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一种含有抑制核酸内切酶功能的药物及其抗肿瘤的用途的制作方法

一种含有抑制核酸内切酶功能的药物及其抗肿瘤的用途
1.本技术是申请号为cn202010295776.6，申请日为2020.04.15，公开号为cn111671904a，公开日为2020.09.18的发明申请的分案申请。
技术领域
2.本发明属于医药领域，具体涉及利用抑制endod1核酸内切酶的功能在制备或者预防人类肿瘤的药物中的用途。

背景技术：

3.恶性肿瘤对化学药物的抵抗性高，易于发生耐药，要达到暂时控制肿瘤生长、延长患者生存时间的目标都很困难，因此开发新一代肿瘤靶向的临床需求特别迫切，其关键是发现能够有效杀伤肿瘤细胞，但对正常非肿瘤细胞伤害相对很小的药物。其中一种达到此目的的药物研发策略是合成致死(synthetic lethality)，即发现肿瘤细胞的特定缺陷，并确定在该缺陷状态下破坏另外某个细胞功能会导致肿瘤细胞的死亡(参见：o'neil,n.j.,m.l.bailey,and p.hieter,synthetic lethality and cancer.nat rev genet,2017.18(10):p.613-623.)。
4.正常细胞的基因组随时面临dna损伤因素的威胁，导致癌基因和抑癌基因的突变和细胞增殖失控，促进肿瘤发生。在这个过程中，dna损伤应答、dna修复机制发挥关键作用，抑制肿瘤相关的基因组突变，消除基因组结构异常或复制缺陷的细胞，保证基因组的稳定性和器官组织的非癌化(参见：jeggo,p.a.,l.h.pearl,and a.m.carr,dna repair,genome stability and cancer:ahistorical perspective.nat rev cancer,2016.16(1):p.35-42.)。常见的抑癌基因包括pten、cdkn2a、tp53、apc、vhl、p16ink4a、p14arf、lkb1、fbxw7、nf1、nf2和wt-1等，其突变导致神经胶质瘤、神经纤维瘤、肺癌、胃癌、肝癌、黑素瘤、大肠癌、鼻咽癌、肾癌和淋巴瘤的发生(参见：wang,l.h.,et al.,loss of tumor suppressor gene function in human cancer:an overview.cell physiol biochem,2018.51(6):p.2647-2693.)。特别是tp53基因，其突变广泛存在于50-80％的肿瘤中，并且可以被人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎病毒(hbv)等病毒因子破坏(参见：aubrey,b.j.,a.strasser,and g.l.kelly,tumor-suppressor functions of the tp53 pathway.cold spring harb perspect med,2016.6(5).)。
5.人类细胞中，dna损伤应答主要由atm和atr激酶调控，通过γh2ax、53bp1、mdc1和cdc25等信号转导通路激活chk1、chk2，控制细胞周期进展，促进dna损伤修复机制的激活。已知的dna损伤修复机制包括非同样末端链接(nhej)、同源重组修复(hr)、单链dna融合(ssa)、核苷酸切除修复(ner)、碱基切除修复(ber)、单链dna断裂修复(ssr)等(参见：chatterjee,n.and g.c.walker,mechanisms of dna damage,repair,and mutagenesis.environ mol mutagen,2017.58(5):p.235-263.)。这些机制失活导致皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胆管细胞癌、大肠癌、前列腺癌和白血病等的发生。
6.细胞增殖过程中，dna复制产生大量dna损伤，易导致基因突变。这些损伤主要由依
赖同源序列的修复机制消除，如hr、ssa。hr主要由brca1、brca2、mre11、nbs1、blm、53bp1、rad51、rpa、wdr70和范可尼(fanc)等因子调控，而ssa则依赖rad52、mre11、rad54b和rpa等相关的修复因子(参见：haber,j.e.,dna repair:the search for homology.bioessays,2018.40(5):p.e1700229.)。
7.ssa机制在进化过程中极为保守，主要发生在dna断点附近的同源序列，其过程依赖rad52等修复因子结合dna断点形成核蛋白复合物突触，侵入并融合位于dna断点附近的同源序列。rad52是ssa通路的关键分子，可以直接结合在加工后的dna断裂末端，特别是单链dna产物，保护加工后的dna免受核酸酶的降解，促进单链dna上同源序列的融合(参见：wu,y.,et al.,the dna binding preference of rad52 and rad59 proteins:implications for rad52 and rad59 protein function in homologous recombination.j biol chem,2006.281(52):p.40001-9.)。rad52还可以在同源重组修复后期促进链间交换。rad52也可以结合在复制叉阻滞形成的单链dna上，维持复制叉的稳定，防止新复制的dna链被降解，对复制过程中dna的稳定性起重要作用(参见：malacaria,e.,et al.,rad52 prevents excessive replication fork reversal and protects from nascent strand degradation.nat commun,2019.10(1):p.1412.)。由于可能导致同源序列的丢失，ssa被认为是一种低保真甚至有毒性的修复方式。因此，ssa通路调控的紊乱可能导致dna应答和损伤修复的缺陷，导致基因组的不稳定。

技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供了一种endod1核酸内切酶抑制物或者ssa增强剂及其在制备制造预防或肿瘤药物的用途，尤其用于带有dna同源重组缺陷、dna损伤应答缺陷、dna修复缺陷、tp53等抑癌基因的基因突变、基因表达或功能缺陷的肿瘤的用途。
9.本发明的endod1核酸内切酶作为全新的广谱抗肿瘤药物靶点，该核酸内切酶是由endod1基因编码的蛋白质，其中所述endod1的mrna序列为seq id no.1(对应的ncbi参考号nm_015036.3),所述蛋白质的编码氨基酸序列为ncbi登录号np_055851.1对应的序列。
10.本文中的endod1核酸内切酶抑制物也可称为endod1核酸内切酶抑制剂。
11.在一实施方案中，本发明提供了一种或者预防肿瘤的方法，包含给肿瘤患者服用有效量的endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，所述抑制物抑制endod1核酸内切酶的功能，所述核酸内切酶为endod1核酸内切酶基因编码的核酸内切酶。所述ssa增强剂可以提高单链dna融合修复(single strand annealing，ssa)的功能。
12.上述本发明的方法，所述肿瘤含有dna同源重组缺陷、dna损伤应答缺陷、dna修复缺陷、tp53等抑癌基因的基因突变、基因表达或功能缺陷。具体包括肺癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、前列腺癌、黑素瘤、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤或/和胆管细胞癌。
13.上述本发明的方法，所述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂可以是任何对endod1核酸内切酶有抑制作用的物质，所述ssa增强剂可以是任何提高单链dna融合修复(ssa)的物质，具体包括但不限于抗体、有机化合物或天然化合物、小核酸、小核糖核酸、蛋白质、多肽、反义酸和无机物等物质。
14.上述本发明的方法，进一步包括与其它一种或多种抗肿瘤方法联合使用
或形成组合物使用。所述其它一种或多种抗肿瘤方法包括外科手术、放射、化学、基因、dna、病毒疗法、rna、靶向、佐剂和/或免疫。
15.在一些实施方案中，本发明提供了一种或预防肿瘤的药物组合物，含有endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，所述endod1抑制物能抑制endod1核酸内切酶的基因表达、活性或功能，所述核酸内切酶为endod1核酸内切酶基因编码的核酸内切酶。所述ssa增强剂可以上调单链dna融合修复(ssa)的功能。所述肿瘤带有dna同源重组缺陷、dna损伤应答缺陷、dna修复缺陷、tp53等抑癌基因的基因突变、基因表达或功能缺陷。具体为肺癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、前列腺癌、黑素瘤、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤或/和胆管细胞癌。
16.上述本发明的药物组合物，所述endod1核酸内切酶抑制物可以是任何对endod1核酸内切酶有抑制作用的物质，所述ssa增强剂可以是任何上调单链dna融合修复(ssa)功能的物质，具体包括但不限于药物选自抗体、合成有机化合物、天然有机化合物、小核酸、小核糖核酸、蛋白质、多肽、反义酸和无机物等物质。
17.在一些实施方案中，本发明的endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂在制造和/或预防肿瘤药物中的用途，所述endod1抑制物能抑制endod1核酸内切酶的基因表达、活性或功能，所述核酸内切酶为endod1核酸内切酶基因编码的核酸内切酶。所述ssa增强剂可以上调单链dna融合修复(ssa)的功能。
18.上述本发明的用途，所述肿瘤带有dna同源重组缺陷、dna损伤应答缺陷、dna修复缺陷、tp53等抑癌基因的基因突变、基因表达或功能缺陷。所述肿瘤包括但不限于肺癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、前列腺癌、黑素瘤、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤或/和胆管细胞癌。
19.上述本发明的用途，所述endod1核酸内切酶抑制物可以是对endod1核酸内切酶的基因表达、活性或功能有抑制作用的任何物质，所述ssa增强剂可以是上调单链dna融合修复(ssa)功能的任何物质，具体包括但不限于抗体、有机化合物或天然化合物、小核酸、小核糖核酸、蛋白质、多肽、反义酸和无机物等物质。
20.上述本发明的用途，进一步包括将所述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂与另一种或多种抗肿瘤药物或放疗联合使用或组成复合组合物使用。
21.上述本发明的用途，所述另一种或多种抗肿瘤药物选自化疗药物、多肽药物、抗体药物、tki(激酶抑制剂)、小核酸和蛋白质药物。优选的，所述化疗药物选自铂类、丝裂霉素c、喜树碱、parp抑制剂、dnapk抑制剂、放射性同位素、长春花生物碱、抗肿瘤烷基化药物、单克隆抗体和抗代谢药物。
22.上述本发明的用途，所述联用是指endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂与另一种或多种抗肿瘤同时服用同时或者先后服用。
23.上述本发明的用途，所述dna应答缺陷的肿瘤包括带有atm、atr、chk1、chk2、dnapk基因突变或功能缺陷，或者带有cdc25a、cdc25b、cdc25c、cyclin e、cyclin b1、cyclin d1过表达特征的肿瘤。
24.在一些具体实施方案中，本发明的一种或者预防肿瘤的方法，包括给对象服用有效量的endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，所述抑制物能抑制endod1核酸内切酶的基因表达、活性或功能，所述ssa增强剂可以上调单链dna融合修复
(ssa)功能，所述肿瘤带有dna损伤修复的基因突变、基因表达或功能缺陷。优选的，所述dna损伤修复缺陷包括同源重组修复缺陷、碱基切除修复缺陷、核苷酸切除缺陷、单链dna断裂修复的缺陷，以及带有与所述修复机制相关的基因突变或基因表达和功能缺陷。所述endod1核酸内切酶抑制物是任何一种能抑制endod1核酸内切酶功能的物质，所述ssa增强剂可以是上调单链dna融合修复(ssa)功能的任何物质。
25.在一些具体实施方案中，本发明的一种或者预防肿瘤的药物组合物，包括endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，所述endod1抑制物能抑制endod1核酸内切酶的基因表达、活性或功能，所述ssa增强剂可以上调单链dna融合修复(ssa)功能，所述肿瘤带有抑癌基因的基因突变、基因表达或功能缺陷。优选的，所述抑癌基因表达或功能缺陷包括tp53、pten、cdkn2a、apc、p16ink4a、p14arf、lkb1、fbxw等基因或蛋白质的基因突变或基因表达和功能缺陷。
26.上述的药物组合物，所述endod1核酸内切酶抑制物可以是对endod1核酸内切酶的活性或功能有抑制作用的任何物质，具体包括但不限于抗体、有机化合物或天然化合物、小核酸、小核糖核酸、蛋白质、多肽、反义酸和无机物等物质。
27.上述的药物组合物，所述ssa增强剂可以是上调单链dna融合修复(ssa)功能的任何物质，具体包括但不限于抗体、有机化合物或天然化合物、小核酸、小核糖核酸、蛋白质、多肽、反义酸和无机物等物质。
28.在另一实施方案中，本发明提供了一种和预防乙型肝炎病毒感染的方法，包括给对象服用有效剂量的endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，所述核酸内切酶为endod1核酸内切酶基因编码的核酸内切酶。
29.上述的方法或药物组合物，还包括与另一种或多种抗病毒方法联合使用或形成组合物使用。所述一种或多种抗病毒方法包括抗病毒代谢药物、基因、dna、rna、靶向、佐剂和/或免疫。所述核酸内切酶为endod1核酸内切酶基因编码的核酸内切酶，所述endod1核酸内切酶抑制物可以是对endod1核酸内切酶的活性或功能有抑制作用的任何物质，所述ssa增强剂可以是上调单链dna融合修复(ssa)功能的任何物质，具体包括但不限于抗体、有机化合物或天然化合物、小核酸、小核糖核酸、蛋白质、多肽、反义酸和无机物等物质。
30.在另一具体实施方案中，本发明提供了一种和预防乙型方案肝炎病毒感染的药物组合物，含有有效剂量的endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，和药用辅料，所述核酸内切酶为endod1核酸内切酶基因编码的核酸内切酶。优选所述endod1核酸内切酶抑制物可以是对endod1核酸内切酶的活性或功能有抑制作用的任何物质，所述ssa增强剂可以是上调单链dna融合修复(ssa)功能的任何物质，具体包括但不限于抗体、有机化合物或天然化合物、小核酸、小核糖核酸、蛋白质、多肽、反义酸和无机物等物质。
31.上述本发明的药物组合物，所述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂包括小分子化合物、抗体、多肽或反义化合物。
32.在又一实方案中，endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂在制造和预防乙型肝炎病毒感染的药物中的用途，所述核酸内切酶为endod1核酸内切酶基因编码的核酸内切酶。还可进一步包括将endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂与其他抗病毒同时或者先后联合使用。
33.上述的方法，所述endod1核酸内切酶抑制物，其作用抑制endod1核酸内切酶和/或其调控基因的表达水平，抑制endod1核酸内切酶的核酸内切酶活性，阻断其dna修复活性，破坏其亚细胞定位，破坏其蛋白质降解、泛素化、磷酸化翻译后修饰，或者干扰endod1核酸内切酶及其调控蛋白质的剪切和信号肽成熟生物学功能。
34.上述的方法，所述ssa增强剂，其作用可以上调单链dna融合修复(ssa)功能，增强rad52、mre11、rad54b在dna断裂位点的招募，增强rad52与dna断点末端和单链dna结合，增强rad52与rpa70、rpa32的结合，或增强rad52促进单链dna上同源序列的融合。
35.本发明还提供了一种筛选抗肿瘤药物或抗乙肝感染药物的方法，包括将筛选目标物质与endod1核酸内切酶表达的细胞接触，选择对endod1核酸内切酶的活性、功能或表达有抑制作用的物质。
36.本发明还提供了一种筛选抗肿瘤药物或抗乙肝感染药物的方法，包括将筛选目标物质与目标细胞接触，选择对单链dna融合(ssa)修复因子的活性、功能或表达有上调作用的物质。
37.人endod1核酸内切酶(ncbi基因id，23052)的同源基因广泛存在于高等真核生物中，而不存在于酵母、果蝇和线虫等低等真核生物。
38.人endod1核酸内切酶基因编码500氨基酸残基(aa)的蛋白质产物，属于his-cys核酸内切酶家族。其endod1核酸内切酶蛋白质有5种亚型，其产生是由于endod1核酸内切酶的翻译后酶切、信号肽剪切和泛素化修饰。
39.人endod1核酸内切酶在正常生长的细胞中定位于核膜和细胞核。在dna损伤后，endod1核酸内切酶可进入dna断点形成聚集点，与染质紧密结合，招募于dna断点2.5kb附近。
40.人endod1核酸内切酶参与dna修复，促进非同源末端链接(nhej)和同源重组(hr)修复功能，更主要的是抑制单链dna融合(ssa)的功能。endod1核酸内切酶抑制ssa的功能需要蛋白(rad52)的参与，endod1核酸内切酶还可以促进nhej因子(γh2ax和53bp1等)和hr因子(blm、mre11等)在损伤位点的聚集。endod1核酸内切酶调控dna损伤修复的功能依赖于它的核酸内切酶活性。
41.endod1核酸内切酶具有核酸内切酶活性，可以切割带有结构损伤的dna分子，如紫外线损伤、dna双链断裂(5’和3’overhang)、氧化损伤(过氧化氢处理)等。
42.endod1核酸内切酶基因表达或功能抑制与多种dna损伤应答功能的缺陷联合致死，包括同源重组相关蛋白，具体的包括但不限于chk1、atm、chk2、dnapk等。
43.endod1核酸内切酶基因表达或功能抑制与多种dna损伤修复功能的缺陷联合致死，包括brca1、brca2、mre11、arid1a、arid1b、ctip、exo1、fanc和wdr70等。
44.同时抑制endod1核酸内切酶和dna损伤修复功能(如brca1)可以导致更加严重的dna修复缺陷。
45.endod1核酸内切酶功能抑制与tp53、pten等抑癌基因联合致死。
46.endod1核酸内切酶是一个良好的肿瘤特异性靶点，其理由是：
47.1)endod1核酸内切酶基因表达或功能抑制对正常非肿瘤细胞的增殖没有影响(如rpe-1、mrc-5和l02)。
48.2)endod1核酸内切酶基因表达或功能抑制可以有效杀伤多种组织来源的肿瘤细
胞，占所测试肿瘤细胞系的76％(19/25)。
49.3)endod1核酸内切酶基因表达或功能抑制可以有效杀伤带有dna修复基因突变或功能缺陷的肿瘤细胞。
50.4)endod1核酸内切酶基因表达或功能抑制可以有效杀伤带有tp53抑癌基因突变或功能缺陷的肿瘤细胞。
51.5)endod1核酸内切酶基因表达或功能抑制可以协同增强常规放化疗的抗肿瘤活性，而相同条件的药物处理对正常细胞没有显著细胞毒效应。
52.6)除了抑制endod1核酸内切酶基因表达水平，特异性消除endod1核酸内切酶的核酸酶活性区域也可以有效杀伤肿瘤细胞。
53.实施例之一说明可以通过给对象服用足够剂量的endod1核酸内切酶抑制物，可以特异性地或预防带有dna同源重组缺陷、dna损伤应答缺陷、dna修复缺陷、tp53等抑癌基因的基因突变、基因表达或功能缺陷的肿瘤，但对正常非肿瘤细胞没有杀伤作用。同样的原理也适用于可以提高ssa活性的药物(ssa增强剂),因为可以预测endod1抑制物能够有效增强ssa的活性，而杀伤肿瘤依赖于ssa活性的增高，因此可以推断其他ssa增强剂也应该具有同样的效果。
54.本发明发现要维持肿瘤细胞的生存，endod1核酸内切酶表达或活性与抑癌基因tp53、pten等的功能不能同时丢失，单链融合修复(ssa)活性增高不能同时丢失抑癌基因tp53、pten等的功能。沉默endod1核酸内切酶表达基因，或增强单链融合修复(ssa)，会显著导致tp53、pten等缺陷型肿瘤细胞的快速死亡。与细胞学结果一致的是，tp53缺陷型肿瘤的小鼠模型会被体内沉默endod1核酸内切酶基因完全抑制。tp53、pten等抑癌基因缺陷型肿瘤包括任何降低、减缓、损坏及预防tp53基因表达或蛋白质水平减低，以及行使抑癌基因正常功能的缺陷，包括缺失、点突变、移码突变、基因表达减低(基因位点甲基化)等变异。这些突变是可通过任何正规测序试验中检测出的突变。在没有任何确定理论的限制下，抑制endod1核酸内切酶蛋白或增强单链融合修复(ssa)功能可以增强tp53、pten等抑癌基因缺陷型癌症中肿瘤细胞的死亡。
55.本发明还发现要维持肿瘤细胞的生存，endod1核酸内切酶活性与同源重组修复基因(如brca1、brca2、wdr70和fanc等)的功能不能同时丢失，单链融合修复(ssa)活性增高不能同时丢失同源重组修复。沉默endod1核酸内切酶蛋白表达基因，会显著导致同源重组缺陷型肿瘤细胞的快速死亡。与细胞学结果一致的是，同源重组缺陷型肿瘤的小鼠模型会被体内沉默endod1核酸内切酶基因完全抑制。同源重组缺陷型肿瘤包括任何降低、减缓、损坏及预防同源重组修复基因表达或蛋白质水平减低，以及行使同源重组正常修复功能的缺陷，包括缺失、点突变、移码突变、基因表达减低(基因位点甲基化)等变异。这些突变是可通过任何正规测序试验中检测出的突变。在没有任何确定理论的限制下，抑制endod1核酸内切酶蛋白或增强单链融合修复(ssa)功能可以增强同源重组缺陷型肿瘤细胞的死亡。
56.对endod1核酸内切酶功能抑制敏感的人肿瘤细胞携带整合乙型肝炎病毒(hbv)的基因组或表达hbx，这些细胞破坏了同源重组修复因子(crl4wdr70)的功能(参见：ren,l.,et al.,the antiresection activity of the x protein encoded by hepatitis virus b.hepatology,2019.69)。沉默endod1核酸内切酶蛋白表达基因，会显著导致hbv阳性或hbx表达细胞的快速死亡；而抑制endod1核酸内切酶功能对乙肝病毒阴性、不表达hbx基因的肝
细胞没有等同的毒性作用。与细胞学结果一致的是，hbv阳性细胞的肿瘤模型会被体内沉默endod1核酸内切酶基因完全抑制。沉默endod1核酸内切酶基因表达可以有效降低小鼠血清中hbv抗原的滴度和病毒载量。
57.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂的范围包括人肺癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、肝癌(病毒性或非病毒性肝癌)、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、前列腺癌、黑素瘤、子宫内膜癌、神经胶质瘤、肉瘤和胆管细胞癌等疾病，以及肿瘤生长所导致的生理指标异常、呼吸系统、循环系统、神经系统、消化系统、造血系统、运动系统的症状。
58.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂可以上述肿瘤类型中带有同源重组缺陷的肿瘤。
59.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂可以上述肿瘤类型中带有tp53、pten等抑癌基因突变或功能缺陷的肿瘤。
60.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂可以上述肿瘤类型中对放射和化学不敏感的肿瘤。
61.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂可以上述肿瘤类型中具有明显endod1核酸内切酶基因和单链融合修复(ssa)因子表达的肿瘤。
62.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂适用的肿瘤范围，包括但不限于带有同源重组修复缺陷(brca1、brca2、ptip、arid1a、arid1b、范可尼基因、wdr70等)的乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和骨肉瘤等肿瘤。
63.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂适用的肿瘤范围，包括但不限于带有碱基切除修复缺陷(mlh1、msh2突变或功能缺陷)的大肠癌等肿瘤。
64.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂适用的肿瘤范围，包括但不限于带有核苷酸切除修复缺陷(xpa、xpb、xpc、xpd、xpe和xpf突变或功能缺陷)的皮肤癌和黑素瘤等肿瘤。
65.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂适用的肿瘤范围，包括但不限于带有hbv阳性或hbx表达的病毒感染、肝癌和胆管细胞癌，及hbv病毒感染引起的肝胆疾病。
66.endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂适用的肿瘤范围，还其他类型的肿瘤如肺癌、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、前列腺癌、黑素瘤、子宫内膜癌、神经胶质瘤等，这些肿瘤带有dna损伤应答和修复缺陷，包括但不限于带有以下dna损伤应答、dna修复基因突变的肿瘤，如brca1、brca2、ptip、chk1、chk2、atm、atr、mlh1、msh2、wdr70、fanca、fancc、fancd2、fancf、emsy、xpa、xpb、xpc、xpd、xpe、xpf、dna连接酶i、dna连接酶ii、dna连接酶iii、dna连接酶iv等；或带有抑癌基因突变如tp53、pten、cdkn2a、apc、p16ink4a、p14arf、lkb1、fbxw、vhl和wt-1等。
67.本发明的另一目的，可用于减灭或根除hbv感染细胞或表达hbx基因的肝炎细胞，减低hbv携带者病人的血清病毒抗原滴度和病毒载量，减轻传染性。所述方法包括给予所述患者有效量的endod1核酸内切酶抑制制剂或ssa增强剂。
68.在这里，上述endod1核酸内切酶抑制物包括任何能在细胞中相对于对照溶剂，可以减少，降低，阻碍，损伤及预防endod1核酸内切酶活性的药剂；或者是任何能够减少或降低endod1核酸内切酶基因表达水平和蛋白水平的药剂。尤其，endod1核酸内切酶蛋白包括不同的蛋白活性调控区域，因此相关药物还应包括可抑制该区域活性的药剂，蛋白活
性区包括信号肽加工、蛋白质剪切、细胞核、高尔基和核膜的亚细胞定位，以及endod1核酸内切酶降解和泛素化等。具体的，这些药物还包括可以减少，减缓，损害及预防endod1核酸内切酶活性蛋白区域的药剂。
69.endod1核酸内切酶抑制物的作用对象是抑制endod1核酸内切酶的功能，包括减低或彻底消除endod1核酸内切酶基因表达和/或蛋白质水平，或抑制其核酸内切酶酶活性，干扰其dna损伤修复功能，阻断其蛋白质剪切、加工和成熟，破坏其亚细胞定位，破坏其泛素化调控，或者干扰endod1核酸内切酶的蛋白质剪切和成熟等生物学功能。这些药物还包括可以减少，减缓，损害及预防endod1核酸内切酶活性蛋白区域的药剂。
70.在这里，上述ssa增强剂包括任何能在细胞中相对于对照溶剂，可以上调、提高单链融合修复(ssa)活性的药剂；或者是任何能够上调减少或降低单链融合修复(ssa)基因表达水平和蛋白水平的药剂。尤其，ssa增强剂包括不同的蛋白活性调控区域，因此相关药物还应包括可增强该区域活性的药剂，蛋白活性区包括蛋白质成熟、细胞核、染质和dna断点的亚细胞定位，以及ssa调控因子的磷酸化、乙酰化、降解和泛素化等。具体的，这些药物还包括可以影响rad52、mre11和rad54b等单链dna融合修复(ssa)活性蛋白区域的药剂。endod1核酸内切酶抑制类药物或ssa增强剂可以是任何形式的小分子、抗体及抗体片段、基因编辑、多肽，及反义组成物。
71.具体的，endod1核酸内切酶抑制类药物可以是一类靶向endod1核酸内切酶mrna及dna的分子，作用为减少和预防endod1核酸内切酶蛋白表达。具体的，endod1核酸内切酶相关药物可以干扰endod1核酸内切酶的dna或rna的核酸序列，例如sirna,shrna,dsrna,mirna,amirna,反义寡聚核苷酸，或采用crispr/cas9或衍生方法实现基因编辑或基因敲除，以降低endod1核酸内切酶或其调控基因的表达水平。此类药物可以是修饰或未修饰形式。修饰后的此类药物可能包含修饰后的核苷酸、糖基、修饰后的骨架载体及任何前期修饰。例如修饰包括但不限于r2’o-me修饰，核苷酸2'-氟(2
’‑
f)修饰，核苷酸类似物的替换及骨架磷酸化修饰等。
72.本发明也提供了一种抑制endod1基因表达的sirna或shrna，为12至100个核苷酸的单链或双链rna分子，其中一条链包含12至24个连续或不连续的可与endod1基因某段核苷酸匹配的序列，优选的，所述抑制endod1基因表达的sirna为长度为18至28个核苷酸的单链或双链rna，更优选的，所述抑制endod1基因表达的sirna，其核苷酸序列选自由seq id no.2-no.353序列组成的组。
73.本发明也确定了通过crispr/cas9破坏endod1核酸内切酶基因组结构和基因表达的核苷酸靶向序列，包括但不限于：
[0074]5’‑
ccagcgcgagccagcgcgcgg-3’[0075]5’‑
cagcctcttcgccctggctgg-3’[0076]5’‑
tgtcacattcgccaaagccgg-3’[0077]5’‑
cccgggtgctgtagagggtgg-3’[0078]
上述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，包括含有的组合物用于肿瘤及相关疾病。endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂可与具有协同效果的其他抗肿瘤方法联用(如抗癌药物、手术、移植及放射疗法)中。进一步的，与其他药物协同使用包括所有联合使用可以增加抗癌效果的药剂及给药方式。上述产生协同作用的药剂包括任
何癌症方式，包括但不限于药剂，疗法组合方式，用药技术(如手术，放疗等)。具体的抗癌疗法包括但不限于手术、放疗、化疗、基因疗法、dna疗法、病毒疗法、rna疗法、辅助及免疫的组合及单独使用。
[0079]
所述联合用药可以是两种药物各自先后间隔服用或者同时服用，或者endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂与其它靶向抗癌药物组成药物组合物。
[0080]
上述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂的联合用药或组合物，进一步包括与铂类(包括但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂、塞特博、吡铂、奈达铂、triplatin、lipoplatin)、喜树碱、丝裂霉素等dna毒性抗癌药物联合用药。所述联合用药可以是一并服用，也可是一先一后间隔服用。
[0081]
上述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂的联合用药或组合物，进一步包括parp抑制剂、dnapk抑制剂、hdac抑制剂、atmi抑制剂、长春花生物碱、抗肿瘤类生物碱、单抗、抗代谢类药物。所述联合用药可以是一并服用，也可是一先一后间隔服用。
[0082]
上述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂的联合用药或组合物，进一步包括与放射进行联合用药，包括但不限于
67
cu,
67
ga,
90
y，
131
i,
177
lu,
186
re,
188
re,α_particle emitter,
211
at,
213
bi,
225
ac,auger-electron emitter,
125
i,
212
pb,and 111
in。所述联合药可以是与放射同时服用，也可是一先一后间隔服用。
[0083]
进一步的，抗肿瘤的烷基化剂的例子包括但不限于:氮芥、环磷酰胺、甲基二氧乙基胺或莫司汀(hn2)、乌拉莫司汀或尿嘧啶、芥子气、溶肉瘤素、氯霉素、异磷酰胺、苯达莫司汀、亚类、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素、烷基磺酸盐、二甲磺酸丁酯、噻替派、丙嗪、六甲蜜胺、三嗪、达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺。所述联合用药可以是一并服用，也可是一先一后间隔服用。
[0084]
进一步的抗癌单克隆抗体的例子包括，但不限于necitumumab、dinutuximab、nivolumab、blinatumab、pembrolizumab、ramucirumab、obinutuzumab、adotrastuzumab emtansine、pertuzumab、brentuximab、ipilimumab、ofatumumab、catumaxomab、bevacizumab、cetuximab、tositumomab-il31、ibritumomab tiuxetan、alemtuzumab，吉妥珠单抗，曲妥单抗和利妥昔单抗，长春花生物碱及衍生物类似物。所述联合用药可以是一并服用，也可是一先一后间隔服用。
[0085]
进一步的上述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂的联合用药或组合物，包括但不限于抗代谢物药剂。例如药剂包括但不限于氟尿嘧啶，克拉屈滨，卡培他滨，6巯基嘌呤，培美曲塞，氟达拉滨，吉西他滨，羟基尿，甲胺喋呤，nelarbine，氯法拉滨，阿糖胞苷，地西他滨，脱氮氨基蝶呤，5-氟脲嘧啶脱氧核苷，6-硫鸟嘌呤。
[0086]
进一步的上述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂的联合用药或组合物，包括但不限于细胞免疫疗法，抗体或细胞因子。endod1核酸内切酶抑制物与免疫疗法协同作用。细胞免疫疗法的例子包括但不限于，树突状细胞疗法和sipuleucel-t。抗体的例子包括，但不限于necitumumab、dinutuximab、nivolumab、blinatumab、pembrolizumab、ramucirumab、obinutuzumab、adotrastuzumab emtansine、pertuzumab、brentuximab、ipilimumab、ofatumumab、catumaxomab、bevacizumab、cetuximab、tositumomab-il31、ibritumomab tiuxetan、alemtuzumab。细胞因子的例子包括但不限于干扰素(例如，ifna、ifnp、ifny、ifnx)和白介素。在一些实施例中，免疫疗法包括一个
month,lupron depot-4month,lupron depot-ped,lupron,viadur),liposomal cytarabine(例如,depocyt),lomustine(例如,ceenu),mechlorethamine hydrochloride(例如,mustargen),megestrol acetate(例如,megace),mercaptopurine(例如,purinethol,purixan),methotrexate(例如,abitrexate,folex pfs,folex,methotrexate lpf,mexate,mexate-aq),丝裂霉素c(例如,mitozytrex,mutamycin),mitoxantrone hydrochloride,mopp,nelarabine(例如,arranon),nilotinib(例如,tasigna),nivolumab(例如,opdivo),obinutuzumab(例如,gazyva),oepa,ofatumumab(例如,arzerra),off,奥拉帕尼(例如,lynparza),omacetaxine mepesuccinate(例如,synribo),oppa,奥沙利铂(例如,eloxatin),紫杉醇(例如,taxol),paclitaxel synribo),紫杉醇纳米颗粒药剂(例如,abraxane),pad,palbociclib(例如,ibrance),帕米膦酸二钠(例如,aredia),帕尼单抗(例如,vectibix),panobinostat(例如,farydak),pazopanib hydrochloride(例如,votrient),培门冬酶(例如,oncaspar),alfa-2b聚乙二醇干扰素(例如,peg-intron,sylatron),pembrolizumab(例如,keytruda),培美曲塞二钠(例如,alimta),帕妥珠单抗(例如,perjeta),plerixafor(例如,mozobil),pomalidomide(例如,pomalyst),ponatinib hydrochloride(例如,iclusig),pralatrexate(例如,folotyn),prednisone,procarbazine hydrochloride(例如,matulane),radium 223 dichloride(例如,xofigo),raloxifene hydrochloride(例如,evista,keoxifene),ramucirumab(例如,cyramza),r-chop,重组人乳头瘤病毒双价疫苗(例如,cervarix),重组人乳头瘤病毒(例如,hpv)单价疫苗(例如,gard as il 9),nonavalent vaccine(例如,hpv)四价疫苗(g.g.,gardasil),alfa-2b重组白细胞干扰素(例如,intron a),瑞格非尼(例如,stivarga),利妥昔单抗(例如,rituxan),罗米地辛(例如,istodax),ruxolitinib phosphate(例如,jakafi),siltuximab(例如,sylvant),sipuleucel-t(例如,provenge),甲苯磺酸索拉非尼(例如,nexavar),stanford v,苹果酸舒尼替尼(例如,sutent),tac,塔莫西芬枸橼酸盐(例如,novaldex),替莫唑胺(例如f methazolastone,temodar),temsirolimus(例如,torisel),酞胺呱啶酮(例如,synovir,thalomid),thiotepa,盐酸拓扑替康(例如,hycamtin),托瑞米芬(例如,fareston),tositumomab及放射性碘元素(i131)加托西莫单抗(例如,bexxar),tpf,曲美替尼(例如,mekinist),曲妥珠单抗(例如,herceptin),vamp,vandetanib(例如,caprelsa),veip,vemurafenib(例如,zelboraf),vinblastine sulfate(例如,velban,velsar),vincristine sulfate(例如,vincas ar pfs),vincristine sulfate liposome(例如,marqibo),vinorelbine tartrate(g.g.,navelbine),vismodegib(例如,erivedge),vorinostat(例如,zolinza),xeliri,xelox,ziv-aflibercept(例如,zaltrap),zoledronic acid(例如,zometa),或它们的任意组合.
[0088]
更进一步的,抗癌疗法可以是表观遗传学及转录调控因子中挑选出。例如包括但不限于dna甲级转移酶抑制剂，组蛋白乙酰化抑制剂(hdac抑制剂)，赖氨酸甲基转移酶抑制剂)，抗有丝分裂类药物(例如,taxanes and vinca alkaloids),激素受体调节剂(例如,雌激素受体调节剂及雄激素受体调节剂)，细胞信号通路抑制剂，细胞信号通路抑制剂，蛋白稳定调节剂(例如蛋白酶抑制剂)，hsp90抑制剂，糖皮质激素，反式维甲酸类化合物，及其他促分化因子。
[0089]
具体的，endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂可以独立参与任意一种抗癌
疗法。此抗癌疗法包括但不限于手术，放疗，移植(干细胞移植，骨髓抑制)，免疫疗法及化疗。
[0090]
具体的上述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂方案可应用的肿瘤包括但不限于肺癌(例如.,支气管癌，小细胞肺癌(sclc)，非小细胞肺癌(nsclc)，肺腺癌)；肾癌(如成肾肾母细胞瘤，又名威尔姆斯肿瘤，肾细胞癌)；听神经瘤；腺癌；肾上腺癌；肛门癌；血管瘤(例如淋巴血管瘤，lymphangiocndothcliosarcoma,血管肉瘤)附件癌；良性单克隆丙种球蛋白症；胆囊癌；膀胱癌；乳腺癌(例如，乳腺腺癌，乳腺乳头状癌，乳腺髓样癌)；脑癌(例如，脑膜瘤，胶质细胞瘤，胶质瘤(例如，星状细胞瘤，oligodendroglioma)，髓母细胞瘤)；支气管癌；类癌肿瘤；宫颈癌(例如宫颈癌腺癌，宫颈癌鳞癌)；胆囊癌；脊索瘤；颅咽管瘤；结直肠癌(如结肠癌、直肠癌、结肠直肠腺癌)；结缔组织癌；上皮癌；室管膜瘤；内皮肉瘤(例如，卡波西肉瘤，多发性特发性出血性肉瘤)；子宫内膜癌(如子宫癌、子宫肉瘤)；食管癌(例如，食道腺癌，barrett食道腺癌)；尤文氏肉瘤；眼癌(如眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤)；嗜酸性粒细胞增多症；胆囊癌；胃癌(如胃腺癌)；胃肠道基质肿瘤(gist)；生殖细胞癌；头颈部癌症(如头颈部鳞状细胞癌、口腔癌(如口腔鳞状细胞癌)、咽喉癌(如喉癌、咽癌、鼻咽癌、咽喉癌)；重链病(如α链病、γ链病、μ链病；血管母细胞瘤；下咽癌；炎性肌纤维母细胞瘤；免疫细胞淀粉样变性；肝癌(如肝细胞癌(hcc)，恶性肝细胞瘤)；平滑肌肉瘤(lms)；肥大细胞增多症(例如，系统性肥大细胞增多症)；肌肉癌；骨髓增生异常综合征(mds)；间皮瘤；骨髓增生异常(mpd)(例如，真性红细胞增多症(pv)，原发性血小板增多症(et)，非原发性髓样化生(amm)，骨髓纤维化(mf)，慢性特发性骨髓性纤维化，慢性粒细胞白血病(cml)，慢性中性粒细胞白血病(cnl)，高嗜酸性粒细胞综合征(hes)，神经母细胞瘤；神经纤维瘤(例如，多发性神经纤维瘤(nr)1型或2型，神经鞘瘤病)；神经内分泌癌(例如，胃肠道神经内分泌肿瘤(gep-net)，良性肿瘤)；骨肉瘤(例如，骨癌)；卵巢癌(例如卵巢囊腺癌、卵巢胚胎癌、卵巢腺癌)；乳头状腺癌；胰腺癌；导管内乳头状粘液瘤(ipmn)；胰岛细胞瘤；阴茎癌(如阴茎阴囊paget病)；松果体瘤；原始神经外胚层肿瘤；浆细胞瘤；副肿瘤综合征；上皮内肿瘤；前列腺癌；直肠癌；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；皮肤癌(例如鳞状细胞癌(scc)、角化棘皮瘤(ka)、黑素瘤、基底细胞癌(bcc))；小肠癌(例如阑尾癌)；软组织肉瘤(例如恶性纤维组织细胞瘤(mfh)、脂肪肉瘤、恶性周围神经鞘瘤(mpnst)、软骨肉瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤)；皮脂腺癌；小肠癌；汗腺癌；滑膜瘤；睾丸癌(例如精原细胞瘤、睾丸胚胎癌)；甲状腺癌(例如，甲状腺乳头状癌、乳突性甲状腺癌(ptc)，甲状腺髓样癌；尿道癌；阴道癌；外阴癌(如外阴佩吉特病)。
[0091]
具体的，endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂对癌症的，“”是指逆转、缓解、延缓癌症的发生或癌症的进展。具体的，可以在疾病的一个或多个信号或症状已经发展，或已经可以观察到后进行；也可以在无症状及信号的疾病中进行。例如，可在症状出现前(例如，根据症状史和/或病原体暴露史)对易感者进行。也可以在症状消失后继续，例如，延迟和/或防止复发。
[0092]
具体的，endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂对癌症的中“给药”是指将本文所述do抑制物或ssa增强剂，或其组成植入、口服、吸收、注射、吸入或以其他任何方式导入对象体内或体外。
[0093]
在本发明方案中，术语“给药”是指将本文所述endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，或其组成植入、口服、吸收、注射、吸入或以其他任何方式导入对象体内或
体外。
[0094]
术语“单链dna融合修复”，即single strand annealing(ssa)，是指主要依赖rad52介导的，需要单链dna和同源序列的修复方式。其调控通路还包括rad52、mre11、rad54b和rpa等因子。
[0095]
术语“抑制”是指化合物降低、减缓、停止和/或阻止细胞内特定生物过程相对于载体的活性能力。“控制”或“预防”是指活性被抑制，阻碍，控制或预防，与对照活性相比，其减少程度至少5％.10％.15％.20％.25％.30％,35％.40％.45％.50％.55％,60％.65％.70％,75％.80％.85％,90％.95％.或100％。具体的，“抑制，阻碍，控制或预防”是指抑制剂的靶向物表达与对照相比降低至少5％.10％.15％.20％.25％.30％,35％.40％.45％.50％.55％,60％.65％.70％,75％.80％.85％,90％.95％.或100％。具体的，“抑制，阻碍，控制或预防”是指抑制剂的靶向物活性(如生物酶活性)与对照相比降低至少5％.10％.15％.20％.25％.30％,35％.40％.45％.50％.55％,60％.65％.70％,75％.80％.85％,90％.95％.或100％。
[0096]“有效剂量”是指能够诱发预期生物学反应的剂量。这种反应可以通过本领域常规技术所理解。本发明种成分有效剂量可能根据以下因素产生变化：预期的生物学终点，该化合物的药代动力学，环境，给药方式，对象年龄及健康因素。有效剂量包括但不限于，减慢，减少，抑制，改善，逆转一种或多种癌症相关症状的必需剂量。具体的，“有效剂量”是指药剂(如endod1抑制物或ssa增强剂)可导致肿瘤细胞种降低endod1表达或/和活性的剂量。“降低endod1表达或/和活性“的有效剂量范围包括，2倍到100倍间任意倍数，从100％到1％之间的任意值。具体的，癌症中的有效剂量是指达到肿瘤细胞中缺乏表达endod1蛋白或/和其蛋白活性的剂量。
[0097]
如果给受试者服用两种或两种以上的抑制剂，有效量可以是联合选择量。当第一抑制剂与第二且任选地与第三抑制剂一起使用时，第一抑制剂的选择性量可以不同。当两种或两种以上的抑制剂同时使用时，每种抑制剂的有效量可能与单独使用时相同或。预期效果如能在较低剂量下实现，每种药物的有效量可以小于单独使用时的有效量。具体的，当受试者能够更好地耐受一种或多种抑制剂，并且更高的剂量可以提供更大的益处时，每种药物的有效量可能大于单独使用时的有效量。具体的，根据一次或多次给药一天或几天(取决于给药方式)，一种化合物的有效量可从约0.001mg/kg变化到约1000mg/kg。在某些实施例中，有效剂量从约0.001mg/kg到约1000mg/kg，从约0.01mg/kg到约750mg/kg不等。从约0.1mg/kg到约500mg/kg，从约1.0mg/kg到约250mg/kg，从约10.0mg/kg到约150mg/kg。本领域的普通技术人员能够根据经验确定适当的有效量。
[0098]“受试者”或“患者”或“对象”包括但不限于能够患癌，或任何能够罹患直接或间接涉及癌症的疾病的人和动物。研究对象包括哺乳动物。如人类、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、大鼠、兔子、小鼠和转基因非人类动物。具体的，“受试者”或“患者”或“对象”包括伴侣动物，例如狗、猫、兔子和大鼠。具体的，“受试者”或“患者”或“对象”包括牲畜，例如牛、猪、绵羊、山羊和兔子。具体的，“受试者”或“患者”或“对象”包括纯种或展示动物，例如马、猪、牛和兔子。具体的，“受试者”或“患者”或“对象”是人类，例如，具有或可能具有癌症风险的人类。
[0099]
本专利所述化合物可按任何顺序投与给受试者。第一剂，例如endod1抑制剂，
可以在(例如，5分钟，15分钟，30分钟，45分钟，1小时。2小时，4小时，6小时。12小时，24小时，48小时，72小时，96小时。1周。2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)，伴随或随后(例如5分钟，15分钟，30分钟，45分钟，1小时，2小时，4小时，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时，96小时，1周，2周，3周，4周，5周，6周，8周，或12周后)对受试者施用第二剂。因此，endod1抑制剂可与第二剂(如本文所述的化学剂)分开、顺序或同时施用。
[0100]
本文所述化合物可通过任何途径投与，包括肠内(例如口服)、肠外、静脉、肌肉、动脉内、髓内、鞘内、皮下、脑室内、经皮。交互规范。直肠、阴道内、腹腔内、局部(如粉末、软膏、药膏和/或滴剂)、粘膜、鼻腔、口腔、舌下；气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和/或口服喷雾剂、鼻腔喷雾剂和/或气雾剂。具体的，在考虑范围内的途径包括口服、静脉注射(例如全身静脉注射)、通过血液和/或淋巴供应的区域性给药和/或直接给药到病变或疑似病变部位。具体的，最合适的给药途径取决于多种因素，包括制剂的性质(例如，在胃肠道环境中的稳定性)和/或受试者的状况(例如。。受试者是否能够耐受口服给药)。所需化合物的具体量(达到有效量)将因受试者而异，例如，取决于受试者的物种、年龄和健康情况、副作用或个体生物系统紊乱的严重程度、特定化合物的特性、给药方式等。所需剂量可每日三次、每日两次、每日一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周给药。具体的，所需剂量可使用多次给药(例如两次、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或更多次来给药)。具体的，每天向70kg成人施用一次或多次的有效量的化合物可包含约0.0001mg至约3000mg、约0.0001mg至约2000mg、约0.0001mg至约1000mg。每单位剂型化合物约0.001mg至约1000mg，约0.01mg至约1000mg，约0.1mg至约1000mg，约1mg至约1000mg，约1mg至约100mg，约10mg至约1000mg，或约100mg至约1000mg。
[0101]
具体的，本文提供的化合物可以足以从约0.001mg/kg递送至约100mg/kg、从约0.01mg/kg递送至约50mg/kg、优选从约0.1mg/kg递送至约40mg/kg、优选从约0.5mg/kg递送至约30mg/kg、从约0.01mg/kg递送至约10mg/kg的剂量水平递送，从受试者体重的约0.1mg/kg到约10mg/kg，更优选地从约1mg/kg到约25mg/kg，每天一次或多次，以获得期望的效果。需要注意的是，如本文所述的剂量范围为向成人施用所提供的药物成分提供指导。具体的给予儿童或青少年的量可以由医生或本领域技术人员确定，并且可以低于或等于给予成人的量。
[0102]
在本发明方案中，术语“endod1核酸内切酶”是指人endod1核酸内切酶的基因(ncbi基因id，23052)、mrna(nm_015036.3)和蛋白质(np_055851.1)。。
[0103]
在本发明方案中，其中所述endod1核酸内切酶抑制物可以通过口服或注射等胃肠外途径给予，也可以通过慢病毒、腺病毒等生物媒介给与。
[0104]
另一方面，本发明的再一目的是确定endod1核酸内切酶抑制物的细胞生物学筛选方法和策略，包括但不限于本发明所述细胞生物学方法，包括离子射线或化疗药物处理后，利用免疫荧光或荧光融合蛋白测定细胞中功能蛋白质在dna断点的聚集能力，如endod1核酸内切酶、mre11、gh2ax、53bp1和单链dna生成等信号减低，rad52、atm-pserine 1981、blm等聚集信号增强。
[0105]
再一方面，本发明的再一目的是确定endod1抑制物的筛选方法和策略，包括本发明所述体外核酸内切酶活性测定方法、细胞水平ssa功能异常的筛选方法、endod1基因表达抑制剂筛选方法。具体的测定信号包括但不限于荧光、生物素、吸光度、化学发光、电信
号、放射显影等，其衍生测定方法包括酶活性竞争性抑制法、流式细胞术、闪烁接近检测(spa)、荧光偏振检测(fpa)、表面等离子体共振技术等。
附图说明
[0106]
图1、人endod1核酸内切酶基因和蛋白质序列特征
[0107]
(a-b)人endod1核酸内切酶基因(23052)的mrna(nm_015036.3)和蛋白质(np_055851.1)的编码序列；(c)蛋白质结构域包括信号肽、核酸内切酶及活性位点(残基c190、c224和c269)，跨膜区i-iii；(d)endod1核酸内切酶基因的结构，包含2个外显子和1个内含子序列；(e)genetree软件绘制的endod1核酸内切酶基因的进化树，其同源基因存在于高等真核生物中，而不存在于酵母、果蝇和线虫等低等真核生物；
[0108]
图2、人endod1核酸内切酶的特性与翻译后修饰
[0109]
(a)endod1核酸内切酶基因的crispr/cas9基因编辑，grna靶点如a1所示，下划线核苷酸为pam序列。a2显示所用cas9-grna基因编辑质粒的构造；(b)endod1核酸内切酶基因沉默所用3条小干扰rna序列(b1)及沉默效果(b2)，si001是本研究常用sirna。所示*号为非特异性条带；(c)免疫蛋白质印迹测定rpe-1细胞中endod1核酸内切酶的蛋白质产物，其主带大小约55kd(全长，a)。所示*号为非特异性条带；(d)cas9-grna基因编辑获得的endod1核酸内切酶基因敲除(2f4)或突变(2f6)的rpe-1细胞系。2f4为完全敲除，蛋白免疫印迹检测不出任何endod1核酸内切酶蛋白质条带。2f6为蛋白质加工突变，只表达a带，而b、c条带缺失；(e)免疫印迹检测sirna(si001)基因沉默的rpe-1细胞。endod1核酸内切酶蛋白条带a、b、c、d、e均减弱；(f)泛素化修饰实验证明endod1核酸内切酶的蛋白质亚型e是由于泛素化修饰产生，修饰方式包括赖氨酸48(k48)和赖氨酸63(k63)的多聚泛素化修饰；(g)生物信息学软件(predisci)预测的endod1核酸内切酶信号肽位置(残基22)，leg-rl是可能的蛋白酶切位点；(h)netsurfp-2.0软件预测endod1核酸内切酶的低序区(disorder)，发现残基300-325是潜在的蛋白酶切位点，与残基leg-rl序列的酶切活动共同产生endod1核酸内切酶的b、c、d亚型；
[0110]
图3、人endod1核酸内切酶与dna损伤位点结合
[0111]
(a)免疫荧光显示，endod1核酸内切酶在正常生长的细胞中主要定位于细胞浆和核膜。在dna损伤后(离子射线照射)，endod1核酸内切酶可在40分钟进入dna断点形成endod1核酸内切酶聚集点，并持续存在到照射后2小时。细胞核dna用dapi反染；(b)免疫荧光显示，endod1核酸内切酶在喜树碱(cpt)和羟基脲(hu)处理后也可以进入dna断点形成聚集点；(c)免疫荧光显示，endod1核酸内切酶在离子射线照射后可与γh2ax在dna损伤聚集点共定位，如箭头所示；(d)染质免疫共沉淀实验证明endod1核酸内切酶在距离dna断点处0.5、1和2.5kb处结合；(e)单链dna结合因子(rpa32)的染质免疫共沉淀实验证明rpa32在endod1核酸内切酶沉默后没有明显缺陷，但是在同源重组修复因子(wdr70)共沉默的条件下，可以消除rpa在dna断点的结合；(f)染质分离实验证明endod1核酸内切酶的a、b、c、d形式可与染质紧密结合；
[0112]
图4、人endod1核酸内切酶参与dna修复
[0113]
(a)rpe-1细胞中沉默endod1核酸内切酶基因后，通过i-sce1诱导pcdna3-nhej、pcdna3-hr、pcdna3-ssa质粒上的dna断裂，测定dna断点修复效率。endod1核酸内切酶基因
沉默可以略微抑制非同源末端链接(nhej)和同源重组(hr)修复功能，更主要的是促进单链dna融合(ssa)的功能；(b)如图a，在rpe-1野生型、2f4和2f6细胞中测试dna断裂修复效率；(c)在endod1核酸内切酶基因敲除的2f4细胞中转染多西环素诱导的野生型endod1核酸内切酶质粒(wt)，可纠正上述修复异常；而引入核酸内切酶失活的endod1核酸内切酶质粒(nd，nuclease dead；δend：endonuclease deleted)则没有纠正功能。说明endod1核酸内切酶依赖其核酸内切酶活性调控dna修复；(d)rpe-1细胞沉默endod1核酸内切酶和/或ssa功能基因(rad52)，测试dna断裂修复效率。rad52沉默可以逆转endod1核酸内切酶缺陷导致的ssa功能亢进；(e-f)免疫荧光显示rpe-1细胞敲除(e)或沉默(f)endod1核酸内切酶基因可以提高rad52向dna断点的聚集，说明endod1核酸内切酶通过降低rad52向dna损伤位点的招募而抑制ssa修复效率。与野生型rpe-1相比，2f4和2f6均有rad52功能亢进的缺陷。e1、f1：免疫荧光染图片，白圆圈表示细胞核的位置。e2、f2：rad52在损伤位点聚集的计数。细胞dna用dapi反染。文中所述统计学方法若无特别说明均使用双尾t检验验证p值，p≤0.05认为有显著差异。ns：无统计学差异；
[0114]
图5、endod1核酸内切酶对其他dna修复因子的调控机制
[0115]
(a)沉默endod1核酸内切酶基因表达抑制ir诱导的γh2ax和53bp1的聚集点；(b)敲除或突变endod1核酸内切酶的rpe-1细胞(2f4和2f6)不能形成ir诱导的fk2聚集点；(c)沉默endod1核酸内切酶基因表达增强ir诱导的atm自身磷酸化(ps1981)的聚集点；(d-e)沉默endod1核酸内切酶基因表达抑制ir诱导的blm(d)和mre11(e)的聚集点；
[0116]
图6、endod1核酸内切酶对损伤dna的切割效应
[0117]
(a)bl21细菌纯化的endod1核酸内切酶-strep标签蛋白质。包括endod1核酸内切酶全长(fl)，残基22-233和1-344的片段。sn：细胞裂解液；pu：纯化后endod1核酸内切酶的成分；(b)0.5微克纯化的endod1核酸内切酶核酸内切酶结构域片段(22-344残基)加入0.37微克dna双链片段或dna/rna杂交链，在酶切缓冲液(100mm nacl,50mm tris-hcl,10mm mgcl2,100μg/ml bsa,ph 7.9)。dna双链包括平末端(30bp)、3’(28bp)和5
’‑
overhang(28bp)三种形式；(c)0.5微克纯化endod1核酸内切酶的蛋白质加入0.2微克各种处理的pegfp-c3质粒dna，在酶切缓冲液中进行体外消化反应(37℃，16小时)。endod1核酸内切酶可以切割带有结构损伤的质粒，如紫外线损伤、dna双链断裂(5’和3’overhang)、氧化损伤(过氧化氢处理)。htra2纯化蛋白质作为无核酸酶活性的对照；
[0118]
图7、endod1核酸内切酶基因敲除或沉默不影响正常非肿瘤细胞的增殖
[0119]
(a)正常体细胞(rpe-1、mrc-5、ges-1和l02)细胞沉默endod1核酸内切酶基因(sien)，并测定其增殖曲线；(b)endod1核酸内切酶野生型和基因编辑的rpe-1细胞(2f4和2f6)的增殖曲线；
[0120]
图8、endod1核酸内切酶基因沉默抑制肿瘤细胞的增殖
[0121]
(a-b)所示肿瘤细胞中转染endod1核酸内切酶特异性sirna(si001)，测定增殖速率。肿瘤细胞显示敏感(a)和不敏感(b)两种特征。mda-mb-231、nci-h1299和hl60细胞计算实验终点细胞增殖倍数；(c)在实验终点对部分测试细胞进行结晶紫染，深显示存留的活细胞；(d)免疫印迹显示siendod1在不敏感细胞(ho8910-pm、sw480、ges-1、l02)中的沉默效果；(e)在skov3细胞中沉默endod1，同时多西环素诱导过表达抗siendod1的endod1野生型或核酸酶失活(nd)，检测细胞增殖倍数；(f)在skov3细胞中同时转染endod1核酸内切酶
和rad52的sirna，测定细胞增殖倍数；
[0122]
图9、endod1核酸内切酶与dna损伤应答和同源重组修复基因的联合致死效应
[0123]
(a)rpe-1和2f4细胞经dna损伤应答因子抑制剂或基因沉默处理后，测定其增殖能力。活细胞由结晶紫染；(b)endod1核酸内切酶与brca1、brca2、blm、mre11、ctip、exo1、arid1a/rid1b和wdr70等同源重组修复基因共沉默后，测定其增殖能力和联合致死效应；(c)endod1核酸内切酶与所示dna修复基因共沉默后的联合致死效应定量图。纵轴表示实验终点(12天)细胞的增殖倍数；(d)3条不同的endod1核酸内切酶sirna与brca1基因共沉默对rpe-1细胞的联合致死效应；(e)敲除细胞(2f4)中沉默brca1、fancd2或fancc基因，测定其联合致死效应；
[0124]
图10、endod1核酸内切酶与抑癌基因的联合致死效应
[0125]
(a)在沉默endod1核酸内切酶的rpe-1细胞或2f4细胞中沉默tp53基因，12天后对存活细胞进行结晶紫染；(b)对tp53高水平的肿瘤细胞系(ho8910-pm)同时沉默endod1核酸内切酶和tp53，测定实验终点的增殖倍数和结晶紫染；(c)在沉默endod1基因的带有tp53基因纯和突变的细胞(nci-h1975)中同时转染野生型tp53表达质粒(oetp53)，进行基因回补，测定实验终点的增殖倍数和结晶紫染；(d)在rpe-1和2f4细胞中沉默抑癌基因pten，测定实验终点的增殖倍数和结晶紫染；
[0126]
图11、肿瘤细胞基因突变与endod1核酸内切酶基因沉默细胞毒的相关性分析
[0127]
(a)免疫印迹实验检测所示正常及肿瘤细胞系中endod1核酸内切酶的蛋白质水平；(b)human protein atlas数据库中显示的正常人体组织中endod1核酸内切酶的蛋白质水平；(c)human protein atlas数据库中endod1核酸内切酶在各种来源的人肿瘤组织中的表达水平；(d)endod1核酸内切酶基因沉默对带有tp53及其他基因突变(如brca1、brca2等)的肿瘤细胞抑制效果显著高于非突变的肿瘤细胞。组间差异使用双尾t检验验证，p≤0.05认为有显著差异；
[0128]
图12、endod1核酸内切酶基因沉默的对化学的增敏作用
[0129]
正常细胞(rpe-1)和肿瘤细胞(a549)细胞在沉默endod1核酸内切酶后进行cpt、顺铂和dnapk等靶向抑制剂处理，测定其增殖曲线；
[0130]
图13.endod1核酸内切酶基因沉默对小鼠荷瘤模型的作用
[0131]
(a)建立skov3、hcc1937和ovcar-8tr细胞的裸鼠皮下肿瘤模型，每周两次体内注射对照或endod1核酸内切酶特异性sirna(si001)，测定肿瘤体积。三种细胞系均带有tp53或brca1基因突变；(b)沉默endod1基因对3种肿瘤模型的抑制率(t/c％)；
[0132]
图14、endod1核酸内切酶功能抑制与活动性乙肝病毒对细胞的联合致死效应
[0133]
(a)endod1核酸内切酶和wdr70共沉默对hbv阴性肝细胞(l02)的联合致死效应；(b)在hbv阳性(t43)或阴性细胞(l02)中沉默endod1核酸内切酶基因，测定其增殖能力。parp抑制剂(奥拉帕尼，0.5um)作为t43细胞毒的阳性对照；(c)建立t43(的裸鼠皮下肿瘤模型，每周两次体内注射对照或endod1核酸内切酶sirna，测定肿瘤体积(c1)。实验终点解剖并分离对照和沉默endod1的肿瘤(c2)；(d)一组实验终点的肿瘤解剖样本；(e)裸鼠尾静脉接种hepg2.2.15，elisa方法测定所示时间点的血清中hbv抗原(hbsag)的滴度；(f)裸鼠尾静脉接种hepg2.2.15，使用利用荧光定量pcr确定血液中hbv拷贝数方法测定所示时间点的血清中hbv病毒dna的滴度；
[0134]
图15、体外endod1核酸内切酶活性滴定
[0135]
竞争性抑制法筛选endod1核酸内切酶活性小分子抑制剂流程图：在384孔pcr裙边板中加入endod1蛋白质、线性双链dna底物及小分子抑制剂库，进行酶切反应后加入包含引物的荧光定量pcr预混液，进行荧光定量pcr检测dna底物剩余量及酶切效率，筛选有效的小分子抑制剂。
具体实施方式
[0136]
以下非限制性实施例用来进一步阐明和理解本发明的实质。应当理解的是，所示组分的比例变化和操作方法对本领域技术人员而言是显而易见的，因此也落入本发明的范围内。
[0137]
本发明在研究dna损伤应答机理的过程中，意外地发现endod1核酸内切酶基因编码的核酸内切酶具有抑制rad52介导的ssa修复的功能，对其他dna修复机制的影响较小。文献报道认为endod1核酸内切酶是一个抑癌基因，沉默该基因功能可以促进肿瘤增殖(参见：qiu,j.,et al.,identification of endonuclease domain-containing 1as a novel tumor suppressor in prostate cancer.bmc cancer,2017.17(1):p.360.)。但是，我们的研究意外地发现抑制endod1核酸内切酶功能可以与dna损伤应答缺陷(如atm、chk1)、dna修复缺陷(如brca1、brca2、mre11、fanc和乙型肝炎病毒阳性等)表现强烈的合成致死效应，也可以与带有抑癌基因突变(如tp53、pten)的细胞合成致死，并可以有效地杀伤带有这些缺陷的肿瘤细胞；在带有所述基因突变或功能缺陷的体内肿瘤模型中，抑制endod1核酸内切酶功能可以遏制这些肿瘤的进展。与之相反，在dna损伤应答、dna修复机制和tp53等抑癌基因功能正常的非肿瘤细胞中，抑制endod1核酸内切酶功能，甚至完全敲除endod1核酸内切酶基因，则完全没有合成致死的效应，不影响这些细胞的增殖。并且，抑制endod1核酸内切酶表达或功能可以让有或没有上述缺陷的肿瘤细胞对细胞毒性(放疗或化疗)更加敏感，具有协同增敏的作用，而相同药物处理对正常细胞没有毒性作用。因此，这些研究证明endod1核酸内切酶可以与dna损伤应答、dna修复机制和抑癌基因的缺陷联合致死肿瘤细胞，是一个全新的广谱抗肿瘤药物靶点。
[0138]
下列实施例中细胞系种类及来源如表一所示，其来源为atcc、中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库或成都中科院生物研究所等合作单位转赠)。endod1核酸内切酶基因编辑的rpe-1细胞(2f4和2f6)由四川大学华西第二医院刘聪实验室构建。裸鼠(balb/c-nude品系,spf级，雌性，来源于四川大学实验动物中心)为本发明中实验用。
[0139]
实施例中所用细菌菌株为dh5a和bl21等常用菌株。endod1核酸内切酶分子克隆和细胞表达所用pet28a、plvx-ires-zsgreen1、pcdna3、plvx-tet3g、plvx-tre3g等质粒，以及各种野生型和突变体均由四川大学华西第二医院刘聪实验室制造。i-sce1dna断裂诱导体系的质粒由浙江大学陈军教授提供。所用crispr/cas9基因编辑体系由北京唯尚立德生物科技有限公司公司构建。小干扰rna(sirna)由上海锐博生物技术有限公司公司合成。分子克隆引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司公司合成。
[0140]
实施例中使用的lipofectamine 3000(invitrogen,l3000015)、兔抗人endod1核酸内切酶抗体(abcam,ab121293)、rad52(lsbio,ls-c176555/122111)、atm-pserine1981(cell signaling,526s)、fk2(enzo,bml-pw8810)、53bp1(bethyl,a300-272a)、γh2ax
(millipore,05-636)、mre11(cell signaling,4895)、blm(bethyl,a300-110a-2)、brca1(bethyl,a300-001a)、rpa32-pserine33(novus,nb100-544)、顺铂(131102,supertrack bio-pharmaceutical)、羟喜树碱(selleck,s2423)、羟基脲(selleck,s1896)、atm抑制剂(ku55933,selleck,s1092)、mre11抑制剂(mirin,selleck,s8096)、chk2抑制剂(bml-277,selleck,s8632)、dnapk抑制剂(nu7026,selleck,s2893)、cgk733(selleck,s7136)、atr抑制剂(caffeine，sigma,c1778-5vl)、4-oht((z)-4-羟三苯氧胺)及其他各种试剂均为本发明中实验用。常用试剂剂量：ir，8gy；cpt，0.0125um；hu，0.2mm；顺铂，2ug/ml；4-oht，300nm。转染质粒剂量为0.25ug/10万细胞；转染sirna剂量为0.2ug/10万细胞。
[0141]
实施例中所提到细胞系基因组突变位点的信息均由文献或atcc提供。
[0142]
乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(s10910113，上海科华生物工程股份有限公司)，乙型肝炎病毒(hbv)核酸扩增(pcr)荧光定量检测试剂盒(s20030059，海科华生物工程股份有限公司)及其他各种试剂均为本发明中实验用，不作他用。
[0143]
表1、所用细胞系及培养条件
[0144]
[0145][0146]
本发明所涉及基因名称、id、基因组和染体定位如表2所示。
[0147]
表2、基因列表
[0148]
genencbi gene idgenomic locationendod12305211q21tp53715717p13.1rad52589312p13.33mre11436111q21rad54b257888q22.1rpa2(rpa32)61181p35.3rpa1(rpa70)611717p13.3atm47211q22.3atr5453q23chek1(chk1)111111q24.2chek2(chk2)1120022q12.1dnapk55918q11.21mlh142923p22.2msh244362p21-p16.3xrcc1751519q13.31xrcc3751714q32.33brca167217q21.31brca267513q13.1paxip1(ptip)229767q36.2wrn74868p12fanca217516q24.3fancd221773p25.3emsy5694611q13.5arid1a82891p36.11arid1b574926q25.3wdr70551005p13.2pten572810q23.31cdkn2a(p16，p14)10299p21.3apc3245q22.2stk11679419p13.3fbxw7552944q31.3wt-1749011p13
[0149]
以下实施例中所用术语或缩写如下：
[0150]
irif(ionizing radiation-induced foci):放射线诱导的灶点，即dna损伤位点；
[0151]
aa(amino acid)：氨基酸(残基)；
[0152]
kb(kilobase)：千碱基对；
[0153]
bp(base pair)：碱基对
[0154]
ul：微升；
巯基乙醇)裂解细胞并于100℃金属浴处理5分钟。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质(80伏/15分钟后150伏/55分钟)，再将蛋白质印迹至聚偏二氟乙烯膜(150毫安/3小时)上。将膜置于封闭缓冲液(10mm tris-hcl[ph7.5]，150mm nacl，0.1％tween，5％bsa)中封闭1小时，加入兔抗人endod1核酸内切酶抗体(1:1000)，室温孵育4小时后用洗涤缓冲液(10mm tris-hcl[ph7.5]，150mm nacl，0.1％tween)洗涤3次，每次十分钟。继续将膜置于含有羊抗兔hrp二抗(1:3000)的封闭缓冲液中孵育1小时，洗涤3次，每次十分钟。利用ecl发光液显，通过bio-rad凝胶成像系统(chemidoc xrs)采集图像。
[0178]
实验结果：
[0179]
1、人endod1核酸内切酶基因的mrna序列如图1a所示，编码区(orf)共1503个核苷酸。endod1核酸内切酶蛋白质序列如图1b所示，共501个氨基酸。endod1核酸内切酶蛋白质结构域如图1c所示，包括信号肽(1-22氨基酸残基(aa))，核酸内切酶结构域(49-257aa)，3个跨膜序列(i:345-364aa，ii:411-435aa和iii:455-482aa)。半胱氨酸c190、c224和c269是his-cys核酸内切酶家族的保守活性位点。ensembl数据库显示endod1核酸内切酶基因组位点含有两个外显子和一个内含子(图1d)。genetree软件分析endod1核酸内切酶基因在不同物种的进化关系，发现其同源基因存在于珊瑚、鱼类、脊椎动物和人等高等真核生物中，而不存在于酵母、果蝇和线虫等低等真核生物(图1e)。
[0180]
2、人endod1核酸内切酶的特性与翻译后修饰。
[0181]
免疫蛋白质印迹测定rpe-1细胞中endod1核酸内切酶的蛋白质产物(图2c)，其主带电泳大小约55kd。蛋白质电泳显示endod1核酸内切酶的蛋白质有4种修饰或剪切亚型，分别为47kd(残基23-500，b)、42kd(残基23-340，c)、35kd(残基23-290，d)和》90kd的共价修饰形式(e)。和》90kd的共价修饰形式(e)。cispr/cas9基因编辑(图2a)或sirna基因沉默(图2b)后，endod1核酸内切酶的各种电泳形式均消失或减少(图2d-e)。将泛素(ubiquitin)或其k48r、k63r突变体与信号肽缺失的endod1核酸内切酶表达质粒(flag-δn22-endod1核酸内切酶)转入rpe-1细胞，发现endod1核酸内切酶亚型e是由于泛素化共价修饰产生(图2f)。通过predisci和netsurfp-2.0等生物信息学软件解析endod1核酸内切酶的蛋白质结构特征，发现残基300-325是蛋白质低序区，也是潜在的蛋白酶切位点(图2g-h)，可与残基22附近的leg-rl信号肽序列的酶切活动共同产生endod1核酸内切酶蛋白质的b、c、d亚型。
[0182]
实施例2、人endod1核酸内切酶参与dna修复。
[0183]
实验方法：采用免疫荧光、染质免疫共沉淀(chip)和核质分离的方法表征endod1核酸内切酶蛋白质的亚细胞定位和分布。chip实验在diva细胞中开展，由4-oht诱导asisi-er核酸内切酶的表达，在染体chr1:89,458,595-89,458,603处产生dna断裂。4-oht诱导4小时后，利用特异性抗体(抗endod1核酸内切酶或抗flag)沉淀相应蛋白质。通过pcr扩增确定蛋白质在dna断裂位点处的富集水平。细胞成分分离实验(细胞浆/核膜/染质)参照文献描述的方法(参见：yu,z.,z.huang,and m.j.b.p.lung,subcellular fractionation of cultured human cell lines.bio protocol，2013.3(9))，增加0.1％triton-x100溶解核膜和高尔基体的步骤。
[0184]
免疫荧光
[0185]
通过常规细胞培养将细胞固定培养于玻璃扒片上，利用4％pfa固定细胞10分钟，pbs洗涤后用0.3％triton/pbs打孔细胞。将一抗按比例稀释于封闭缓冲液(2％bsa，0.3％
triton/pbs)中，37℃孵育细胞3分钟后pbs洗涤2次。将二抗按比例稀释于封闭缓冲液(2％bsa，0.3％triton/pbs)中，再次于37℃孵育细胞30分钟后pbs洗涤2次。利用含有dapi的抗淬灭染料(vector laboratories)封片后于正置荧光显微镜(奥林巴斯，bx51)下观察，采集图片。计数细胞核中(dapi染)灶点个数，graphpad prism(v8.4.0.671)软件可视化计数结果，组间差异使用双尾t检验，p≤0.05认为存在显著差异。
[0186]
染质免疫共沉淀(chip)
[0187]
收集约500万细胞于终浓度1％甲醛中交联15min，加入2.5m甘氨酸终止交联，pbs洗涤两次后重悬于300ul chip裂解液(50mm hepes[ph 7.4]；140mm nacl；1％triton x100；0.1％nadeoxycholate；protease inhibitors)中，4℃裂解30分钟，10000x g离心后将沉淀于1ml chip裂解液中洗涤一次，重新重悬于300ul chip裂解液中，biorupter超声破碎仪打断dna于500bp左右，21000x g离心弃去沉淀，抗体孵育1h后加入protein g磁珠(invitrogen)，或直接加入anti-flag m2磁珠(sigma)，4℃过夜孵育。依次用chip裂解液、chip高盐裂解液(50mm hepes[ph 7.4]；500mm nacl；1％triton x100；0.1％nadeoxycholate)、chip洗涤液(10mm tris[ph 8.0]；250mm licl；0.5％np-40；0.5％nadeoxycholate；1mm edta)、te缓冲液(10mm tris-hcl[ph 8.0]；1mm edta)洗涤磁珠2次后加入chip洗脱缓冲液(50mm tris[ph 8.0]；1％sds；10mm edta)于65℃逆交联1小时，洗脱的液体采用dna纯化试剂盒(omega)纯化回收于30ul水中，取5ul进行定量分析。
[0188]
核质分离
[0189]
收集约200万细胞，pbs洗涤两次后重悬于200μl裂解液a(10mm hepes[ph 7.9],10mm kcl,1.5mm mgcl2,0.34m sucrose,10％glycerol,1mm dtt,0.1％triton，protease inhibitor)中，冰上孵育5分钟后1500x g离心5分钟，分别收集上清和沉淀。上清部分为细胞膜及胞浆蛋白，直接加入50μl 5 x sds上样缓冲液抽提蛋白质。沉淀于1ml不含triton的裂解液a中洗涤一次，1500x g离心5分钟后重悬于200μl裂解液a中，冰上孵育5-10分钟后1500x g离心5分钟。上清部分为核膜部分，直接加入50μl 5 x sds上样缓冲液抽提蛋白质。沉淀于1ml不含triton的裂解液a中洗涤一次，1500x g离心5分钟后重悬于200μl裂解液b(3mm edta,0.2mm egta,1mm dithiothreitol,protease inhibitor)中，冰上孵育10分钟，2000x g离心5分钟。上清部分为可溶性细胞核蛋白，直接加入50μl 5 x sds上样缓冲液抽提蛋白质。沉淀于1ml裂解液b中洗涤一次，13000x g离心1分钟，弃去上清，沉淀溶解于100μl sds上样缓冲液中。将所有样品于100℃金属浴处理5分钟，利用蛋白质免疫印迹检测。total：细胞总蛋白，上样量为总量的2.5％；membrane：核膜及高尔基体等，上样量为总量的10％；chromatin：染质蛋白，上样量为总量的10％。
[0190]
实验结果：
[0191]
为了解析endod1核酸内切酶的生物学功能，本发明通过一系列生物学实验证实endod1核酸内切酶在dna损伤位点聚集并活化，参与dna修复，保证遗传物质的稳定性。
[0192]
1、人endod1核酸内切酶直接结合于dna损伤位点
[0193]
当dna受到损伤时，参与dna修复的蛋白质会活化，并聚集到损伤位点，这种聚集可以通过免疫荧光染的方法，显示各种信号和修复因子在dna损伤后的定位改变。免疫荧光显示，endod1核酸内切酶在正常生长的细胞中主要定位于细胞浆和核膜。在dna损伤后(离子射线照射)，endod1核酸内切酶可在40分钟内进入dna断点形成endod1核酸内切酶聚集
点，并持续存在到照射后2小时(图3a)。endod1核酸内切酶也可以在dna复物(cpt和hu)处理后形成聚集点，说明endod1核酸内切酶也参与dna复制错误的清除(图3b)。并且，endod1核酸内切酶在dna断裂处的聚集点，可以与dna损伤位点的经典标记蛋白(γh2ax)共定位(图3c)，说明dna损伤后，endod1核酸内切酶作为修复因子积极地招募到dna断点。
[0194]
2、endod1核酸内切酶直接结合dna断点末端
[0195]
chip实验中，endod1核酸内切酶在距离dna断点0.5kb、1kb和2.5kb处结合(图3d)，进一步证明endod1核酸内切酶向dna损伤位点末端的直接聚集。chip实验还证明，endod1核酸内切酶在dna断点的功能之一是参与dna末端回切(end resection)：虽然endod1核酸内切酶单独沉默没有减弱单链dna结合蛋白(rpa32)在断点附近的富集，但是在其他末端回切调控因子(如wdr70)缺陷的情况下，endod1核酸内切酶沉默则可以加剧rpa32向dna断点的富集，导致rpa32的招募被完全抑制(图3e)。这些实验说明同源重组修复和endod1核酸内切酶功能同时缺失导致严重的dna修复缺陷。
[0196]
通过细胞浆-核膜-染质成分的分离实验，证明endod1核酸内切酶蛋白质的a、b、c、d形式可与染质紧密结合，endod1核酸内切酶在染质上的分布占总蛋白的25％(图3f)。
[0197]
总之，这些结果表明endod1核酸内切酶蛋白在细胞dna损伤后积极响应并招募到dna断点，参与dna修复的应答调控。
[0198]
实施例3、人endod1核酸内切酶抑制ssa修复功能。
[0199]
实验方法：采用i-sce1核酸内切酶定点诱导dna断裂(参见：liu,j.,et al.,development of novel visual-plus quantitative analysis systems for studying dna double-strand break repairs in zebrafish.j genet genomics,2012.39(9):p.489-502.)，荧光定量pcr测定hr，nhej和ssa修复的相对效率。采用可被多西环素诱导表达的野生型(plvx-tre3g-endod1核酸内切酶，即endod1核酸内切酶)或突变型endod1核酸内切酶质粒(plvx-tre3g-endod1核酸内切酶失活,即nd；plvx-tre3g-endod1核酸内切酶缺失，即δend)对endod1核酸内切酶缺陷细胞(2f4)进行功能互补实验(complementation)。通过免疫荧光实验测定endod1核酸内切酶缺陷的细胞在dna损伤后(ir)，各种相关的dna修复因子在dna损伤位点的聚集能力。
[0200]
dna断裂修复效率的测定
[0201]
利用i-sce1核酸内切酶(neb)体外酶切pcdna3-nhej、pcdna3-hr、pcdna3-ssa质粒(16℃，16小时)，加入2倍体积的无水乙醇和1/20体积的3m醋酸钠沉淀dna。将回收的dna调整至浓度1μg/μl。细胞首先通过sirna或其他处理，24小时后将线性化的pcdna3-nhej、pcdna3-hr、pcdna3-ssa质粒分别转染(lipo3000)至不同处理的细胞中，继续培养24小时后收集细胞(约100万)，利用高纯度dna提取试剂盒(roche)回收细胞总dna，进行实时荧光定量pcr(bio-rad)，并分析不同修复途径的效率。
[0202]
endod1核酸内切酶及其突变质粒的构建和表达
[0203]
endod1核酸内切酶基因及其相应突变体nd和δend均通过dna合成的方式获得(上海生工生物工程股份有限公司)，pcr扩增后通过ecor1位点亚克隆到plvx-tre3g载体上。将相应的质粒与plvx-tet3g共转染(lipo3000)至细胞内，培养24小时后利用多西环素(200ng/ml)诱导相应基因的表达。
[0204]
实验结果：
[0205]
dna断裂损伤主要通过非同源末端链接(nhej)、同源重组(hr)和单链dna融合(ssa)三种途径进行修复，并受到多种修复因子的调控，其中，dna末端回切形成单链dna的程度是选择这些修复途径的重要调控事件。在实施例2中发现的基础上，更多的实验证明endod1核酸内切酶直接募集到dna断点并调控dna末端回切，是调控修复途径选择的重要分子。
[0206]
1、endod1核酸内切酶抑制ssa修复通路
[0207]
通过体外i-sce1酶切pcdna3-nhej、pcdna3-hr、pcdna3-ssa质粒形成带有位点特异性dna断裂的线性化质粒，并转染至沉默endod1核酸内切酶基因的rpe-1细胞中，可以测定dna断点三种途径的修复效率。发现endod1核酸内切酶基因沉默可以略微抑制非同源末端链接(nhej)和同源重组(hr)修复功能，更主要的是促进单链dna融合(ssa)的功能(图4a)。同样地，在rpe-1野生型、2f4和2f6细胞中测试i-sce1诱导dna断裂的修复效率，也发现endod1核酸内切酶缺陷的2f4和2f6细胞株中ssa的修复效率比野生型rpe-1细胞显著升高(图4b)。这些结果说明endod1核酸内切酶因子在dna损伤位点可以抑制ssa的修复通路。
[0208]
2、endod1核酸内切酶通过其核酸内切酶功能有效抑制ssa修复通路
[0209]
在endod1核酸内切酶基因敲除的2f4细胞中转染可被多西环素诱导表达的野生型endod1核酸内切酶质粒(wt)，可减低ssa水平至正常细胞的水平；而引入核酸内切酶失活的endod1核酸内切酶突变质粒(nd和δend)则没有相应的纠正功能(图4c)，说明endod1核酸内切酶依赖其核酸内切酶活性抑制ssa修复通路。
[0210]
3、endod1核酸内切酶通过调控rad52抑制ssa功能
[0211]
rad52是调控ssa修复的重要蛋白，为分析endod1核酸内切酶参与ssa通路的具体功能，在rpe-1细胞沉默endod1核酸内切酶和/或ssa功能基因(rad52)，测试二者在i-sce1诱导dna断裂后的修复功能，发现rad52沉默可以彻底逆转endod1核酸内切酶缺陷导致的ssa功能亢进(图4d)，说明endod1核酸内切酶抑制ssa的功能依赖于rad52.
[0212]
免疫荧光实验显示endod1核酸内切酶基因敲除(图4e)或沉默(图4f)的rpe-1细胞表现处较高水平的ir诱导的rad52聚集点的形成，进一步证明endod1核酸内切酶抑制rad52在dna断点的修复功能。与野生型rpe-1相比，2f4和2f6均有rad52功能亢进的缺陷，说明除了endod1核酸内切酶蛋白质的主带(55kd)，其翻译后加工和b、c、d亚型也参与了rad52和ssa的调控。
[0213]
4、endod1核酸内切酶对其他dna修复因子的调控作用
[0214]
在rpe-1细胞中沉默endod1核酸内切酶基因表达48小时进行ir处理，测定各种dna修复因子在损伤位点的聚集水平。发现γh2ax/53bp1(图5a)、fk2(图5b)、blm(图5d)和mre11(图5e)的聚集水平在沉默或编辑了endod1核酸内切酶的rpe-1细胞中低于野生型细胞，而atm自身磷酸化的聚集能力反而在缺陷细胞中增高(图5c)。这些结果说明endod1核酸内切酶与mre11、fk2、blm、γh2ax和53bp1共同调控dna修复，而与atm的自身磷酸化功能互相拮抗。
[0215]
由此可见，endod1核酸内切酶的主要功能是参与dna断裂修复，和mre11、γh2ax和53bp1等协同作用，抑制rad52调控的ssa途径，并且该过程依赖于其核酸内切酶活性。
[0216]
实施例4、endod1核酸内切酶具有核酸内切酶活性。
[0217]
实验方法：
[0218]
endod1核酸内切酶-strep蛋白的表达与纯化
[0219]
endod1核酸内切酶基因全长及其突变体通过pcr扩增后亚克隆到pgex4t1-2strep载体上，并转化至bl21大肠杆菌菌株中。将带有endod1核酸内切酶质粒的细菌在37℃培养至对数生长期(od＝0.6)，加入1mm iptg诱导蛋白表达，18℃继续培养16小时后离心收集细菌。将菌体重悬于netn裂解液(100mm nacl，20mm tris-cl[ph 8.0],0.5mm edta 0.5％nonidet p-40)中,利用超声破碎细胞后21000x g离心，收集上清。在上清中加入netn裂解液预先洗涤过的strep-tactin xt磁珠(iba)，4℃中孵育2小时后弃去上清，利用netn裂解液洗涤磁珠5次，加入sds上样缓冲液提取纯化蛋白。通过蛋白质免疫印迹检测纯化的蛋白。
[0220]
dna体外切割反应
[0221]
dna双链片段(28-30bp)或dna/rna杂交链(30bp)由上海生工生物工程有限公司合成。利用限制性内切酶apai、bamhi和smai切割pegfp质粒获得带有dna双链断裂(5’、3’overhang和平末端)的质粒，并通过紫外线(1200j/m2)和过氧化氢(0.03％，1h)处理得到损伤质粒。利用dna纯化试剂盒回收处理后的dna，并进行酶切反应，反应总体积共20微升：50mm tris-hcl[ph 7.9]、100mm nacl、10mm mgcl2、100μg/ml bsa、0.5μg endod1蛋白质，0.2μg(质粒)或0.4μg(合成双链dna片段)底物，37℃体外消化16小时(质粒)或4小时(合成双链dna片段)后进行琼脂糖凝胶或测序胶电泳，利用gel-stain染料对dna染并采集图像。
[0222]
实验结果：endod1核酸内切酶具有经典的核酸内切酶结构域，为验证其核酸内切酶的活性，我们利用细菌表达并纯化了endod1核酸内切酶-strep蛋白质，包括endod1核酸内切酶全长(fl)和多肽片段(1-344、22-344)(图6a)，并检测其对不同类型dna的酶切反应。0.5微克endod1的核酸内切酶结构域片段(22-344残基)与0.37微克dna双链片段(平末端、3’和5
’‑
overhang)或dna/rna杂交链，在酶切缓冲液中进行体外消化反应(37℃，2小时)。该endod1片段可以切割这些核酸底物，形成较小的片段(图6b)。0.5微克纯化endod1核酸内切酶(1-344残基和全长(fl))加入0.2微克各种pegfp-c3质粒dna，在缓冲液中进行体外消化反应(37℃，16小时)结果表明endod1核酸内切酶可以切割带有结构损伤的dna分子，如紫外线损伤、dna双链断裂(5’和3’overhang)、氧化损伤(过氧化氢处理)，而对完整质粒没有切割效应(图6c)。
[0223]
实施例5、endod1核酸内切酶基因功能抑制特异性攻击肿瘤细胞，但不影响正常非肿瘤细胞的增殖。
[0224]
实验方法：在正常或肿瘤细胞中敲除或沉默endod1核酸内切酶基因，并将细胞连续传代或沉默，测定其增殖曲线，多数细胞实验周期为21天。在所示时间点和实验终点计算存活细胞数并存图记录。根据细胞计数结果计算增值率：增值率＝(n
t-n0)/n
t
*100％，其中n
t
是实验终点细胞计数绝对值，n0是初始细胞接种数。所有测定细胞系对照组与实验组实验终点增值率进行双尾t-test检验。p《0.05认为有显著统计学差异。
[0225]
结晶紫染：
[0226]
甲醇溶解10g结晶紫(solarbio,c8470)粉末配制为10％储存液。细胞实验终点时用甲醇固定10分钟，晾干。结晶紫存储液按1：10用pbs稀释配制为工作液。固定完成细胞样本用工作液染10min,清水洗净，晾干。观察并扫描存图。
[0227]
实验结果：
[0228]
dna损伤应答是真核细胞维持基因组稳定性的重要机制，当损伤不能正常修复时将导致细胞死亡。实施例3已经证实，endod1核酸内切酶基因的沉默导致rad52调控ssa通路异常，影响dna修复，可能影响细胞的存活。因此，我们利用细胞增殖实验测定endod1核酸内切酶对不同种类细胞增殖能力的影响，发现了endod1核酸内切酶基因沉默对肿瘤细胞的特异性抑制作用，但不影响正常细胞的生存，表明endod1核酸内切酶功能抑制具有潜在的肿瘤效果。具体结果如下：
[0229]
1、endod1核酸内切酶基因敲除或沉默不影响正常非肿瘤细胞的增殖
[0230]
正常体细胞(rpe-1、mrc-5、ges-1和l02)在沉默或敲除endod1核酸内切酶基因表达后，测定其21天的增殖曲线(图7a-b)。可见endod1核酸内切酶野生型与基因功能抑制的非肿瘤细胞的增殖速率没有统计学差异(ns)。
[0231]
2、endod1核酸内切酶基因沉默抑制肿瘤细胞的增殖
[0232]
图8a所示各种肿瘤细胞沉默endod1核酸内切酶后，其增殖表现出完全或部分抑制，甚至细胞死亡，并具有统计学差异；少部分肿瘤在endod1核酸内切酶沉默后其增殖不受影响(图8a-c)。并且，可以证明在对endod1核酸内切酶不敏感的细胞(ho8910-pm、sw480、ges-1和l02)中，endod1基因表达可以被有效沉默(图8d)，说明这些细胞不是由于基因转染的困难对siendod1体现出抗性，而是由于其他遗传学的机制表现出生存差异。
[0233]
3、endod1核酸内切酶功能减低对肿瘤细胞的毒性依赖于核酸内切酶活性
[0234]
在skov3细胞中沉默endod1核酸内切酶(si001)，同时转染多西环素诱导的并且抗si001的endod1核酸内切酶野生型或核酸内切酶突变体(nd)，发现endod1核酸内切酶野生型质粒可以拯救si001的细胞毒，而核酸内切酶功能缺失的endod1核酸内切酶质粒则没有拯救能力(图8e)，说明endod1核酸内切酶对肿瘤细胞的毒性需要功能性的endod1核酸内切酶活性。
[0235]
4、endod1核酸内切酶功能减低对肿瘤细胞的毒性依赖于ssa活性的增高
[0236]
在skov3细胞中发现同时沉默rad52基因表达可以减低endod1沉默对skov3的毒性(图8f)。说明endod1核酸内切酶对肿瘤细胞的毒性依赖于rad52的功能，也说明ssa功能的亢进可以介导的endod1核酸内切酶对肿瘤细胞的毒性。
[0237]
因此，实施例5说明可以通过给对象服用足够剂量的endod1核酸内切酶抑制物，可以特异性地或预防肿瘤，但对正常非肿瘤细胞没有杀伤作用。同样的原理也适用于可以提高ssa活性的药物(ssa增强剂),因为可以预测endod1抑制物能够有效增强ssa的活性，杀伤肿瘤依赖于ssa(如rad52)活性的增高，并且增高ssa修复水平也可以获得与抑制endod1核酸内切酶功能或基因表达相似的细胞毒效应。因此可以推断其他ssa增强剂也应该具有同样的效果。
[0238]
实施例6、endod1核酸内切酶与dna损伤应答和同源重组修复基因的联合致死效应。
[0239]
实验方法：在rpe-1和2f4细胞中将endod1核酸内切酶与其他功能基因共同沉默，或与酶抑制剂连用，采用细胞计数或结晶紫染方法测定细胞增殖能力。
[0240]
实验结果：
[0241]
大多数肿瘤细胞存在dna损伤修复的缺陷，为研究endod1核酸内切酶基因缺失特
异性抑制肿瘤细胞增殖的机制，本发明利用基因沉默或酶抑制剂干扰dna损伤应答或修复因子的功能，模拟肿瘤细胞内的dna应答缺陷，发现endod1核酸内切酶基因沉默与包括atm、chk1和同源重组修复因子在内的大多数dna损伤应答因子的缺陷联合致死，具体结果如下：
[0242]
1、endod1核酸内切酶基因沉默与dna损伤应答因子联合致死。
[0243]
rpe-1和2f4细胞加入dna损伤应答因子的抑制剂，包括atm激酶抑制剂(ku55933，20um)；pikk抑制剂(cgk733，1ug/ml)；atr抑制剂(caffeine，10ug/ml)；dnapk激酶抑制剂(nu7026,1um)；chk2激酶抑制剂(bml-277,1um)；mre11核酸酶抑制剂(mirin 20um)；或用sirna沉默chk1表达。12天后进行活细胞染，发现endod1核酸内切酶基因沉默与atm抑制剂、mre抑制剂和chk1沉默对rpe-1细胞联合致死(图9a)。提示endod1核酸内切酶功能抑制可以针对atm、mre11和chk1基因突变或功能障碍的肿瘤产生选择性作用。
[0244]
因此，可以通过给对象服用足够剂量的endod1核酸内切酶抑制物endod1或ssa增强剂，用于或预防带有dna应答缺陷的肿瘤，包括带有atm、atr、chk1、chk2、dnapk基因突变、基因表达或功能缺陷，或者带有cdc25a、cdc25b、cdc25c、cyclin e、cyclin b1、cyclin d1过表达特征的肿瘤。
[0245]
2、endod1核酸内切酶基因沉默与同源重组修复因子联合致死。
[0246]
rpe-1细胞中沉默endod1核酸内切酶基因表达，同时沉默brca1、brca2、blm、mre11、ctip、exo1、msh1、arid1a/rid1b和wdr70等dna修复基因，测定其增殖能力(图9b-c)。endod1核酸内切酶与brca1、brca2、ctip、exo1、arid1a/rid1b和wdr70基因共同沉默表现出联合致死，但与blm没有显著联合的致死效应。此外，3条特异性的endod1核酸内切酶sirna均可与sibrca1产生联合致死效应(图9d)，endod1核酸内切酶敲除的2f4细胞也与brca1和fancd2/fancc基因沉默联合致死(图9e)。进一步证实了endod1核酸内切酶与同源重组修复因子的联合致死效应。这些证据说明抑制endod1核酸内切酶基因表达或蛋白质功能可以针对带有brca1、brca2、fanc、ctip、exo1、arid1a/rid1b和wdr70等同源重组基因突变或功能障碍的肿瘤有选择性作用。
[0247]
因此，可以通过给对象服用足够剂量的endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，用于或预防带有dna损伤修复缺陷的肿瘤，包括同源重组修复缺陷、碱基切除修复缺陷、核苷酸切除缺陷、单链dna断裂修复的缺陷，以及带有与这些修复机制相关的基因突变或功能缺陷的肿瘤。这些肿瘤包括但不限于如下特征：dna连接酶i、dna连接酶ii、dna连接酶iii、dna连接酶iv、brca1、brca2、ptip、wrn、fanconi、emsy、arid1a、arid1b和wdr70等基因突变、基因表达或功能缺陷；或抑制dna修复功能的癌基因过表达，如cdk12；或带有乙型肝炎病毒感染和病毒基因表达的肝癌或胆管细胞癌。
[0248]
实施例7、endod1核酸内切酶与抑癌基因的联合致死效应。
[0249]
实验方法：在rpe-1或肿瘤细胞中将endod1核酸内切酶与tp53功能基因共同沉默，测定细胞增殖能力。将tp53表达质粒转入肿瘤细胞，同时沉默endod1核酸内切酶基因表达，细胞计数或者结晶紫染测定恢复功能的tp53基因对endod1核酸内切酶细胞毒性的拯救效应。
[0250]
实验结果：
[0251]
1、endod1核酸内切酶与抑癌基因tp53联合致死效应
[0252]
大量的研究表明，tp53、pten等是重要的抑癌基因，在60-80％的人类肿瘤中存在
突变或失活。为进一步了解endod1核酸内切酶基因沉默特异性抑制肿瘤细胞增殖的机制，在rpe-1野生型中沉默endod1核酸内切酶和tp53基因，或和endod1核酸内切酶基因敲除(2f4)细胞中沉默tp53后测定细胞存活。发现endod1核酸内切酶功能障碍导致细胞对tp53基因功能的丢失高度敏感(图10a)。同样的，在tp53高水平的细胞系(ho8910-pm)中同时沉默endod1核酸内切酶和tp53，发现细胞丧失活力和增殖能力(图10b)。说明完整的endod1核酸内切酶基因功能在tp53突变或功能丢失的肿瘤细胞中是维持活力的必需因子。
[0253]
2、在tp53突变细胞中恢复tp53功能可以抑制沉默endod1核酸内切酶的细胞毒效应
[0254]
进一步地，通过质粒转染表达野生型tp53，发现带有tp53基因纯合突变、且对endod1核酸内切酶基因沉默敏感的细胞系(nci-h1975)变得不再敏感，说明恢复tp53的功能可以有效地消除endod1核酸内切酶功能抑制对丢失tp53功能的肿瘤细胞的细胞毒性作用(图10c)。这些实验进一步说明tp53基因功能的缺失直接导致肿瘤细胞对endod1核酸内切酶功能抑制的敏感性，也提示endod1核酸内切酶功能抑制可以针对tp53基因突变或功能障碍的肿瘤有选择性作用。
[0255]
3、其他抑癌基因与endod1核酸内切酶基因沉默的联合致死效应
[0256]
在rpe-1和2f4细胞中沉默pten抑癌基因，发现2f4对pten沉默具有相对较高的敏感性(图10d)。说明抑制除tp53之外的抑癌基因也可以与抑制endod1核酸内切酶功能联合致死。
[0257]
因此，可以通过给对象服用足够剂量的endod1核酸内切酶抑制物或ssa增强剂，用于或预防带有tp53、pten等抑癌基因突变、基因表达或功能缺陷的肿瘤。
[0258]
实施例8、肿瘤细胞基因突变与endod1核酸内切酶基因沉默细胞毒的相关性分析。
[0259]
实验方法：
[0260]
采用免疫印迹检测人正常和肿瘤细胞系的endod1核酸内切酶的蛋白质水平。从human protein atlas数据库中收集正常和肿瘤组织中endod1核酸内切酶的蛋白质丰度。
[0261]
增殖抑制率的计算
[0262]
表3所示肿瘤细胞增殖的抑制率的计算公式：抑制率＝(1-nt/nc)％；其中nt表示实验终点用药组细胞计数，nc表示实验终点对照组细胞计数。
[0263]
实验结果：
[0264]
1、免疫印迹检测到endod1核酸内切酶蛋白质在不同组织来源的正常(rpe-1、)和肿瘤细胞系(skov-3、nci-h1975、nci-h1299、hl60、mrc-5、rpe-1、mda-mb-231、u2os、mda-mb-468、raji、ovcar-8tr)中普遍表达(图11a)。
[0265]
2、human protein atlas数据库显示endod1核酸内切酶在多数正常组织中呈现中高水平的蛋白质表达(图11b)；endod1核酸内切酶在半数以上的肿瘤组织中也有显著的蛋白质表达水平(图11c)，包括神经胶质瘤、甲状腺癌、直肠癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑素瘤和皮肤癌等。endod1核酸内切酶在个别肿瘤中(如睾丸癌和淋巴瘤)则表达比例偏低。
[0266]
3、表3显示endod1核酸内切酶对所测试25种肿瘤细胞的细胞毒性以及细胞所携带的基因突变。统计学分析显示，带有tp53或其他基因突变(brca1、brca2，或者带有hbv、hpv病毒等)的肿瘤细胞，对endod1核酸内切酶基因沉默的敏感性远远高于没有携带这些变异
的肿瘤细胞(图11d)。进一步利用spss软件分析tp53突变及其他类型的肿瘤基因突变与endod1基因沉默抑制率之间的pearson相关系数，发现二者存在高度相关性(pearson correlation:0.708,p《0.0001)，表明带有这些变异的肿瘤细胞对endod1基因沉默的敏感性远远高于非突变细胞。
[0267]
表3、各种人正常及肿瘤细胞系的有关突变特征和endod1核酸内切酶基因沉默后对细胞增殖的抑制率。(wt:野生型；mu：突变型；null：全缺失突变；homo：纯和突变)
[0268]
[0269]
[0270][0271]
实施例9、endod1核酸内切酶功能抑制对肿瘤化学的增敏作用。
[0272]
实验方法：
[0273]
在24孔板中接种1万细胞(rpe-1或a549)，24小时后进行endod1核酸内切酶基因沉默实验，并进行持续的药物处理(药物浓度见图12)。实验终点(14天)计算细胞增殖倍数。
[0274]
实验结果：
[0275]
经endod1 sirna沉默后的正常细胞(rpe-1)对化疗药物、endod1基因沉默或者联合处理均不敏感(图12，左)，但是肿瘤细胞(a549)细胞对化疗药物较为敏感，并且在沉默endod1核酸内切酶后对喜树碱(cpt)、顺铂(cisplatin)、dnapk抑制剂(nu7062)的敏感性均大为提高(图12，右)。
[0276]
因此，给对象服用足够剂量的endod1核酸内切酶抑制物可以对低剂量的放化疗起到增敏作用，用于对放射或化疗药物单独无有效临床反应的肿瘤。潜在的联合药物包括从铂类、丝裂霉素c、喜树碱、parp抑制剂、dnapk抑制剂、放射性同位素、长春花生物碱、抗肿瘤烷基化药物、单克隆抗体、抗代谢药物。这些方法可以同时或先后使用，体现协同效应，使效果优于单独使用抑制endod1功能的药物或单独使用抗肿瘤药物的方法。
[0277]
实施例10、endod1核酸内切酶基因沉默对小鼠荷瘤模型的作用。
[0278]
实验方法：
[0279]
裸鼠荷瘤模型
[0280]
临床前动物荷瘤实验在四川大学华西第二医院实验动物中心进行(spf级)。周龄的无胸腺雄性裸鼠隔离观察一周后(购于南京模式动物研究中心)随机分为3组。每只小鼠
于腋下及腹股沟处接种肿瘤细胞，接种数量为4x106。
[0281]
体内基因沉默
[0282]
接种瘤体体积约100mm3时进endod1核酸内切酶体内基因沉默。具体用实施如下：超纯水(invitrogen,10977-015)溶解endod1核酸内切酶体内sirna粉剂及对照sirna粉剂(广州锐博)，配制成工作液(1ug/ul)置于-40℃保存。超纯水配制10％葡萄糖，过滤，置于-40℃保存备用。体内基因沉默采用尾静脉注射方式给药，给药频率为2次/周。注射液配制后需立即注射。每只小鼠注射液具体配制如下：sirna 50ul与10％葡萄糖50ul混匀制成1液，超纯水25ul与10％葡萄糖50ul及25ul体内转染试剂(engreen,18668-11-1)混合制成2液，静置2min,混合1液与2液，静置15min。
[0283]
肿瘤测量和统计学分析
[0284]
自给药起始日开始测量肿瘤大小，测定频率为3-5天。使用游标卡尺测量肿瘤体表长宽。实验结束后整理数据，根据《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导》按以下标准计算并评价用药效果：肿瘤体积计算公式:v＝1/2
×a×
b2。其中a和b分别表示肿瘤体表长，宽。肿瘤药效评价公式：相对肿瘤增殖率t/c％＝trtv/crtv*100％。t/c％《40％即可评判该方法有效。t/c％值越低药效越显著。其中，trtv表示组rtv；crtv表示阴性对照组rtv。rtv表示相对肿瘤体积(relative tumor volume，rtv)，其计算公式：rtv＝vt/v0。其中v0为初始肿瘤体积，vt观察时间点肿瘤体积。本实验中vt为设定的实验终点对应小鼠肿瘤体积。
[0285]
本实施例中实验终点对照组与实验组差异比较采用t-test双尾检验，p》0.05则显示两组间有明显差异。实验周期设定为21天。根据伦理要求，对于未达到21天实验终点时，小鼠肿瘤体积大于等于2000mm3同样需处死小鼠，终止该样本继续实验。
[0286]
实验结果：
[0287]
endod1核酸内切酶沉默实验组中小鼠肿瘤的生长与对照组相比被明显抑制。动物模型有效证明endod1核酸内切酶基因沉默对多种tp53缺陷型(skov3，hcc1937，ovcar-8tr)、brca1缺陷(hcc1937，brca1纯和突变)可产生显著抑制效果(图13a)，其抑制率(t/c％)分别为skov3，15.2％；hcc1937，23.7％；ovcar-8tr，25.7％(t/c％≤40％表明该药物对肿瘤有显著疗效)(图13b)。
[0288]
因此，可以通过给对象服用足够剂量的endod1核酸内切酶抑制物，用于带有相应基因、遗传、蛋白质功能缺陷的肿瘤。
[0289]
实施例11、endod1核酸内切酶功能抑制对活动性乙肝病毒的作用。
[0290]
之前发现表明，乙型肝炎病毒编码癌基因(hbx)通过破坏crl4wdr70泛素酶抑制同源重组修复(参见：ren,l.,et al.,the antiresection activity of the x protein encoded by hepatitis virus b.hepatology,2019.69)。本实施例通过测定hbv阳性细胞对endod1核酸内切酶基因沉默的敏感性，证明endod1核酸内切酶功能抑制可以控制hbv感染指标。
[0291]
实验方法：
[0292]
细胞增殖实验：
[0293]
在24孔板中接种5万细胞，24小时后开始进行基因沉默实验。实验周期设定为21天，每隔3天进行传代。每次传代后24小时进行endod1核酸内切酶sirna转染实验。传代时用
细胞计数器进行准确计数，记录，实验终点绘制增殖曲线。
[0294]
hbv阳性细胞动物模型实验：
[0295]
针对乙型肝炎病毒患者效果评价可以采纳检测血清中病毒拷贝数和表面抗原(hbsag)的检测指标。
[0296]
采用6周龄的无胸腺雌性裸鼠3只，每只小鼠于腋下及腹股沟处接种hepg2.2.15细胞，建立hbv小鼠感染模型，细胞接种数量为8x106。接种细胞后在不同时间点尾静脉血取血，使用乙型肝炎病毒(hbv)核酸扩增(pcr)荧光定量检测试剂盒监测血液中hbv拷贝数变化情况，待拷贝数升至血清中最高值4000ui/ml左右时开始体内沉默endod1核酸内切酶基因。
[0297]
具体用实施如下：超纯水(invitrogen,10977-015)溶解endod1核酸内切酶体内sirna粉剂及对照sirna粉剂(广州锐博)，配制成工作液(1ug/ul)置于-40℃保存。超纯水配制10％葡萄糖，过滤，置于-40℃保存备用。体内基因沉默采用尾静脉注射方式给药，给药频率为2次/周。注射液配制后需立即注射。
[0298]
每只小鼠注射液具体配制如下：sirna 50ul与10％葡萄糖50ul混匀制成1液，超纯水25ul与10％葡萄糖50ul及25ul体内转染试剂(engreen,18668-11-1)混合制成2液，静置2min,混合1液与2液，静置15min。
[0299]
1、2、3、4、5、7、9、15、20天尾静脉血取血，监测血清中hbv基因组拷贝数，并采用elisa方法检测hbsag滴度变化。第16天停药后，继续监测血清中拷贝数及hbsag滴度五天。结果时间点做滴度曲线图。如无特殊说明，本实施例中细胞实验与动物学实验所有组间差异计算均采用t-test双尾检验。p》0.05则显示两组间有明显差异。
[0300]
实验结果：
[0301]
1、同时沉默endod1核酸内切酶与wdr70的联合致死效应
[0302]
在正常肝细胞(l02)中沉默endod1核酸内切酶和/或wdr70，测定细胞增殖曲线。发现endod1基因沉默对l02细胞没有明显毒性，但可以与siwdr70联合抑制细胞的增殖(图14a)。说明抑制endod1核酸内切酶与wdr70功能具有联合致死效应。
[0303]
2、沉默endod1核酸内切酶对hbv阳性细胞的细胞毒效应
[0304]
在整合hbv基因组的肝细胞(t43)中沉默endod1核酸内切酶基因表达，测定细胞克隆形成的能力(图14b)，发现endod1基因沉默可以有效清除t43细胞，而相同处理下的正常肝细胞(l02)的克隆形成则完全不受影响。裸鼠皮下接种t43建立肿瘤模型，发现endod1基因沉默可以有效抑制t43肿瘤的生长(图14c)，说明抑制endod1核酸内切酶的功能可以清除带有crl4wdr70功能缺陷的hbv阳性细胞。
[0305]
3、沉默endod1核酸内切酶降低hbv感染指标
[0306]
裸鼠尾静脉接种hepg2.2.15，elisa方法测定所示时间点的血清中hbv抗原(hbsag)的滴度，以及荧光定量pcr方法测定血清中hbv病毒dna的滴度。实验发现endod1核酸内切酶的体内沉默可以使模型小鼠血清中的hbv-dna含量及hbsag抗原od值由～1.5(此时血清中hbsag抗原含量达到最高值，表示hepg2.2.15细胞肝癌小鼠模型中，病毒进入稳定的高水平活跃复制期)左右降至0.05，接近或低于临床阴性(》0.05，此时od值为检测最低阈值)的指标。在endod1核酸内切酶体内沉默停止5天内，小鼠血清中hbv拷贝数及hbsag表达则一直处于稳定的阴性范围之内。这些细胞学和动物学实验的结果显示：endod1核酸内切
酶体内沉默可以持久地清除hbv病毒感染的宿主细胞，提示下调endod1核酸内切酶的功能可以清除乙肝病毒感染者体内携带hbv或有hbx表达的肝细胞，实现对乙型肝炎病毒真正的临床治愈。
[0307]
因此，可以通过给对象服用足够剂量的endod1核酸内切酶抑制物，减低乙型肝炎病毒血清抗原指标和病毒滴度，根除或控制乙型肝炎病毒的感染。该方法还可以与多种抗病毒方法联合使用或形成组合物，例如抗病毒代谢药物、基因、dna、rna、靶向、佐剂和免疫等，这些方法可以同时或先后使用，使效果优于单独使用抑制endod1功能的药物或单独使用抗病毒药物的方法。
[0308]
实施例12、endod1核酸内切酶抑制剂的筛选流程。
[0309]
实验方法
[0310]
通过竞争性抑制法筛选抑制endod1核酸内切酶活性的小分子抑制剂。在384孔pcr裙边板(thermo，ab2384b)中加入0.1μg细菌表达的endod1蛋白质、100ng线性双链dna底物(序列：
[0311]
attctcagcctgaaagccaggttctagaggatgattctggttctcacttcagtatgctatctcgacaccttcctaatctccagacgcacaaagaaaatcctgtgttggatgttgtgtccaatcctgaacaaacagctggagaagaacgaggagacggtaatagtgggttcaatgaacatttgaaagaa)以及小分子抑制剂库或dmso对照，在cut smart缓冲液中37℃反应16小时。利用机械多道移液器(eppendorf)向每孔中加入等体积2x荧光定量pcr预混液(promega，包含以dna底物为模板的特异性引物，序列为f：5
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attctcagcctgaaagccagg-3’；r：5
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ttctttcaaatgttcattgaa-3’)，进行荧光定量pcr检测dna底物剩余量及酶切效率，筛选有效的小分子抑制剂。
[0312]
实验结果
[0313]
筛选及开发endod1抑制剂，可以通过以下几个方面实现：抑制endod1和/或其调控基因的表达水平；抑制endod1蛋白质的核酸内切酶活性，阻断其dna修复活性，破坏其亚细胞定位，破坏其泛素化、磷酸化等翻译后修饰；干扰endod1及其调控蛋白质的剪切和信号肽成熟等生物学功能等。
[0314]
通过抑制endod1蛋白的核酸内切酶活性，如图15所示，为endod1抑制剂筛选流程图。通过梯度降低endod1蛋白质浓度，利用荧光定量pcr检测酶切效率，dna底物剩余量应与endod1蛋白质浓度呈负相关，利用该方法可作为endod1核酸内切酶的体外药物筛选体系。

技术特征：

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cacgaaaccatggaaatta-3
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ccaattgtttagtgtctat-3’。

技术总结

本发明公开了一种ENDOD1核酸内切酶的抑制物和SSA增强剂，以及ENDOD1核酸内切酶抑制物和SSA增强剂在制造或预防人类肿瘤及乙型肝炎病毒感染疾病的药物中的用途。所述核酸内切酶为ENDOD1基因编码的核酸内切酶，所述抑制物抑制ENDOD1核酸内切酶的基因表达、活性和/或功能，所述SSA增强剂上调单链DNA融合修复(SSA)的活性或功能。所述ENDOD1核酸内切酶抑制物或SSA增强剂，可以有效抑制或杀伤带有DNA同源重组、DNA损伤应答、DNA损伤修复、抑癌基因的基因突变、基因表达或功能缺陷的肿瘤细胞，而对上述基因或功能正常的非肿瘤细胞没有毒性。非肿瘤细胞没有毒性。