一种冻干保护剂在含铝佐剂中的应用的制作方法

1.本发明属于疫苗佐剂冻干配方生产工艺技术领域，具体涉及一种冻干保护剂在含铝佐剂中的应用。

背景技术：

2.疫苗是目前预防传染病最有效的方法，如今大多数现代疫苗中的抗原是类毒素、多糖、蛋白质和病毒样颗粒，它们虽然更具安全性，但弊端是抗原的免疫原性差，通常需要添加额外的佐剂来引起保护性免疫反应。现代更安全的灭活疫苗、亚单位蛋白抗原疫苗通常需要添加佐剂，如羟基氧化铝，来提高免疫原性。自1926年以来，铝佐剂就被应用于与抗原结合，铝佐剂从20世纪初被提出，到现在长达八十几年的使用史充分证明了它的安全性和有效性，现在市售的大部分疫苗如乙肝疫苗、hpv疫苗、破伤风疫苗等都含有铝佐剂。铝佐剂通过与抗原的混合将抗原吸附，在体内形成抗原储库从而延长抗原在体内的停留时间；并在局部刺激相关细胞释放炎症因子，促进抗原提呈细胞进行抗原提呈、诱导产生多种免疫细胞、诱导 th2型免疫应答，比游离的抗原产生更有效的免疫应答。
3.在电力和运输基础设施有限的国家，在整个配送过程中维持制冷条件是不可行的，因此，提高药品的热稳定性是全球疫苗接种特别关注的问题。然而，据报道，全球疫苗总浪费量约为50％，而针对疫苗储存丢弃的剂量(因过期、热暴露、冻结等丢弃的所有未开封药瓶)为 37％。这导致在2018年估计有1940万婴儿无法接种基本疫苗。另外，世界卫生组织建议将所有疫苗储存在2-8℃的环境下，且储存保质期为2至3年。然而，将疫苗保存在冷藏温度以确保其有效性是一个巨大的挑战。甚至对于一些抗原来说，其并不具有2到3年的稳定性，因此，改进热稳定性可以大大提高疫苗的可用性。到目前为止，最常用的疫苗制剂类型有两种，分别为液体制剂和冻干制剂，而与液体疫苗相比，冻干疫苗将疫苗制成干粉，可以显著提高疫苗的热稳定性。除此之外，冻干疫苗还有相当多的优点：(1)疫苗制剂在预冻前完成分装，从而保证了剂量的精确性；(2)由于冻干是在真空和低温状态下完成的，因此不易发生氧化和热变性，可以最大限度地保持疫苗的理化性质和生物特性；(3)固态的冰晶升华成为水蒸气后形成的疏松多孔(海绵状)结构，使冻干疫苗具有极好的速溶性和复水性，可迅速吸水溶解；(4)冻干疫苗易进行无菌化操作，污染相对减少，临床应用效果好，过敏等副作用少；(5)冻干疫苗脱水彻底，含水量低，重量轻，适合长途运输及长期保存。
4.对于含铝佐剂，现有研究表明，免疫效力损失是由于佐剂悬浮液的冻结导致的佐剂颗粒团聚，因此我们总结了在冻干过程中佐剂的团聚的机制。1)根据dlov理论进行解释，粒子间有两种力作用于水介质中的粒子：吸引力(范德华)和斥力(静电)，预冻会使剩余液体部分中所有化合物的浓度迅速增加，减小的粒子距离有利于粒子间相互作用，因为吸引力可以克服导致粒子聚集的排斥力。被吸附的双电层进一步被压缩，导致颗粒距离减小，发生粒子聚集；2)粒子与液体接触表面会产生水化壳，液体水化壳的存在会阻碍粒子间的聚沉，而干燥过程使水化壳损失很可能导致粒子的损伤和聚集。
5.由于疫苗的应用越来越广泛，在其生产、运输贮存过程存在的稳定性问题也越来
越受到关注，冻干技术为疫苗稳定性提供了更有利的条件。干燥后蛋白药物呈疏松饼状，水分含量低、物理化学性质更稳定，可以延长保存期限，减轻重量降低运输成本等。但是冻干是复杂的相变过程，冻干制品在整个过程存在着各种应力，包括低温应力、冻结应力、干燥应力等，它们常常是导致制品中蛋白质变性的因素。目前使用的冻干工序大都较为复杂，因为冻干技术中的各项参数设置及变化，都会对冻干制品的质量产生明显影响，在冻干过程中，不恰当的温度和时间对疫苗质量会产生不良影响，导致疫苗失去活性。加入多种冻干保护剂以及赋形剂可以防止蛋白药物变性，但是冻干保护剂复杂的成分会容易引起不良反应，复杂的冻干工序也使冻干制剂成本变高。因此虽然已经有一些冻干疫苗制剂上市，但是生产高效、安全、免疫原性高、稳定性好的疫苗冻干制品仍然是一个亟待解决的问题。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种冻干保护剂在含铝佐剂中的应用，通过将就冻干产生的应力如何影响羟基氧化铝(alooh)纳米佐剂的结构这一过程的机制进行研究，并且针对这一机制，提出佐剂冻干保护方法，如添加合适的赋形剂或改进现有铝佐剂配方，以解决现有疫苗及生物制剂制备中的实际问题。
7.一种冻干保护剂在含铝佐剂中的应用，向含铝佐剂悬浮液中添加一定比例的冻干保护剂，超声确保分散均匀，冷冻干燥，制备得到均匀蓬松的含冻干保护剂的铝佐剂干粉；所述冻干保护剂种类为非离子型表面活性剂，具有4-7的多羟基结构，以及c
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的烷基链，冻干保护剂的质量分数为含铝佐剂悬浮液的0.05-5％，优选为0.05-0.15％。
8.作为优选，所述含铝佐剂悬浮液中含铝佐剂的浓度为1-10mg/ml。
9.作为优选，所述含铝佐剂为羟基氧化铝。
10.作为优选，所述羟基氧化铝的制备方法，包括以下步骤：
11.1)取无机铝盐完全溶解于去离子水形成透明澄清的铝盐溶液(即：前驱物溶液)；取无机铝盐完全溶解于去离子水的过程是在一定温度下进行搅拌、溶解的。
12.2)在上述铝盐溶液中均匀滴加碱性溶液，发生均匀沉淀并继续搅拌得混合液；
13.3)对上述混合液进行水热反应；
14.4)冷却、离心、洗涤、干燥得到最终的白粉末固体。
15.对于上文所述羟基氧化铝的制备方法的技术方案中，优选的情况下，本发明中的前驱物材料主要是但不限于硝酸铝，可以采用如氯化铝(alcl3)、硫酸铝(al2(so4)3)、异丙醇铝等常用铝盐的一种或其混合物。
16.对于上文所述羟基氧化铝的制备方法的技术方案中，优选的情况下，所述的沉淀剂是氢氧根离子沉淀剂。例如：包括但不限于氢氧化钠、氨水、乙二胺中的一种或其混合物。
17.对于上文所述羟基氧化铝的制备方法的技术方案中，优选的情况下，所述的铝盐溶液浓度为0.1-0.5m。
18.对于上文所述羟基氧化铝的制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的沉淀剂与铝盐的摩尔比为(1-3)：1；优先选择摩尔比比值≤2。
19.对于上文所述羟基氧化铝的制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的搅拌条件为：搅拌转速为200-1000rpm，优选300-600rpm；在室温下搅拌10-30min，优选20min。
20.对于上文所述羟基氧化铝的制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的滴加，是在前驱物溶液中有al离子的存在条件下，控制碱性溶液(作为沉淀剂)的滴加速率，采用逐滴滴加或以一定的速率滴加的方式，均可使沉淀剂与al离子发生均匀沉淀。
21.对于上文所述羟基氧化铝的制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤3)所述的水热反应温度为140-200℃，水热处理的时间为2-48。实施例中，所述混合液转移至聚四氟乙烯ptfe内胆的高压水热反应釜中完成水热反应。此处水热反应总体积为20ml-100l。
22.对于上文所述羟基氧化铝的制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤4)中，所述冷却为将水热处理后的混合液空冷降温至室温即可；所述的离心转速为4000-9000rpm，离心时间为5-20min；所述的洗涤目的是除去所含杂质，实施例中洗涤过程具体采用去离子水和乙醇分别水洗两到三次除去所含杂质；所述的产物最终干燥温度为50-100℃，进一步优选是在40-60℃下恒温干燥得到白固体粉末，最优选60℃。
23.作为优选，所述的表面活性剂可选择以下物质：辛基葡萄糖苷，蔗糖脂肪酸脂，烷基糖苷(如c
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烷基糖苷)，椰油基葡糖苷，棕榈酸蔗糖，蔗糖硬脂酸酯，蔗糖二硬脂酸酯。
24.所述辛基葡萄糖苷的结构式如下：
[0025][0026]
所述椰油基葡糖苷的结构式如下：
[0027][0028]
所述棕榈酸蔗糖的结构式如下：
[0029][0030]
所述蔗糖二硬脂酸酯的结构式如下：
[0031][0032]
作为优选，将含铝佐剂溶解于超纯水中，浓度在1-10mg/ml之间，得到含铝佐剂悬浮液。
[0033]
作为优选，所述冷冻干燥的具体过程如下：首先在-80～-60℃冰箱中进行速冻，并保持 20-25h，取出后于冻干机中进行真空冻干，维持-80～-60℃℃温度，冻干20-25h。
[0034]
本发明还涉及保护含冻干保护剂的铝佐剂干粉在疫苗制剂中的应用，可应用于多种疫苗制剂中，如白喉、破伤风和无细胞百日咳(dtap)疫苗、b型流感嗜血杆菌(hib)疫苗、乙型肝炎(hbsag)疫苗、甲型肝炎肺炎疫苗等。含铝佐剂的冻干保护剂可以应用于预防性和性的含铝佐剂疫苗的生产制备、运输储存。
[0035]
有益效果：
[0036]
本发明提供的冻干保护方法避免了在疫苗中使用的含铝佐剂冻干过程中的大量聚集、减少了冻干过程对羟基氧化铝佐剂表面结构的破坏。本发明制备的含冻干保护剂的铝佐剂干粉制剂，适合在较宽温度范围内保证铝佐剂疫苗制剂的长期稳定性。本发明可以提高含铝佐剂制剂在冷冻干燥过程中的稳定性，大大降低在冷链运输过程中由于温度变化导致的佐剂效用损失可能性，可以避免不必要的损失和严重后果，本发明有望对将铝佐剂用于制备冻干制剂提高冻干制剂的免疫原性打下基础。
附图说明
[0037]
图1为实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前(2h-rt)后(2h-fd)以及加入辛基葡萄糖苷保护剂冻干配方(2h-fd+ogp，实施例1)，加入常规海藻糖保护剂(2h-fd+trehalose，对比例1)冻干后的水合粒径分布结果图。
[0038]
图2为实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前(2h-rt)后(2h-fd)、含辛基葡萄糖苷保护剂(2h-fd+ogp，实施例1)冻干配方，以及加入常规海藻糖保护剂(2h-fd+trehalose，对比例1)冻干后的表面羟基滴定数据表征结果图。
[0039]
图3为实施例2中羟基氧化铝佐剂冻干前(2h-rt)后(2h-fd)以及含蔗糖脂肪酸酯保护剂冻干配方(2h-fd+0.05％s0112，实施例2)的水合粒径分布结果图。
[0040]
图4为实施例2中羟基氧化铝佐剂冻干前(2h-rt)后(2h-fd)以及含蔗糖脂肪酸酯保护剂冻干配方(2h-fd+0.05％s0112，实施例2)的表面羟基滴定数据表征结果图。
[0041]
图5为实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前(2h-rt)后(2h-fd)的xrd表征结果图，证明所用佐剂为羟基氧化铝佐剂，冻干后有相应变化。
具体实施方式
[0042]
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0043]
实施例1
[0044]
准确称量1.3933g九水合硝酸铝，在20ml去离子水溶液中，在溶解的过程中进行不断搅拌，搅拌速率控制在360rpm，待九水合硝酸铝完全溶解于去离子水形成透明澄清的前驱物溶液后，在2min中内缓慢滴加0.238ml乙二胺，此时可观察到溶液由透明溶液产生絮状白固体沉淀，继续搅拌30min，反应完全，停止搅拌，将得到的悬浊液于反应釜中200℃反应2h。待自然冷却至室温，反应产物使用去离子水和乙醇分别离心洗涤3次，60℃下恒温干燥，得到白粉末状固体，即为羟基氧化铝佐剂。取100mg合成的羟基氧化铝佐剂，加入 10ml超纯水、0.15％(15mg)的辛基葡萄糖苷(生工生物工程(上海)股份有限公司)超声至溶液均匀，在-80℃冰箱中进行速冻，并保持24h，取出后于冻干机中进行真空冻干，维持-80℃温度、0pa压力，冻干24h，得到蓬松均匀的白固体粉末。
[0045]
图1是实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前后以及加入辛基葡萄糖苷保护剂，加入常规海藻糖保护剂后的水合粒径分布结果图。图2为实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前后、含辛基葡萄糖苷保护剂冻干配方，以及加入常规海藻糖保护剂后的表面羟基滴定数据表征结果图。表1是实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前后以及加入辛基葡萄糖苷保护剂，加入常规海藻糖保护剂后的水合粒径分布及zeta电势表征数据。表2为实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前后、含辛基葡萄糖苷保护剂冻干配方，以及加入常规海藻糖保护剂后的表面羟基滴定数据表征数据。上述材料经过表征显示，在加入辛基葡萄糖苷之后佐剂的平均粒径分布在547nm左右，优于常用的海藻糖冻干保护剂，zeta电势随着辛基葡萄糖苷的加入而升高，体系的稳定性与常温(rt)状态下的相媲美(结果见图1及表1)；对粒子表面羟基进行定量，发现辛基葡萄糖的加入阻碍了由于冻干导致的羟基丢失(结果见图2及表2)。
[0046]
实施例2
[0047]
准确称量1.3933g九水合硝酸铝，在20ml去离子水溶液中，在溶解的过程中进行不断搅拌，搅拌速率控制在360rpm，待九水合硝酸铝完全溶解于去离子水形成透明澄清的前驱物溶液后，缓慢滴加0.238ml乙二胺，此时可观察到溶液由透明溶液产生絮状白固体沉淀，继续搅拌30min，反应完全，停止搅拌，将得到的悬浊液于反应釜中200℃反应2h。待自然冷却至室温，反应产物使用去离子水和乙醇分别离心洗涤2-3次，60℃下恒温干燥，得到白粉末状固体，即为羟基氧化铝佐剂。取100mg合成的羟基氧化铝佐剂，加入10ml超纯水、0.05％(5mg)的蔗糖脂肪酸脂(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)超声至溶液均匀，在-80℃冰箱中进行速冻，并保持24h，取出后于冻干机中进行真空冻干，维持-80℃温度、 0pa压力，冻干24h，得到蓬松均匀的白固体粉末。
[0048]
图3是实施例2中羟基氧化铝佐剂冻干前后以及含蔗糖脂肪酸酯保护剂冻干配方的水合粒径分布结果图。图4为实施例2中羟基氧化铝佐剂冻干前后以及含蔗糖脂肪酸酯保护剂冻干配方的表面羟基滴定数据表征结果图。表3是实施例2中羟基氧化铝佐剂冻干前后
以及含蔗糖脂肪酸酯保护剂冻干配方的水合粒径分布及zeta电势表征数据。表4为实施例2中羟基氧化铝佐剂冻干前后以及含蔗糖脂肪酸酯保护剂冻干配方的表面羟基滴定数据表征数据。上述材料经过表征显示，在加入蔗糖脂肪酸脂之后佐剂的平均粒径分布在787nm左右，防止了冻干后铝佐剂的聚集，zeta电势随着蔗糖脂肪酸脂的加入而升高，体系的稳定性显著提升(结果见图3及表3)；对粒子表面羟基进行定量，发现蔗糖脂肪酸脂的加入阻碍了由于冻干导致的羟基丢失(结果见图4及表4)。
[0049]
对比例1
[0050]
准确称量1.3933g九水合硝酸铝，在20ml去离子水溶液中，在溶解的过程中进行不断搅拌，搅拌速率控制在360rpm，待九水合硝酸铝完全溶解于去离子水形成透明澄清的前驱物溶液后，缓慢滴加0.238ml乙二胺，此时可观察到溶液由透明溶液产生絮状白固体沉淀，继续搅拌30min，反应完全，停止搅拌，将得到的悬浊液于反应釜中200℃反应2h。待自然冷却至室温，反应产物使用去离子水和乙醇分别离心洗涤2-3次，60℃下恒温干燥，得到白粉末状固体，即为羟基氧化铝佐剂。取100mg合成的羟基氧化铝佐剂，加入10ml超纯水、0.15％(15mg)的海藻糖(西格玛)超声至溶液均匀，在-80℃冰箱中进行速冻，并保持 24h，取出后于冻干机中进行真空冻干，维持-80℃温度、0pa压力，冻干24h，得到均匀的白固体粉末(表征结果见图1、图2、表1及表2)。
[0051]
表1实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前后以及加入辛基葡萄糖苷保护剂，加入常规海藻糖保护剂后的水合粒径分布及zeta电势表征数据
[0052][0053]
表2实施例1中羟基氧化铝佐剂冻干前后、含辛基葡萄糖苷保护剂冻干配方，以及加入常规海藻糖保护剂后的表面羟基滴定数据表征数据
[0054][0055]
表3实施例2中羟基氧化铝佐剂冻干前后以及含蔗糖脂肪酸酯保护剂冻干配方的水合粒径分布及zeta电势表征数据
[0056][0057]
表4实施例2中羟基氧化铝佐剂冻干前后以及含蔗糖脂肪酸酯保护剂冻干配方的表面羟基滴定数据表征数据
[0058][0059]
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

技术特征：

1.一种冻干保护剂在含铝佐剂中的应用，其特征在于，向含铝佐剂悬浮液中的冻干保护剂，超声分散均匀，冷冻干燥，制备含冻干保护剂的铝佐剂；所述冻干保护剂为非离子型表面活性剂，具有4-7个的羟基结构以及c
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烷基链，冻干保护剂的质量分数为含铝佐剂悬浮液的0.05-5％。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含铝佐剂悬浮液中含铝佐剂的浓度为1-10mg/ml。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含铝佐剂为羟基氧化铝佐剂。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的冻干保护剂选自以下物质：辛基葡萄糖苷、蔗糖脂肪酸脂、烷基糖苷、椰油基葡糖苷、棕榈酸蔗糖、蔗糖硬脂酸、蔗糖二硬脂酸酯。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的应用，其特征在于，将含铝佐剂溶解于超纯水中，得到含铝佐剂悬浮液。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，冷冻干燥的具体过程为：首先在-80～-60℃冰箱中进行速冻，并保持20-25h，再在冻干机中进行真空冻干，维持-80～-60℃温度、0-30pa压力，冻干20-25h。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含冻干保护剂的铝佐剂在疫苗制剂中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疫苗为白喉、破伤风和无细胞百日咳疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎肺炎疫苗。

技术总结

本发明公开了一种冻干保护剂在含铝佐剂中的应用。用于保护含铝佐剂悬浮液在冷冻干燥过程中不受应力损伤的制剂是一类表面活性剂，所述的表面活性剂可选择辛基葡萄糖苷、蔗糖脂肪酸脂、烷基糖苷等物质。本发明提供的冻干保护方法避免了在疫苗中使用的含铝佐剂冻干过程中的大量聚集、减少了冻干过程对羟基氧化铝佐剂表面结构的破坏。本发明可以提高含铝佐剂制剂在冷冻干燥过程中的稳定性，大大降低在冷链运输过程中由于温度变化导致的佐剂效用损失可能性，可以避免不必要的损失和严重后果。可以避免不必要的损失和严重后果。