美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)的基因库(genbank)中获得，但不限于此。已知编码cas(或cpf1)蛋白的crispr相关基因存在约40多个不同的cas(或cpf1)蛋白家族，根据cas基因与重复结构(repeat structure)的具体组合，共有8个crispr亚型(ecoli、ypest、nmeni、dvulg、tneap、hmari、apern和mtube)可以定义。因此，每个crispr亚型都可以形成一个重复单元以形成多核糖核苷酸-蛋白复合物。
33.所述基因敲除可指，基因的全部或一部分(例如，一个以上的核苷酸)的缺失、取代和/或通过插入一个以上的核苷酸来调节基因活性，例如，失活。所述基因失活是指基因的表达抑制、表达下调(downregulation)或进行修饰以使失去其原始功能的蛋白。此外，基因
调控是由于同时靶向(targeting)靶基因的一个或多个外显子(exon)周围的两个内含子(intron)位点而导致外显子位点缺失引起的蛋白的结构修饰、显性失活(dominant negative)形式的蛋白表达、以可溶(soluble)形式分泌的竞争性抑制剂的表达等结果导致的基因功能变化。具体地，所述第二多核苷酸可以与由所述qpt基因的外显子1至8组成的区域中的至少一个位点结合，更具体地，可以与由所述qpt2基因的外显子1至8组成的区域中的至少一个位点结合，最具体地，可以与qpt2基因外显子2和3的区域结合。
34.使所述qpt基因或qpt蛋白表达或活性降低而人为进行的基因工程改造可通过cas9蛋白或cpf1蛋白诱导。在一个方面的植物细胞中，可以进行基因工程改造，使qpt(quinolinic acid phosphoribosyl transferase)基因或qpt蛋白的表达或活性与亲代细胞相比降低，这可以通过crispr/cas系统来实现，所述crispr/cas系统是可包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。
35.在根据一个方面的植物细胞中，通过将所述crispr/cas系统递送至植物细胞使参与烟碱生物合成的qpt基因失活来表达修饰的qpt蛋白，从而抑制烟碱生物合成。
36.所述qpt基因或qpt蛋白的表达或活性降低可能是由于编码所述qpt的部分或全部基因发生突变、取代、缺失或在所述基因插入了一个或多个碱基而导致，可借助作为qpt基因编辑手段的crispr/cas系统。
37.所述被敲除的qpt基因是qpt2s和qpt2t，当这两个基因都被敲除时，烟碱生物合成可以得到最大程度的抑制。
38.所述植物可以是栽培烟草(nicotiana tabacum)，具体而言，可以是黄种、白肋烟种、本地种、黑烟草或东方种，更具体地，可以是白肋烟种或黄种。
39.当所述cas蛋白由dna编码并递送至受试者或细胞时，所述dna通常可以(但不是必须)包括在靶细胞中可操作的调节元件(例如，启动子)。所述cas蛋白表达的启动子可以是例如cmv、ef-1a、efs、mscv、pgk或cag启动子。grna表达的启动子可以是例如hi、ef-la、trna或u6启动子。此外，所述cas蛋白中编码cas9的基因的序列可以包括核定位信号(nuclear localization signal，nls)(例如，sv40 nls)。在一个例子中，所述启动子可以具有组织特异性或细胞特异性。
40.为降低所述qpt基因或qpt蛋白的表达或活性而人为进行的基因工程改造，可通过在构成qpt基因的核酸序列中前间隔序列邻近基序(protospacer-adjacent motif，pam)或位于其5'端或3'端附近的连续1bp至50bp碱基序列区域内的基因的全部或连续碱基序列区域的一个以上的核苷酸缺失，用与野生型基因不同的核苷酸取代，1至23个各自独立地选自a、t、c和g的核苷酸的插入，或上述修饰的组合进行。
41.在一实施方案中，所述第二多核苷酸可以与所述植物细胞中至少一个对立基因的qpt基因结合，具体地，可以与所有对立基因的qpt基因结合。当第二个多核苷酸与所有对立基因的qpt基因结合并敲除qpt基因时，不仅在同一代，而且在后代的植物细胞中，烟碱生物合成都可以得到最大程度的抑制。
42.在一个实施方案中，用于敲除所述植物细胞中qpt基因的靶序列可以是，例如，qpt基因的外显子1至8组成的区域中的至少一个位点，更具体地，可以是qpt2基因的外显子1至
8的区域。
43.为降低所述qpt基因或qpt蛋白的表达或活性而人为进行的基因工程改造可以使得由qpt基因编码的蛋白不以具有原始功能的蛋白的形式表达。所述基因的工程改造可以由以下一种以上诱导：
44.1)qpt基因的全部或一部分缺失，例如，qpt基因的1bp以上的核苷酸，例如，1至30个、1至27个、1至25个、1至23个、1至20个、1至15个、1至10个、1至5个、1至3个或1个核苷酸的缺失，
45.2)qpt基因的1bp以上的核苷酸，例如，1至30个、1至27个、1至25个、1至23个、1至20个、1至15个、1至10个、1至5个、1至3个或1个核苷酸取代为与原来(野生型)不同的核苷酸取代，以及
46.3)一个以上的核苷酸，例如，1至30个、1至27个、1至25个、1至23个、1至20个、1至15个、1至10个、1至5个、1至3个或1个核苷酸插入靶基因的任何位置(各自独立地选自a、t、c和g)
47.4)选自所述1)至3)中的2种以上的组合。
48.所述qpt基因的被修饰的一部分(“靶区域”)可以为所述基因中的1bp以上、3bp以上、5bp以上、7bp以上、10bp以上、12bp以上、15bp以上、17bp以上、20bp以上、例如，1bp至30bp、3bp至30bp、5bp至30bp、7bp至30bp、10bp至30bp、12bp至30bp、15bp至30bp、17bp至30bp、20bp至30bp、1bp至27bp、3bp至27bp、5bp至27bp、7bp至27bp、10bp至27bp、12bp至27bp、15bp至27bp、17bp至27bp、20bp至27bp、1bp至25bp、3bp至25bp、5bp至25bp、7bp至25bp、10bp至25bp、12bp至25bp、5bp至25bp、17bp至25bp、20bp至25bp、1bp至23bp、3bp至23bp、5bp至23bp、7bp至23bp、10bp至23bp、12bp至23bp、15bp至23bp、17bp至23bp、20bp至23bp、1bp至20bp、3bp至20bp、5bp至20bp、7bp至20bp、10bp至20bp、12bp至20bp、15bp至20bp、17bp至20bp、21bp至25bp、18bp至22bp或21bp至23bp的连续的碱基序列区域。
49.在一例中，所述基因敲除通过包含稀有切割核酸内切酶的基因组编辑系统催化靶基因中特定位点的单链或双链切割(cleavage)，以降低靶基因qpt基因的表达。由所述稀有切割核酸内切酶催化的核酸链断裂(breaks)可以通过同源(homologous)重组(recombination)或非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)等机制进行修复。在这种情况下，当发生nhej机制时，在切割位点(cleavage site)的dna序列中会诱导变化，从而使基因失活。通过nhej进行修复会导致短基因片段的取代、插入或缺失，并可用于诱导基因敲除(knockouts)。所述修饰可以为一个以上的核苷酸，例如，1至30bp、1至27bp、1至25bp、1至23bp、1至20bp、1至15bp、1至10bp、1至5bp、1至3bp或1bp的核苷酸的取代、缺失和/或插入。
50.所述稀有切割核酸内切酶选自归巢核酸内切酶(meganuclease)、锌指(zinc finger)核酸酶、crispr/cas9(cas9蛋白)、crispr-cpf1(cpf1蛋白)和tale-核酸酶中的一种以上。在一具体例中，所述稀有切割核酸内切酶可以为cas9蛋白或cpf1蛋白。
51.术语“嵌合rna”、“嵌合向导rna”、“向导rna”、“单导rna(single guide rna，sgrna)”和“合成向导rna”可互换使用，指指导序列、tracr序列和/或包含tracr配对序列的多核苷酸序列。术语“指导序列”是指在指导靶位点的导向rna内的约20bp的序列，并且可以与术语“指导”或“间隔区”互换使用。此外，术语“tracr配对序列”可以与术语“直接重复”互
换使用。所述向导rna可以由两种rna组成，即crispr rna(crrna)和反式激活crrna(transactivating crrna，trrna)，或者可以为包含crrna和tracrrna的部分组成并与所述靶dna杂交的单链rna(single-chain rna，sgrna)。
52.一般而言，指导序列是与靶序列杂交且与靶多核苷酸序列具有足够互补性以诱导crispr复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。此外，只要能够用于降低qpt基因或qpt蛋白的表达或活性的基因工程改造的碱基序列，则可以不受限制的用作向导rna，例如，所述碱基序列可以是能够与qpt基因杂交的序列。此外，可以修饰一部分向导rna核苷酸序列以修饰/增强向导rna的功能。另外，在一些实施方案中，当使用适当的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其对应的靶序列之间的互补程度为约约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％以上。最佳比对可以通过使用适合比对序列的任何比对算法来确定，其非限制性示例包括：史密斯-沃特曼(smith-waterman)算法、尼德曼-翁施(needleman-wunsch)算法、基于作块排序压缩变换(burrows-wheeler transform)算法(例如，伯罗斯-惠勒校准器(burrows wheeler aligner))、clustalw、clustal x、blat、novoalign(novocraft technologies)、eland(illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥)、soap(可在soap.genomics.org使用)和maq(可在maq.sourceforge使用)。在一些实施方案中，指导序列长度为如约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个以上的核苷酸。在一些实施方案中，指导序列长度为如约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个以下的核苷酸。指导序列诱导crispr复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可以通过任何合适的测定来评估。例如，足以形成包含待测指导序列的crispr复合物的crispr系统的组分，以具有相应靶序列的宿主细胞提供，例如，在用编码crispr序列组分的载体转染后，如通过如本文所述的surveyor测定法评估靶序列中的优先切割。类似地，靶多核苷酸序列的切割提供包含靶序列、被测试的指导序列和不同于被测试指导序列的对照指导序列的crispr复合物的组分，通过比较在靶序列处的测试和对照指导序列反应之间的结合或切割速率进行体外评估。还可以进行其他测定，并且对于本领域技术人员能够容易地使用。
53.可以选择指导序列以靶向任何靶序列。在一些实施方案中，靶序列是细胞基因组内的序列。示例性靶序列包括在靶基因组中独特的序列。一方面，指导序列可以是选自包含由seq id no.9至19的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸中的至少一种，具体地，可以为包含由seq id no.13组成的多核苷酸的sg5和/或者包含由seq id no.15组成的多核苷酸的sg7。所述crispr/cas9系统可以包括多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一个以上的seq id no.9至19的核苷酸序列，具体地，可包括包含1个、2个或3个以上seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸。
54.在一个实施方案中，可以通过转化包含所述第一多核苷酸、编码所述cas9蛋白的基因和编码所述nls的基因的载体来进行所述基因工程改造。
55.在所述转化中，只要是本领域公知的能够转化栽培烟草基因的转化方法，就没有特别限制，具体举例，可以通过在由农杆菌介导转化法、聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)介导原生质体转化法、基因法、电极(electrode)转化法、真空渗透转化法(vacuum infiltration)和碳化硅纤维介导转化法构成的组中选择的一种来执行，考虑到水稻的特性和转化率，可以使用农杆菌介导转化法。
56.术语“载体(vector)”是指用于在宿主细胞中表达目的基因的手段。例如，包括病毒载体如质粒载体、粘粒载体和噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。可用作所述重组载体的载体可将本领域常用的质粒(例如，v2k_ge、psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列和puc19等)、噬菌体或病毒(例如，sv40等)改造而制备。
57.在所述载体中，所述1个多核苷酸、编码所述cas蛋白或其变异体的基因和编码所述nls的基因可以与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接(operatively linked)”是指核苷酸表达控制序列(例如，启动子序列)和另一个核苷酸序列之间的功能性连接。控制序列可以“可操作地连接(operatively linked)”以控制其他核苷酸序列的转录和/或翻译。
58.所述载体，通常可以构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。所述表达载体可以是本领域用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白的常规载体。所述载体可以通过本领域已知的各种方法构建。
59.可以使用原核细胞或真核细胞作为宿主来构建所述载体。例如，当使用的载体是表达载体并且使用原核细胞作为宿主时，通常包含能够进行转录的强启动子(例如cmv启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子等)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。当以真核细胞作为宿主时，在载体中包含的真核细胞中操作的复制起点包括f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺病毒复制起点、aav复制起点、bbv复制起点等，但不限于此。此外，可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如。金属硫氨酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如。腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子和hsv的tk启动子)，并且通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
60.另一方面提供一种包括所述植物细胞的植物。
61.所述植物可以是烟碱或包括降烟碱、阿那巴星和新烟草碱的生物碱生物合成在同一代以及随后几代中受到抑制的植物，由此，可以获得烟碱或包括降烟碱、阿那巴星和新烟草碱在内的生物碱的产生持续减少的植物。
62.在一具体例中，所述植物可以是qpt2s和qpt2t被同时诱导基因突变的植物。
63.一方面提供一种crispr/cas系统，包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。
64.所述crispr/cas9系统，可包括：cas(crispr associated protein)蛋白或编码cas蛋白的基因；以及nls(nuclear localization signal)蛋白或编码nls蛋白的基因。
65.所述crispr/cas9系统所包括的cas蛋白，例如可包括：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(还被称为csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1或它们的同源体或它们的变异体。
66.另外，所述crispr/cas系统用于进行基因工程改造，使植物细胞的qpt基因或qpt蛋白的表达或活性降低，所述qpt基因可以为源自美花烟草(nicotiana sylvestris)的qpt
基因(ntqpts)、源自绒毛烟草(nicotiana tomentosiformis)的qpt基因(ntqptt)或ntqpts和ntqptt的组合。具体地，所述ntqpts可以为qpt2s，ntqptt可以为qpt2t。
67.又一方面提供一种包括所述crispr/cas系统的生物碱生物合成抑制用和烟碱生物合成抑制用组合物，所述生物碱选自由降烟碱、新烟草碱和阿那巴星构成的组中的至少一种。
68.所述组合物包括包含至少一个以上的多核苷酸作为向导rna的crispr/cas系统，可以在qpt2s和qpt2t基因中诱导纯合突变，从而有效地抑制烟碱的生物合成，并且除烟碱之外的包括降烟碱、阿那巴星和新烟草碱在内的生物碱也可以减少约68％以上，所述至少一个以上的多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组。因此，所述组合物甚至能够抑制致癌物烟草特有亚硝胺(tsnas)(nnk、nnn、nab、nat)。
69.又一方面提供一种包括所述crispr/cas系统的qpt基因工程改造用组合物。
70.所述工程改造可以在qpt2s和qpt2t基因两者中诱导纯合突变。
71.所述crispr/cas9系统所包括的cas蛋白，例如可包括：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(还被称为csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1以及它们的同源体或它们的变异体。
72.又一方面提供一种抑制生物碱生物合成、抑制烟碱生物合成和/或qpt基因工程改造用途，那俩所述crispr/cas系统，所述生物碱为在由降烟碱、新烟草和阿那巴星构成的组中的至少一种以上。
73.另一方面提供一种烟碱生物合成受到抑制的植物细胞的制备方法，其包括将包括crispr/cas系统的载体导入植物细胞的步骤，所述crispr/cas系统包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。
74.又一方面提供一种植物细胞的qpt基因工程改造方法，其包括将包括crispr/cas系统的载体导入植物细胞的步骤，所述crispr/cas系统包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。
75.通过所述方法制备的烟碱生物合成受到抑制的植物细胞可以为栽培烟草。
76.另外，适用借助所述方法的qpt基因工程改造方法，能够有效抑制栽培烟草植物细胞的ntqpts和/或ntqptt基因，并降低qpt蛋白的表达或活性，从而能够抑制烟碱或生物碱生物合成，所述生物碱选自由降烟碱、新烟草碱和阿那巴星构成的组中的至少一种。
77.考虑到本说明书的复杂性，省略了重复内容，并且本文未另外定义的术语具有本发明所属领域中常用的含义。
78.发明效果
79.根据一方面，当对植物细胞中的qpt基因进行基因工程改造时，烟碱的生物合成被有效抑制，使烟碱减少了约97％以上，并且烟碱以外的生物碱(降烟碱、阿那巴星、新烟草碱)也减少了约68％以上，因此可以制备致癌物质tsnas(nnk、nnn、nab和nat)也减少的植物
细胞。
附图说明
80.图1是示出在烟草植物体中发生的烟碱生物合成途径的图。
81.图2是示出比较在ncbi基因库(gene bank)中公开的qpt基因的结果图。
82.图3是表示用于构建基因载体的植物表达基因载体(v2k_ge)的图。
83.图4是植物表达的最终基因载体和表达块示意图，具体地，图4的a示出作为基因载体植物的表达载体的v2k_ge_q2，图4的b显示了包含在作为基因剪刀表达块的最终基因载体中的基因剪刀和基因剪刀前导概形的示意图。
84.图5为植物组织培养分步示意图，图5的a示出切下叶片组织并与农杆菌(agrobacterium)共同培养并转化的步骤，图5的b示出诱导愈伤组织分化枝条(shoot)分化的步骤，图5的c示出诱导根(root)分化的步骤，图5的d示出分化完成的小植物体的状态。
85.图6是示出野生型(wild type)(图6的a)和个体编号9号突变体(图6的b)的qpt2_syl基因测序图谱的图(插入(insertion)单个碱基的区域用红方块表示)。
86.图7是示出用于确认f1代基因突变植物中存在导入基因的实时(real-time)pcr结果的图。
87.图8是示出白肋烟对照(wt)和突变体(mt)的qpts基因突变模式的图，具体而言，通过将dna碱基序列(上)转换为氨基酸(amino acid)序列(下)，确认终止密码子(stop codon)(星号)异常早生成的图。
88.图9是示出白肋烟对照(wt)和突变体(mt)的qptt基因突变模式的图，具体而言，通过将dna碱基序列(上)转换为氨基酸(amino acid)序列(下)，确认终止密码子(stop codon)(星号)异常早生成的图。
具体实施方式
89.在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明目的，本发明的范围不限于这些实施例。
90.实施例
91.1.利用crispr/cas9系统的低烟碱烟草生产
92.(1)烟碱生物合成基因选择和基因载体制备
93.烟草内存在qpt1和qpt2基因，已知qpt2为响应于创伤或茉莉酸甲酯(methyl jasmonate)处理而表达的基因，所述创伤是用于诱导烟碱生物合成的信号。
94.在此，为制备低烟碱植物细胞，选择了包含烟碱生物合成相关基因qpt(quinolinic acid phosphoribosyl transferase)的两种基因，即qpt1和qpt2。
95.(2)烟碱生物合成相关基因(ntqpt1和ntqpt2)碱基序列的确认
96.为确认作为研究对象的植物体的白肋烟(burley)种烟草(kb108)内ntqpt基因碱基序列，基于在国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)数据库中公开的碱基序列信息，准备各基因特异性引物，并进行基因扩增反应(polymerase chain reaction，pcr)，并委托了碱基序列分析服务。各基因特异性引物的序列和pcr条件在下表1中示出。
97.表1
98.用于扩增ntqpt基因的引物信息和基因扩增条件
[0099][0100]
通过扩增kb108品种的含外显子(exon)1～外显子(exon)8的gdna区域并分析碱基序列，确认到大部分与所公开的碱基序列一致。具体地，可确认到确定为是源自美花烟草(nicotiana sylvestris)的qpt2基因(以下称为qpt2s)和确定为是源自绒毛烟草(nicotiana tomentosiformis)的qpt2基因(以下称为qpt2t)的碱基序列信息。具体地，将在ncbi(national center for biotechnology information)基因库(genbank)数据库中公开的栽培烟草(n.tabacum)的ntqpt1(aj748262)、ntqpt2(aj748263)基因的碱基序列信息示在下表2中。
[0101]
表2
[0102]
在ncbi基因库中公开的栽培烟草(n.tabacum)的qpt基因碱基序列信息
[0103][0104][0105]
在此，利用所述ntqpt1和ntqpt2基因的碱基序列，比较了是否与ncbi参考序列(reference sequence)存在同源基因，将通过该结果确认的同源性高的碱基序列目录示于
下表3中。
[0106]
表3
[0107]
通过将在基因库中公开的两种qpt基因碱基序列与ncbi参考序列数据库进行比较来确保的同源性高的碱基序列目录
[0108]
编号seq id no.基因id品种名称预测基因1nw_009541109.1104217269美花烟草qpt12nw_009350226107820078美花烟草qpt23nw_008919084.1104121046绒毛烟草qpt14nw_008919267.1104121140绒毛烟草qpt25nw_015842103.1107825849栽培烟草源自美花烟草的qpt1(qpt1s)6nw_015824186.1104240014栽培烟草源自美花烟草的qpt2(qpt2s)7nw_015852968.1107829123栽培烟草源自绒毛烟草的qpt1(qpt1t)8nw_015852968.1107829122栽培烟草源自绒毛烟草的qpt2(qpt2t)
[0109]
如所述表3所示，确认并筛选了与参考序列相似度高的8个序列。比较了表2所公开的qpt基因序列和表3所筛选的10种qpt基因序列的cds区碱基序列的同源性相似度，并将该结果示于表4和图2中。
[0110]
表4
[0111]
实施例所采用的10种公开qpt基因cds区的同源性基体
[0112]
[0113][0114]
如所述表4和图2所示，注册在ncbi基因库中的ntqpt1(aj748263)和ntqpt2(aj748262)分别与美花烟草的qpt1、qpt2基因表现出99％以上的同源性，确认到是源自美花烟草，并且可知源自绒毛烟草的qpt1和qpt2的碱基序列在基因库中缺失。另外，确认到栽培烟草(tn90)中未存在分别源自亲代的美花烟草、绒毛烟草的qpt1s(基因id：107825849)、qpt1t(基因id：107829123)、qpt2s(基因id：104240014)、qpt2t(基因id：107829122)基因。
[0115]
(3)基因剪刀块设计和载体重组
[0116]
筛选出11个仅能特异性切割qpt靶基因的基因特异性位点，构建了一个基因载体可切割三个位点的基因载体。具体而言，在ntqpt基因的外显子1至外显子8区域中选择切割位置。此外，选择了能够切割ntqpt2s基因和ntqpt2t基因两者的共同位点，并示于下表5中。
[0117]
表5
[0118]
与ntqpt2基因特异性结合的剪切前导(sgrna)碱基序列
[0119]
sgrna碱基序列seq id no.qpt基因结合位点sg1tgtttagagctattcctttca9外显子1sg2tgtgtaaaattgcaggttgg10外显子2sg3aatacaagagtggagtcattag11外显子2sg4ccaaggtctctttaagaagaaaa12外显子1sg5gccaccaagaatacaagagtgg13外显子2sg6ccaagaatacaagagtggagtc14外显子2sg7gcaaaggaagacgggatcatagcagg15外显子3sg8gcacttgctgagatgatattcgcgg16外显子3
sg9acaacattgttatagctgagagg17外显子5sg10atatctgctgctggaggtgtcgg18外显子7sg11gatcaatgggaggtttgatacgg19外显子8
[0120]
另外，制备的植物表达基因载体(v2k_ge，seq id no.20)在图3中示出，通过克隆基因中的基因剪刀载体制备最终的基因载体(v2k_ge_q2，seq id no.21)载体，将其图示在图4的a，包含在所述最终的基因载体中的基因剪刀和基因剪刀前导概形的图示在图4的b。pbi121是一种可在大肠杆菌(e.coli)和农杆菌(agrobacterium)中复制的二元载体(binary vector)，广泛用于植物转化。因此，具体而言，如图4的a和图4的b中所证实，用hindiii和ecori切割pbi121以制备能够克隆crispr/cas9系统所需的ge_块(ge_block)。ge_块(ge_block)依次由具有双重增强子的camv35s启动子(camv 35s promoter with dual enhancer)(p_35sd)、tev前导序列(tev leader sequence)(tevls)、用于克隆cas9块的多克隆位点(multi cloning site)(mcs)、camv 35s终止子(terminator)(t_35s)、连接序列(linker sequence)以及用于克隆sgrna块的多克隆位点(multi cloning site)(mcs)构成，并且两端具有hindiii和ecori的识别碱基序列。ge_block的各块都是通过dna合成制备的，并通过顺序克隆完成。v2k_ge通过连接(ligation)用hindiii和ecori切割的pbi121和ge_块(ge_block)来制备。
[0121]
cas9_block由以下块组成：由cas9编码序列(cas9coding sequence)(cds)、c端核定位序列(c-terminus nuclear localization sequence)(nls)构成，两末端追加有bamhi和saci识别碱基序列的块(cas9_block)；作为能够表达sgrna的块(sgrna_qpt)，由u6启动子(promoter)(p_u6)和sgrna以及聚脱氧胸苷(poly t)组成的块；以及由u6启动子(promoter)(p_u6)和sgrna以及聚脱氧胸苷(poly t)组成的块。sgrna_qpt是通过重叠延伸pcr(overlap extension pcr)技术将11种可与qpt基因特异性结合的sgrna块连接成一个连续的dna而完成的。sgrna_qpt的两端存在sali、spei的识别碱基序列。
[0122]
用bamhi和saci切割的v2k_ge和cas9_block通过连接(ligation)反应连接后，用sali和spei切割，插入sgrna_qpt构建v2k_ge_q2。
[0123]
(4)在基因传递微生物(农杆菌(agrobacterium))中引入重组载体
[0124]
通过冻融法(freeze-thaw method)将植物载体转化到农杆菌lba4404菌株(agrobacterium lba4404 strain)。
[0125]
具体而言，将农杆菌(agrobacterium)接种于yep液体培养基(酵母提取物(yeast extract)10g、菌蛋白胨(bacto peptone)10g、naccl5g)中，在28℃、250rpm振荡培养16小时。将培养基以3000g的速度和4℃条件离心20分钟以分离细胞，然后悬浮在20mm的cacl2中以制备感受态细胞(competent cell)。在100μl的感受态细胞中加入5μl的质粒(plasmid)dna(植物载体)后，液氮孵育5分钟，之后在37℃孵育5分钟。加入1ml的yep液体培养基并以28℃、250rpm的条件振荡孵育2小时。将100μl培养基涂在含有100mg/l卡那霉素的yep固体培养基上，在28℃温度培养3天。将每个单菌落(single colony)继代培养后，通过pcr确认质粒dna是否被转化。
[0126]
(5)植物组织培养
[0127]
1)植物转化
[0128]
将农杆菌在yep液体培养基(media)(包含70mg/l卡那霉素和70mg/l链霉素)中于
28℃条件培养24小时。
[0129]
用70％乙醇和次氯酸钠对发芽1个月的植物体的叶子进行消毒，切成3mmx3mm的切片，将切片放入含有5ml的ms液体培养基的培养皿中，之后均匀喷洒1ml农杆菌培养液，在25℃的避光条件下培养48小时以制备烟草叶切片。
[0130]
2)植物组织培养
[0131]
叶切片在含有200μg/ml头孢氨塞肟的无菌蒸馏水中洗涤4次后，置床于分蘖(shooting)培养基(含ms培养基、2mg/l的ba、0.1mg/l的naa、200mg/l的头孢氨塞肟、100mg/l的卡那霉素)，在25℃以16小时/8小时光周期培养，每2周用新培养基继代培养，从而以洗涤(washing)和选择(selection)培养基置床。
[0132]
另外，从叶切片上切割分化的枝条(shoot)，置床于生根(rooting)培养基(含200mg/l头孢氨噻肟的ms培养基)中，在25℃以16小时/8小时光周期条件下培养，从而以生根培养基置床。
[0133]
通过如上所述的农杆菌介导转化(agrobacterium mediated transformation)方法转化到烟叶组织后(图5的a)，证实了一次良好的实现了愈伤组织分化(图5的b)、叶分化(图5的c)和根分化(图5的d)，通过组织培养，获得了57份带叶、茎、根的组培苗标本。
[0134]
(6)f0至f1代的基因突变体的选择
[0135]
1)确认靶基因内是否发生基因突变并确认形式
[0136]
对100mg的健康叶组织进行取样并均匀粉碎，通过采用硅胶柱(silica column)的商业试剂盒(例：nucleospin 96 plant ii，macherey nagel，德国)提取和纯化基因组dna(genomic dna)。从叶组织中提取/纯化gdna后，通过pcr扩增靶基因位点并进行碱基序列分析。
[0137]
具体而言，分别扩增组织培养体的qpt2s、qpt2t基因并分析碱基序列，并确认是否存在通过作为指导序列的sg1至sg11的基因突变及形式，并示于表6中。
[0138]
表6
[0139][0140][0141]
如所述表6所示，已证实在sg5 sgrna结合位点的碱基序列中经常诱导基因突变。此外，确认了以sg7和sg11的顺序诱导了突变。之后，完成了诱导qpt2基因突变的8种组织培养体的筛选，将所述组织培养体8种个体的qpt(qpt2s和qpt2t)基因内的基因突变形式示在
下表7所中，并且，将野生型(wild type)(图6的a)和表7的个体编号第9号基因突变体(图6的b)的qpt2s基因碱基序列分析图谱示在图6的a和6的b中。
[0142]
表7
[0143][0144]
※
双源(dual)：表示两个对立基因(allele)分别产生了不同类型的基因突变。
[0145]
※※
异源(hetero)：表示两个对立基因(allele)的其中一者对立基因产生了基因突变，而另一者对立基因未产生基因突变。
[0146]
※※※
同源(homo)：homo表示两个对立基因(allele)产生了同一类型的基因突变。
[0147]
※※※※
野生(wild)：表示未产生基因突变。
[0148]
2)植物体纯化
[0149]
将确认基因突变的八个组织培养体移植到含有床土的花盆中，并在温室中进行培养。
[0150]
3)确保f1代种子和确认导入基因去除
[0151]
为去除crispr/cas9表达而引入的基因块，通过自体受精确保了f1代种子。在所述组织培养体中，将个体编号9号的植物的种子播种在192口托盘中，培养30天，然后收集叶子并均匀粉碎，随后通过使用硅胶柱(silica column)(例如，nucleospin 96 plant ii，macherey nagel，德国)的商业试剂盒，提取和纯化基因组dna(genomic dna)。使用taqman探针(taqman probe)法的实时(real-time)pcr技术检查花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，camv)35s启动子的存在，并筛选去除了外源导入基因的植物。
[0152]
通过实时pcr确认了192个f1代植物体是否存在p35s启动子，并将其在图7中示出，所述f1代植物体通过将所述组织培养体中的个体编号9号的植物的种子播种并培育而成。如图7中所示，48株植物体被证实不存在p35s启动子。
[0153]
4)最终筛选的f1代植物体的qpt纯合基因突变体的筛选
[0154]
在通过实施例(6)-3)显示基因突变的p35s-植物中，最终选择其中分别在靶基因qpt2s和qpt2t基因中诱导了纯合突变的植物mt_qpt2st_f1。
[0155]
此后，对最终筛选的植物体的qpt2s和qpt2t基因的基因突变模式进行分析，结果如表8所示。
[0156]
在所述分析方法中用于确认qpt2基因的基因突变模式的引物如上表1所示。具体
地，为扩增qpt2s基因，使用了表1的f_q2s、r_q2s引物，为扩增qpt2t基因，使用了表1的f_q2t、r_q2t引物。另外，为了碱基序列分析，共同使用了r1q_q2引物，在这种情况下使用的r1q_q2的碱基序列为ggccacatattaggtaattaca(seq id no.32)。
[0157]
另外，在图8中示出白肋烟种对照(wt)和基因突变体mt_qpt2st_f1的qpt2s基因的基因突变模式，在图9中示出白肋烟种对照(wt)和基因突变体mt_qpt2st_f1的qpt2t基因的基因突变模式。
[0158]
表8
[0159][0160][0161]
如图8和图9所示，mt_qpt2st_f1的qpt2s和qpt2t基因dna序列与野生型(wild-type)白肋烟种的碱基序列比对(align)，并将其转化为氨基酸序列并与qpt2s和qpt2t的氨基酸序列比较，结果证实，基因突变体(mt_qpt2st_f1)早期异常产生了终止密码子(stop codon)。
[0162]
(7)最终基因突变体的基因型分析
[0163]
将通过所述实施例筛选的f1植物体(mt_qpt2st_f1)与野生型kb108品种进行杂交，得到f2。之后，在通过自交获得的f3植物中，分别筛选仅诱导qpt2s基因突变的植物、仅诱导qpt2t基因的植物、以及qpt2s和qpt2t基因均被诱导突变的植物，将f1至f3代的最终选择的基因突变体的基因突变模式总结在下表9中。
[0164]
表9
[0165][0166]
2.最终筛选的f3代中qpt基因突变体烟碱含量分析
[0167]
为确认具体不激活qpt2基因中的哪一种基因的才能够降低烟草的烟碱和生物碱的含量而进行了实验。尤其，由于在所述实施例中制备的f3植物体同时存在仅诱导qpt2s基因突变的植物体、仅诱导qpt2t基因的植物体、以及qpt2s和qpt2t基因均被诱导突变的植物体，从而确认了最终筛选的mt_qpt2s、mt_qpt2t和mt_qpt2st的烟碱和生物碱的含量。
[0168]
将在温室环境中生长60天的植物体的花梗切割后，在两周后收获f0代植物的所有叶子。将收获的叶子在65℃的干燥烘箱中干燥48小时后，将其放入装有玻璃珠(glass bead)的容器中并使用陀螺振动器(gyro-shaker)粉碎。之后，进行了通过gc/ms分析的烟碱含量和生物碱含量分析，结果见表10。
[0169]
表10
[0170][0171]
1)
每叶干重(g)的烟碱含量(mg)，
[0172]
2)
nd(未检测出，not detected)：低于检测限(0.0002mg/g)
[0173]
如表10所示，通过定量分kb108(野生型(wild type，wt))和所述三种基因突变体的烟碱含量，基于干叶重量的野生型(wt)的烟碱含量平均为24.55mg/g，仅qpt2s基因突变体样品烟碱含量未出现下降，而仅qpt2t基因突变体样品比野生型略有下降，平均为20.12mg/g。另一方面，在qpt2s和qpt2t发生基因突变的mt_qpt2st中，烟碱含量显著降低，为平均0.6mg/g。
[0174]
此外，具体确认到，在除烟碱以外的生物碱中，与野生型相比，在qpt2s和qpt2t发生突变的mt_qpt2st中，阿那巴星和新烟草碱均低于检测限，降烟碱的含量也显著降低。

技术特征：

1.一种的植物细胞，经过基因工程改造，其特征在于，与亲代细胞相比，喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinic acid phosphoribosyl transferase，qpt)基因或qpt蛋白的表达或活性降低。2.根据权利要求1所述的植物细胞，其特征在于，所述qpt基因为在由qpt2s和qpt2t基因构成的组中选择的一种以上的基因。3.根据权利要求1所述的植物细胞，其特征在于，所述植物细胞通过在由rna干扰(rna interference，rnai)系统、归巢核酸内切酶(meganuclease)系统、锌指核酸酶(zinc finger nuclease)系统、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，talen)系统、crispr/cas系统、x射线照射、伽马射线照射、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)处理、硫酸二甲酯(dimethyl sulfate)处理构成的组中选择的一种而被基因工程改造。4.根据权利要求3所述的植物细胞，其特征在于，所述crispr/cas系统，包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。5.根据权利要求4所述的植物细胞，其特征在于，所述第二多核苷酸为包括crrna(crispr rna)和反式激活crrna(transactivating crrna，tracrrna)的单导rna(single guide rna，sgrna)。6.根据权利要求4所述的植物细胞，其特征在于，所述第二多核苷酸与由所述qpt基因的外显子(exon)1至8组成的区域中的至少一个位点结合。7.根据权利要求4所述的植物细胞，其特征在于，所述crispr/cas系统，包括：cas蛋白或编码所述蛋白的基因，所述cas蛋白选自由cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cpf1构成的组；以及核定为序列(nuclear localization signal，nls)蛋白或编码nls蛋白的基因。8.根据权利要求1所述的植物细胞，其特征在于，所述植物为栽培烟草(nicotiana tabacum)。9.一种植物，其特征在于，包括根据权利要求1至8中的任一项所述的植物细胞。10.一种crispr/cas系统，其特征在于，包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。11.根据权利要求10所述的crispr/cas系统，其特征在于，
所述系统用于基因工程改造，以降低植物细胞的qpt基因或qpt蛋白的表达或活性，所述qpt基因为源自美花烟草(nicotiana sylvestris)的qpt基因(ntqpts)、源自绒毛烟草(nicotiana tomentosiformis)的qpt基因(ntqptt)或ntqpts和ntqptt的组合。12.一种生物碱生物合成抑制用组合物，其特征在于，包括根据权利要求10或11所述的crispr/cas系统，所述生物碱为在由降烟碱、新烟草碱和阿那巴星构成的组中选择的一种以上。13.一种烟碱生物合成抑制用组合物，其特征在于，包括根据权利要求10或11所述的crispr/cas系统。14.一种qpt基因工程改造用组合物，其特征在于，包括根据权利要求10或11所述的crispr/cas系统。15.一种烟碱生物合成受到抑制的植物细胞的制备方法，其特征在于，包括：将包括crispr/cas系统的载体导入植物细胞中的步骤；所述crispr/cas系统包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。16.一种植物细胞的qpt基因工程改造方法，其特征在于，包括：将包括crispr/cas系统的载体导入植物细胞中的步骤；所述crispr/cas系统包括一个以上的第一多核苷酸或第二多核苷酸，所述一个以上的第一多核苷酸选自由包括seq id no.9至19的碱基序列的多核苷酸构成的组，所述第二多核苷酸由所述一个以上的第一多核苷酸转录而成。

技术总结

一方面涉及一种QPT基因工程改造的植物细胞及其利用方法。根据一实施方式，党对植物细胞内QPT基因进行基因工程改造时，能够有效地抑制烟碱的生物合成，烟碱降低约97％以上，除烟碱外的生物碱(降烟碱、阿那巴星、新烟草碱)也降低约68％以上，因此能够制备致癌物TSNAs(NNK、NNN、NAB和NAT)也降低的植物细胞。NAB和NAT)也降低的植物细胞。NAB和NAT)也降低的植物细胞。