设计的抗体结合纳米颗粒

设计的抗体结合纳米颗粒1.交叉引用2.本技术主张2020年6月8日提交的序列号为63/036,062和2020年9月30日提交的序列号为63/085,351的美国临时专利申请的优先权，每一项均通过引用全部并入本文。3.序列表声明4.序列表的计算机可读格式通过电子提交方式与本技术一同提交，并通过引用完整纳入本技术。序列列表包含在2021年5月20日创建的、文件名为“20-860-wo_seqlist_st25.txt”，大小为30kb的文件。

背景技术

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：：5.抗体在和诊断应用中应用非常广泛。虽然已经做出了一些努力来寡聚抗体以增强亲和力和受体聚集性，但目前还没有精确制备有序和结构均一的抗体结合纳米颗粒结构的方法。技术实现要素：6.在一个方面，本发明提供了多肽，所述多肽包含与选自seqidno:1-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的(即：在百分比同一性要求中不考虑)，其中，所述多肽能够(a)组装成聚合物，包括但不限于均聚物，以及(b)结合到igg抗体的恒定区。7.在其他方面，本发明提供编码本发明任何实施方案的多肽的核酸、包含可操作地连接到控制序列的本发明的核酸的表达载体，以及包含本发明任意实施方案的肽、核酸和/或表达载体的宿主细胞。8.在另一方面，本发明提供了本发明实施方案的多肽聚合物，其中9.(i)聚合物中的每个单体包含与seqidno:1的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；10.(ii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:2的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；11.(iii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；12.(iv)聚合物中的每个单体包含与seqidno:4的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；13.(v)聚合物中的每个单体包含与seqidno:5的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；14.(vi)聚合物中的每个单体包含与seqidno:6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；15.(vii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；16.(viii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:8的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或17.(ix)聚合物中的每个单体包含与seqidno:9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；18.其中括号中的残基是任选的(即：在百分比同一性要求中不考虑)。19.在另一方面，本发明提供了颗粒，包括：20.(a)根据本文任何实施方案的多个相同聚合物，以及21.(b)包含fc结构域的多个抗体；22.其中23.(i)所述多个抗体中的每一抗体包括第一fc结构域和第二fc结构域；24.(ii)多个抗体中的每个抗体(a)通过第一fc结构域与第一均聚物的一条多肽单体链非共价结合，(b)通过第二fc结构域与第二均聚物中的一条多肽单体非共价结合；并且25.(iii)每个均聚物的每个多肽单体链与一个fc结构域非共价结合；26.其中所述颗粒包含二面体、四面体、八面体或二十面体对称。27.在一个方面，本发明提供了颗粒，包括：28.(a)多个多肽聚合物，其中29.(i)聚合物中的每个单体包含与seqidno:1的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；30.(ii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:2的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；31.(iii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；32.(iv)聚合物中的每个单体包含与seqidno:4的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；33.(v)聚合物中的每个单体包含与seqidno:5的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；34.(vi)聚合物中的每个单体包含与seqidno:6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；35.(vii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；36.(viii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:8的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或37.(ix)聚合物中的每个单体包含与seqidno:9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；其中括号中的残基是任选的(即：在百分比同一性要求中不考虑)；和38.(b)包含fc结构域的多个抗体，其中39.(i)所述多个抗体中的每一抗体包括第一fc结构域和第二fc结构域；40.(ii)多个抗体中的每一抗体(a)通过第一fc结构域与第一聚合物的一条多肽单体链非共价结合，(b)通过第二fc结构域与第二聚合物的一个多肽单体非共价结合；和41.(iii)每种聚合物的每个多肽单体链与一个fc结构域非共价结合；42.其中所述颗粒包含二面体、四面体、八面体或二十面体对称。43.在其他方面，本发明提供了包含本发明任何实施方案的多个颗粒的组合物；药物组合物，包含(a)本文任何实施方案的多肽、聚合物、颗粒或组合物，以及(b)药学上可接受的载体；将多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、聚合物、颗粒、组合物或药物组合物用于任何合适用途的方法，包括但不限于实施例中所述的用途，包括颗粒和组合物中存在的抗体的诊断或用途的方法；以及实施例中公开的多肽计算设计方法。附图说明44.图1(a-f).抗体纳米笼(abc)设计。a，指定了多面体几何形状。b，来自higg1的抗体fc模型与其中一个c2轴对齐(在这种情况下，示出的是d2二面体)。c，抗体fc-结合剂与螺旋重复蛋白融合，螺旋重复蛋白随后与螺旋循环寡聚体的单体亚基融合。对构建块和构建块连接的所有组合进行采样(见插图)。d-e，成功地将循环寡聚体轴放置在目标多面体几何形状(d)所需的方向上以进行侧链重新设计(e)的三部分融合。f，设计的abc形成寡聚体经细菌表达、纯化，并与抗体fc或igg组装。45.图2(a-f).abc的结构表征。a，设计模型，使用抗体fc和设计的abc形成寡聚体。b，通过将设计物和fc混合形成的组装物的sec痕迹与单个组装物sec痕迹的叠加。c，具有插图中2d聚类(2dclass)平均值的em图像；除o42.1和i52.3(低温电镜)设计外，所有数据均来自阴性染em。d-e，用全人源igg1(2个fab区域完整)组装的相同设计抗体笼的sec(d)和具有2d聚类平均数的ns-em代表性显微照片(e)。46.图3.用fc形成的abc的三维重建。将每个abc的计算设计模型(卡通图像)拟合到实验确定的em三维密度中。每个纳米笼沿未占用的对称轴(左)观察，旋转后向下观察fc占用的其中一个c2对称轴(右)。o42.1和i52.3的三维重建来自低温电镜分析；ns-em提供所有其他重建。47.图4(a-k).abc激活细胞凋亡和血管生成信号通路。(a和b)半胱天冬酶3/7在rcc4肾癌细胞中被α-dr5抗体(a)形成的abc激活，但不能被游离抗体(b)激活。(c和d)α-dr5abc(c)，而非fcabc对照(d)，在4天后降低细胞活力。(e)α-dr5abc在处理6天后降低生存能力。(f和g)o42.1α-dr5abc增强parp裂解，其是凋亡信号的标志；(g)是相对于pbs对照(f)的量化。(h)血管生成素-1的f结构域融合到fc(a1f-fc)并组装成八面体(o42.1)和二十面体(i52.3)abc。(i)典型的蛋白质印迹显示，a1f-fcabc增加pakt和perk1/2信号，而非对照。(j)是(i)的量化：pakt量化相对o42.1a1f-fc信号归一化(pbs对照中无pakt信号)；perk1/2相对pbs归一化。(k)72小时后，a1f-fcabc增加血管稳定性。(左)与pbs比较的血管稳定性量化。(右)代表性图像；刻度条，100mm。所有误差条代表平均值±sem；使用方差分析和dunnett事后检验比较平均值(表11和12)*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001.48.图5(a-e).α-cd40abc通过未形成笼的igg激活cd40信号。49.a-d，根据sec(b)、dls(c)和ns-em(d)，用α-cd40产生的八面体abc(a)形成预期大小和形状的abc。e，lob7/6α-cd40八面体纳米笼，而非游离lob7/6，激活cd40通路。比例尺表示平均值±sd，n＝3；表7中报告的ec50。50.图6(a-c).设计的fc结合设计螺旋重复。a，螺旋重复蛋白dhr79与抗体fc对接的模型(pdbid:1dee)。蛋白a(pdbid:1l6x)的残基枝接在fc和螺旋重复蛋白之间的界面。b，fc结合螺旋重复单体的sec轨迹。c，利用fc(左)或higg1(右)的fc结合螺旋重复设计的生物膜层干涉(bli)，附汇总统计(见下文)。51.图7(a-f).附加的α-dr5abc实验。a，α-dr5abc和trail激活colo205结直肠癌细胞株中的半胱天冬酶-3,7。b-c，由higg1的fc形成的abc不会激活rcc4细胞中的半胱天冬酶-3,7(b)或降低活力(c)。d，α-dr5abc在2天后(d)不会显著激活半胱天冬酶-3,7或降低原代肾小管细胞系(ram009)的活力(e)。f，分离的parp被rcc4细胞中的α-dr5激活，但不会被trail、α-dr5或fcabc激活。52.图8(a-e).附加的a1f-fcabc实验。a-b，由a1f-fc形成的o42.1和i52.3abc是单分散的，在superosetm6柱(a)和dls(b)上具有预期的每sec大小。以黑显示sec组装物痕迹，以浅灰显示相关abc设计组件，以深灰显示a1f-fc。c，展示8个a1f配体(“h8-a1f”)的对照组装物产生与a1f-fcabc相似的pakt和perk1/2激活水平，同时血管稳定性也有相当的提高；为了方便起见，除h8-a1f以外的所有其他条件的数据都重新标记在图4i-k中。d，血管稳定性分析中o42.1、i52.3abc和h8-a1f与fc形成的代表性图像；比例尺为100μm。e，o42.1a1f-fcabc与100％人血清(hs)在4℃或37℃下孵育24小时，并在150nm下应用于huvec细胞。pakt信号显示与血清孵育的o42.1a1f-fc颗粒无下降。统计分析见表12。具体实施方式53.引用的所有参考文献均以引用方式并入本文。在本技术中，除非另有说明，否则所应用的技术可在以下几种已知参考文献中到：molecularcloning:alaboratorymanual(sambrook,etal.,1989,coldspringharborlaboratorypress),geneexpressiontechnology(methodsinenzymology,vol.185,editedbyd.goeddel,1991.academicpress,sandiego,ca),“guidetoproteinpurification”inmethodsinenzymology(m.p.deutshcer,ed.,(1990)academicpress,inc.)；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innis,etal.1990.academicpress,sandiego,ca),cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,2nded.(r.i.freshney.1987.liss,inc.newyork,ny),genetransferandexpressionprotocols,pp.109-128,ed.e.j.murray,thehumanapressinc.,clifton,n.j.),和theambion1998catalog(ambion,austin,tx)。54.如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。55.如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(ala；a)、天冬酰胺(asn；n)、天冬氨酸(asp；d)、精氨酸(arg；r)、半胱氨酸(cys；c)、谷氨酸(glu；e)、谷氨酰胺(gln；q)、甘氨酸(gly；g)、组氨酸(his；h)、异亮氨酸(ile；i)、亮氨酸(leu；l)、赖氨酸(lys；k)、蛋氨酸(met；m)、苯丙氨酸(phe；f)、脯氨酸(pro；p)、丝氨酸(ser；s)、苏氨酸(thr；t)、氨酸(trp；w)、酪氨酸(tyr；y)和缬氨酸(val；v)。56.在本文所公开的多肽的所有实施方案中，任何n末端蛋氨酸残基都是任选的(即：n末端蛋氨酸残基可能存在或可能不存在)。57.本发明任何方面的所有实施方案都可以组合使用，除非上下文另有明确规定。58.除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”、“包含(comprising)”等应理解为包容性，而不是排他性或穷尽性；也就是说，具有“包括但不限于”的意义。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。此外，在本技术中使用的词语“本文”、“上面”和“下面”以及类似含义的词语应指整个申请，而不是指申请的任何特定部分。59.在第一方面中，本发明提供了多肽，所述多肽包含与选自seqidno:1-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的(即：在百分比同一性要求中未考虑)，其中，所述多肽能够(a)组装成聚合物，包括但不限于均聚物，以及(b)结合到igg抗体的恒定区。60.表1：用于所有设计的序列和原始构建块。61.62.63.[0064][0065]如以下示例中所详细说明的，本发明的多肽包含3个结构域(如表1的列所示)：[0066](1)(fc)结合域；[0067](2)螺旋多肽(单体)，其有助于将fc结合域和寡聚体域定位在正确的方向，以促进高级结构(有时称为笼状物或纳米颗粒)；和[0068](3)寡聚体结构域，其可通过非共价相互作用结合形成聚合物(包括但不限于均聚物)，例如二聚体、三聚体、四聚体或五聚体(分别为c2、c3、c4或c5循环对称性)。[0069]在一些实施方案中，寡聚体结构域可以通过非共价相互作用自结合以形成具有相同多肽的均聚物。在另一实施方案中，只要每个单体对参考多肽具有所需的氨基酸序列同一性，寡聚体结构域就可以通过非共价相互作用与具有一些氨基酸序列差异的类似多肽形成伪聚合物。[0070]本发明的多肽以寡聚体形式并与igg结合时形成本文详述的所需高级结构的方向融合这些结构域。[0071]每个单体多肽有两个界面：(1)fc结合界面(表3中对每种多肽进行定义)；和(2)寡聚结构域界面(表2中对每种多肽进行定义)。本发明的多肽在表达时将通过同源寡聚结构域形成c2、c3、c4或c5对称的循环寡聚体。当与抗体结合时，通过抗体与fc结合界面的相互作用，高阶笼状多面体结构自发组装。由此得到的高级结构在每个fc结合界面和每个同源寡聚结构域界面具有循环对称性(cyclyicsymmetry)。[0072]如本文所用，抗体包括全长抗体(重链和轻链)和包括igg片段可结晶(fc)结构域的任何功能性抗体片段。在一些实施方案中，抗体包括重链和轻链。在其他实施方案中，抗体可包含融合蛋白，该融合蛋白包含结合靶标和fc结构域的蛋白质，其由于fc结构域自然二聚而二聚。在其他实施方案中，抗体可包含化学修饰成结合靶标的蛋白质的fc片段，其由于fc结构域自然二聚而二聚。[0073]在一个实施方案中，存在于seqidno:1-9中任一个多肽的聚合物中的聚合物界面(如表2所定义)的氨基酸残基是保守的(即：与参考多肽中相同位置的氨基酸残基相同)。[0074]表2：寡聚物界面(即非fc/fc-结合剂界面)的预期界面残基(按残基位置)[0075][0076][0077]在另一实施方案中，表3中定义的存在于fc结合界面的氨基酸残基是保守的。[0078]表3[0079][0080][0081]在另一实施方案中，相对于参考序列的氨基酸替换包含参考多肽中极性残基的替换、基本上由其组成或由其组成。在其他实施方案中，在保持设计的折叠和组装特性的同时，多肽表面上不在fc或寡聚物界面的极性残基可以用其他极性残基来替换。[0082]如本文所用，“极性”残基是c、d、e、h、k、n、q、r、s、t和y。“非极性”残基被定义为a、g、i、l、m、f、p、w和v。[0083]在一个实施方案中，与参考序列相关的氨基酸替换包含参考多肽环位置中非gly/pro残基的极性残基的替换、基本上由其组成或由其组成，如表4所定义。[0084]表4：使用pyrosetta的display_secstruct()函数预测所有列出的设计的二级结构。l＝环，h＝螺旋[0085][0086][0087][0088]在这些实施方案中任一个的另一实施方案中，来自参考多肽的氨基酸改变是保守的氨基酸替换。此处所用的“保守氨基酸替换”是指：[0089]疏水性氨基酸(ala、cys、gly、pro、met、sce、sme、val、ile、leu)只能用其他疏水性氨基酸替换；[0090]具有粗大侧链的疏水性氨基酸(phe、tyr、trp)只能用具有粗大侧链的其他疏水性氨基酸替换；[0091]带正电荷侧链的氨基酸(arg、his、lys)只能用带正电荷侧链的其他氨基酸替换；[0092]带负电荷侧链的氨基酸(asp、glu)只能用带负电荷侧链的其他氨基酸替换；和[0093]具有极性不带电侧链的氨基酸(ser、thr、asn、gln)只能用其他具有极性未带电侧链氨基酸替换。[0094]在一个实施方案中，所述多肽包含与选自seqidno：2-3、5-6和8-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0095]在本文所公开的所有实施方案中，多肽可以包含一个或多个被认为适合预期用途的附加官能团或残基。本发明的多肽可包括n末端或c末端的附加残基，或其组合；这些附加残基不包括在确定本发明多肽相对于参考多肽的百分比同一性中。这些残基可以是适合预期用途的任何残基，包括但不限于可检测的蛋白质或其片段(也称为“标签”)。如本文所用，“标签”包括常规可检测部分(即：荧光蛋白、抗体表位标签等)、剂、纯化标签(his标签等)、接头、适于纯化目的的配体、驱动多肽定位的配体、给多肽添加功能性的肽结构域。在非限制性实施方案中，此类官能团可包含一个或多个多肽抗原、多肽疗法、酶、可检测结构域(例如：荧光蛋白或其片段)、dna结合蛋白、转录因子等。在一个实施方案中，所述多肽还可包含共价连接到氨基末端和/或羧基末端的功能多肽。在其他实施方案中，功能多肽可包括但不限于可检测多肽，例如荧光或发光多肽、受体结合域等。[0096]本文所述多肽可以化学合成或重组表达。多肽可与其他化合物连接以促进体内半衰期的延长，例如通过聚乙二醇化、羟乙基化、pas化或糖基化。如本领域技术人员所理解的，这种连接可以是共价的或非共价的。[0097]在另一方面，本发明提供编码本发明任何实施方案或实施方案组合的多肽的核酸。核酸序列可包含单链或双链rna或基因组或cdna形式的dna，或dna-rna杂交，其中每一个可包括化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。此类核酸序列可包含用于促进编码多肽的表达和/或纯化的附加序列，包括但不限于polya序列、修饰的kozak序列和编码表位标签、输出信号、分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。根据本文的教导，对于本领域技术人员来说，编码本发明的多肽的核酸序列是显而易见的。[0098]在另一方面，本发明提供了包含本发明任何方面的核酸的表达载体，所述核酸可操作地连接到合适的控制序列。“表达载体”包括操作性地将核酸编码区或基因连接到能够影响基因产物表达的任何控制序列的载体。与本发明的核酸序列可操作连接的“控制序列”是能够影响核酸分子表达的核酸序列。控制序列不需要与核酸序列相邻，只要它们起到指导其表达的作用。因此，例如，插入的未翻译但转录的序列可以存在于启动子序列和核酸序列之间，并且启动子序列仍然可以被视为与编码序列“可操作地连接”。其他此类控制序列包括但不限于聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。这种表达载体可以是任何类型，包括但不限于质粒和基于病毒的表达载体。用于驱动所公开的核酸序列在哺乳动物系统中的表达的控制序列可以是组成型的(由多种启动子中的任何一种驱动，包括但不限于cmv、sv40、rsv、肌动蛋白、ef)或诱导型的(由许多诱导启动子中中的任何一种驱动，包括但不限于四环素、蜕皮激素、类固醇反应性启动子)。表达载体必须可以作为游离基因或整合到宿主染体dna中，在宿主生物体中复制。在各种实施方案中，表达载体可包括质粒、基于病毒的载体或任何其他合适的表达载体。[0099]在另一方面，本发明提供包含本文所公开的多肽、核酸和/或表达载体(即：游离基因或染体整合)的宿主细胞，其中宿主细胞可以是原核生物或真核生物。可使用包括但不限于细菌转化、磷酸钙共沉淀、电穿孔或脂质体介导、deae-右旋糖酐介导、聚阳离子介导或病毒介导的转染等技术，对细胞进行瞬时或稳定的工程化以引入本发明的表达载体。[0100]本发明还提供了多肽聚合物，其中：[0101](i)聚合物中的每个单体包含与seqidno:1的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0102](ii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:2的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0103](iii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0104](iv)聚合物中的每个单体包含与seqidno:4的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0105](v)聚合物中的每个单体包含与seqidno:5的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0106](vi)聚合物中的每个单体包含与seqidno:6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0107](vii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0108](viii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:8的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或[0109](ix)聚合物中的每个单体包含与seqidno:9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0110]其中，可选残基未考虑在百分比同一性要求中。[0111]如本文所述，本发明的多肽在表达时将通过寡聚结构域形成c2、c3、c4或c5对称的循环寡聚体，生成本发明的聚合物。[0112]聚合物可以包含具有某些氨基酸差异的单体，或者给定聚合物中的所有单体可以相同。聚合物可以是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。[0113]在一个实施方案中，聚合物包含二聚体。在各种此类实施方案中，二聚体包含多肽，所述多肽包含与选自seqidno：1-3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0114]在另一实施方案中，聚合物包含三聚体。在各种此类实施方案中，三聚体包含多肽，所述多肽包含与选自seqidno：4-6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0115]在另一实施方案中，聚合物包含四聚体。在各种此类实施方案中，四聚体包含多肽，所述多肽包含与seqidno:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0116]在又一实施方案中，聚合物包含五聚体。在各种此类实施方案中，五聚体包含多肽，所述多肽包含与选自seqidno:8-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。[0117]在另一方面，本发明提供了颗粒，包括：[0118](a)根据本文所公开的任何实施方案d或实施方案组合的多个相同聚合物，以及[0119](b)包含fc结构域的多个抗体；[0120]其中：[0121](i)所述多个抗体中的每一抗体包括第一fc结构域和第二fc结构域；[0122](ii)多个抗体中的每个抗体(a)通过第一fc结构域与第一均聚物的一条多肽单体链非共价结合，(b)通过第二fc结构域与第二均聚物中的一条多肽单体非共价结合；和[0123](iii)每个均聚物的每个多肽单体链与一个fc结构域非共价结合；[0124]其中所述颗粒包含二面体、四面体、八面体或二十面体对称。[0125]如本文所述，本发明的多肽在表达时将通过同源寡聚结构域形成c2、c3、c4或c5对称的循环寡聚体(cyclicoligomer)。当与抗体结合时，通过抗体与fc结合界面的相互作用，高阶笼状多面体结构自发组装。得到的高阶结构在fc位置具有c2循环对称性，在每个同源寡聚结构域界面具有2、3、4或5循环对称性。所得颗粒形成精确有序且结构均匀的抗体结合纳米颗粒结构。因此，例如，颗粒可用于抗体提供益处的任何或诊断用途。[0126]如本文所用，抗体包括全长抗体(重链和轻链)和包括igg片段可结晶(fc)结构域的任何功能性抗体片段。在一些实施方案中，抗体包括重链和轻链。在其他实施方案中，抗体可包含融合蛋白，该融合蛋白包含结合靶标和fc结构域的蛋白质，其由于fc结构域自然二聚而二聚。在其他实施方案中，抗体可包含化学修饰成结合靶标的蛋白质的fc片段，其由于fc结构域自然二聚而二聚。本发明的多肽与抗体恒定区结合，因此抗体可以是对任何抗原具有特异性的抗体。[0127]在一个实施方案中，多个均聚物包含多肽的均聚物，所述多肽包含与选自seqidno:1-3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，添加带有igg的所述多肽会导致自发组装成每个颗粒包含两个抗体的d2二面体结构。[0128]在另一实施方案中，多个均聚物包含多肽的均聚三聚体，所述多肽包含与选自seqidno:4-6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，添加带有igg的所述多肽会导致自发组装成每个颗粒包含六个抗体的t32四面体结构。[0129]在又一实施方案中，多个均聚物包含多肽的均聚四聚体，其包含与seqidno:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，添加带有igg的所述多肽会导致自发组装成每个颗粒包含12个抗体的o42八面体结构。[0130]在又一实施方案中，多个均聚物包含多肽的均五聚体，所述多肽包含与选自seqidno:8-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，添加带有igg的所述多肽会导致自发组装成每个颗粒包含30个抗体的i52二十面体结构。[0131]在另一实施方案中，颗粒包括：[0132](a)多种多肽聚合物，其中[0133](i)聚合物中的每个单体包含与seqidno:1的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0134](ii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:2的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0135](iii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0136](iv)聚合物中的每个单体包含与seqidno:4的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0137](v)聚合物中的每个单体包含与seqidno:5的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0138](vi)聚合物中的每个单体包含与seqidno:6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0139](vii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；[0140](viii)聚合物中的每个单体包含与seqidno:8的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或[0141](ix)聚合物中的每个单体包含与seqidno:9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；其中括号中的残基是任选的(即：在百分比同一性要求中不考虑)；和[0142](b)包含fc结构域的多个抗体，其中[0143](i)所述多个抗体中的每一抗体包括第一fc结构域和第二fc结构域；[0144](ii)多个抗体中的每一抗体(a)通过第一fc结构域与第一聚合物的一条多肽单体链非共价结合，(b)通过第二fc结构域与第二聚合物的一个多肽单体非共价结合；和[0145](iii)每种聚合物的每个多肽单体链与一个fc结构域非共价结合；[0146]其中所述颗粒包含二面体、四面体、八面体或二十面体对称。[0147]上述多肽和聚合物的所有实施方案同样适用于本发明的颗粒。在一个实施方案中，聚合物包含具有某些氨基酸差异的单体。在另一实施方案中，该颗粒包含非同源寡聚体的聚合物。在另一实施方案中，颗粒中的每种聚合物都是相同的。[0148]在另一个实施方案中，每个聚合物中的每个单体都是相同的，并且每个聚合物都是均聚物。在另一实施方案中，颗粒中的每个均聚物都是相同的。[0149]在一个实施方案中，多个聚合物包含多肽的二聚体，该多肽包含与选自seqidno:1-3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，将所述的多肽与抗体一起添加，可导致自发组装成每个颗粒包含两个抗体的d2二面体结构。[0150]在另一实施方案中，多个聚合物包含多肽三聚体，其包含与选自seqidno:4-6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，将所述的多肽与抗体相结合，可以自发组装成每个颗粒包含六个抗体的t32四面体结构，。[0151]在又一实施方案中，所述多个聚合物包含多肽的四聚体，所述多肽包含与seqidno:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，将所述的多肽与抗体相结合，会导致自发组装成每个颗粒包含12个抗体的o42八面体结构。[0152]在又一实施方案中，所述多个聚合物包含多肽的五聚体，所述多肽包含与选自seqidno:8-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，将所述的多肽与抗体相结合，可自发组装成每个颗粒含有30个抗体的i52二十面体结构。[0153]在颗粒的所有实施方案的一个实施方案中，如表2所定义，在seqidno:1-9中任何一种多肽的聚合物中，存在于聚合物界面的氨基酸残基是保守的。在颗粒的所有实施方案的另一实施方案中，表3中定义的seqidno:1-9中任何一个的fc结合界面上存在的氨基酸残基是保守的。在颗粒的所有实施方案的又一实施方案中，与seqidno:1-9中任何一个的参考序列相关的氨基酸替换包含参考多肽中极性残基的替换、基本上由其组成或由其组成。在所有颗粒实施方案的又一个实施方案中，与seqidno:1-9中任何一个的参考序列相关的氨基酸替换包含参考多肽环位置中非gly/pro残基的极性残基的替换、基本由其组成或由其组成，如表4所定义。在颗粒的所有实施方案的另一实施方案中，来自seqidno:1-9中任何一个的参考多肽的氨基酸变化是保守的氨基酸替换。[0154]颗粒中存在的抗体可以是任何用于预期目的的合适抗体。在一个实施方案中，抗体选择性地结合到包括但不限于病原体特异性抗原(包括但不局限于细菌、病毒、原生动物或其他病原体抗原)、细胞表面受体、疾病相关抗原(包括但是不限于肿瘤细胞抗原、阿尔茨海默病和其他淀粉样疾病的β-淀粉样蛋白)、酶、生长因子、毒素、小分子、诊断相关肽等。[0155]在另一个实施方案中，抗体可包含一种或多种fda批准的用于用途的抗体，如表5所示。在这些实施方案中，颗粒可用于抗体被批准用于的疾病，如表5右栏所示。[0156]表5[0157][0158][0159][0160][0161][0162][0163][0164]在另一实施方案中，抗体可选择性结合来自细菌或病毒病原体的抗原。在非限制性实施方案中，病原体特异性抗原包括来自肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型等)病毒、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、包括但不限于mers-cov(中东呼吸综合征相关冠状病毒)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(包括sars-cov和sars-cov-2)的抗原，爱泼斯坦-巴尔病毒、流感病毒、副流感病毒、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、人类免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、埃博拉病毒、巨细胞病毒、马尔堡病毒、诺如病毒、天花病毒、任何黄病毒属，包括但不限于西尼罗河病毒、黄热病病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒和日本脑炎病毒；人类免疫缺陷病毒(hiv)、杆菌(bcillusanthracis)、百日咳杆菌(bordetallapertusis)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、破伤风梭菌(clostridiumtetani)、艰难梭菌(clastridiumdifficile)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiptheriae)、贝氏柯克氏体(coxiellaburnetii)、大肠杆菌(escherichiacoli)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、杜诺凡利什曼原虫(leishmaniadonovani)、热带乳杆菌(l.tropica)和巴西乳杆菌(l.braziliensis)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitis)、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、卵形疟原虫(p.ovale)、疟疾疟原虫(p.malariae)和间日疟原虫(p.vivax)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、血吸虫(schistosomahematobium)、曼氏血吸虫(s.mansoni)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)(a组和b组)、金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)、弓形虫(toxoplasmagondii)、布氏锥虫(trypanosomabrucei)、克氏锥虫(t.cruzi)、和弧菌(vibriocholera)。在这些实施方案中，颗粒可用于例如细菌或病毒感染或限制细菌或病毒感染的进展。[0165]如实施例中所述，所述颗粒具有大量内部空间，可用于包装核酸或蛋白质配载(cargo)。因此，在可与任何其他实施方案组合的另一实施方案中，颗粒包括颗粒内部空间内的配载。任何合适的配载都可以包装在颗粒内，包括但不限于用于预期目的的核酸或多肽。[0166]在另一个实施方案中，本发明提供了包含任何实施方案的多个颗粒或本发明实施方案的组合的组合物。例如，所述组合物可用于如上所述的或诊断目的。在一个实施方案中，组合物中的所有抗体对相同抗原具有选择性。在另一实施方案中，该组合物中的抗体总共对两种或两种以上(3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)不同抗原具有选择性。[0167]在另一方面，本发明提供包含(a)本文中任何实施方案或实施方案组合的多肽、聚合物、颗粒或组合物，以及(b)药学上可接受的载体的药物组合物。该药物组合物还可包含(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)填充剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲液。在一些实施方案中，药物组合物中的缓冲液是tris缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸缓冲液。所述组合物还可以包括冻干保护剂，例如蔗糖、山梨醇或海藻糖。在某些实施方案中，所述组合物包括防腐剂，例如苯扎氯铵、苯乙氧基铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸及其各种混合物。在其他实施方案中，所述组合物包括填充剂，如甘氨酸。在又一其他实施方案中，所述组合物包括表面活性剂，例如，聚山梨酯-20、聚山梨酯-40、聚山梨酯-60、聚山梨酯-65、聚山梨酯-80聚山梨酯-85、泊洛沙姆-188、山梨醇单月桂酸酯、山梨醇单棕榈酸酯、山梨醇单硬脂酸酯、山梨醇单油酸酯、山梨醇三月桂酸酯、山梨醇三硬脂酸酯、山梨醇三月桂酸酯，或其组合。所述组合物还可以包括张力调节剂，例如，使该制剂与人体血液基本等渗或等渗的化合物。示例性张力调节剂包括蔗糖、山梨醇、甘氨酸、蛋氨酸、甘露醇、葡萄糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在其他实施方案中，所述组合物还包括稳定剂，例如，在冻干或液体形式中实质上防止或减少纳米结构的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性稳定剂包括蔗糖、山梨醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、蛋氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。[0168]多肽、聚合物、颗粒或组合物可以是组合物中的唯一活性剂，或者组合物还可以包含一种或多种适合预期用途的其他试剂。[0169]在另一方面，本发明提供了将多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、聚合物、颗粒、组合物或药物组合物用于任何合适用途的方法，包括但不限于实施例中所述的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者(例如哺乳动物，包括但不限于人类)施用本发明的颗粒、组合物或药物组合物，其中所述受试者患有可通过本发明的颗粒、组合物或者药物组合物中存在的抗体的病症，并且其中，施用本发明的颗粒、组合物或药物组合物的有效量有助于受试者的病症。表5列出了它们的此类抗体和病症的示例。在其他实施方案中，所述病症是细菌或病毒感染，并且抗体结合细菌或病毒抗原。以上提供了示例性的此类实施方案。[0170]在另一实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者(例如哺乳动物，包括但不限于人类)施用本发明的颗粒、组合物或药物组合物，其中受试者有进展为病症的风险，其进展可受本发明的颗粒、组合物或药物组合物中存在的抗体的限制，并且其中施用本发明的颗粒、组合物或药物组合物的有效量有助于限制对象中病症的进展。在其他实施方案中，感染是细菌或病毒感染，并且抗体结合细菌或病毒抗原。以上提供了示例性的此类实施方案。[0171]如本文所用，“(treat)”或“(treating)”是指达到以下一项或多项：(a)降低受试者疾病症状的严重程度；(b)限制受试者症状的恶化；(c)提高生存率；(d)减少症状持续时间；(e)限制或预防症状的发展；以及(f)减少疾病的住院需求和/或住院时间。[0172]如本文所用，“限制”是指限制有这种疾病风险的受试者的疾病进展。[0173]如本文所用，“有效量”是指对病症和/或限制病症发展有效的颗粒、组合物或药物组合物的量。本文任何实施方案的颗粒、组合物或药物组合物通常被配制为药物组合物，例如上文所公开的那些，并且可以通过任何合适的途径施用，包括口服、肠道外、吸入喷雾、直肠或局部施用含有常规药学上可接受的载体、佐剂、和媒介物。本文中使用的术语“肠外”包括皮下、静脉注射、动脉内、肌肉内、胸骨内、腱内、脊髓内、颅内、胸腔内、输液技术或腹腔内。多肽组合物也可通过微球、脂质体、免疫刺激复合物(iscom)或其他微粒递送系统或引入适当组织(如血液)的缓释制剂施用。可以调整剂量方案，以提供最佳预期反应(例如，或预防反应)。例如，合适的剂量范围可以是0.1μg/kg-100mg/kg体重的颗粒、组合物或药物组合物。该组合物可以单次给药，也可以根据主治医生的决定多次给药(例如，2次、3次、4次、5次或更多次)。[0174]在另一方面，本发明提供了一种多肽计算设计方法，如以下示例中描述的任何实施方案中所公开的。[0175]实施例[0176]我们着手设计能将任意抗体组装成具有明确结构对称组装物的蛋白质。我们推断，通过将抗体的对称轴放置在目标构型的双重轴(two-foldaxis)上，并设计第二蛋白质以将抗体保持在正确的方向，可以从igg抗体(即双重对称蛋白质)中构建对称蛋白质组装物。由于我们的目标是一种适用于许多不同抗体的形式，我们选择igg的恒定片段结晶(fc)结构域和fc结合螺旋束蛋白a之间的相互作用作为纳米颗粒界面。[0177]抗体笼设计的通用计算方法[0178]为了设计一种以fc结合界面终止的同源寡聚体(该界面具有正确的几何形状)，可将igg保持在所需构型的正确相对方向，我们通过计算将三种蛋白质构建块：fc-结合剂、单体和同源寡聚体融合在一起。fc-结合剂在抗体与纳米笼成形设计之间形成第一纳米笼界面，同源寡聚体在设计蛋白质链之间形成第二纳米笼界面，单体以正确的方向将两个界面连接在一起，以生成所需的纳米材料。[0179]为了在蛋白a本身之外生成可用的fc结合构建块，我们通过将蛋白a界面残基接枝到设计的螺旋重复蛋白上，设计了第二fc结合构建块(图6)。为了创建预期形成抗体纳米笼的设计(以下简称abc，抗体笼)，我们使用了一个由这2个fc结合蛋白、42个从头设计的螺旋重复蛋白单体以及1-3个同源寡聚体(2个c2、3个c3、1个c4和1个c5)组成的库。每个蛋白质构建块平均约有150个残基可用于融合，避免了任何蛋白质-蛋白质界面的所有位置，导致107个可能的三部分(fc-结合剂/单体/同源寡聚体)融合。对于这些三部分融合中的每一部分，内部同源寡聚体界面和fc结合界面之间的刚体转换由三个构建块的每一个的形状以及将其连接成单个亚基的“连接”的位置和几何形状决定。[0180]我们使用了最新记载的计算方案(worms)，该方案快速从构建块库中对所有可能的融合进行选取，以识别那些具有生成二面体、四面体、八面体和二十面体abc所需的净刚体变换的融合(20，21)。为了描述最终的纳米笼构型，我们遵循一个总结了构建块的点对称性和循环对称性的命名约定。例如，t32组件具有四面体点对称性，由c3循环对称抗体结合设计的寡聚体和c2循环对称抗体fc构成。当抗体二聚体在所有构型中沿双重轴排列时，所设计的组件是d2二面体结构中的第二同源二聚体；t32四面体结构、o32八面体结构和i32二十面体结构中的同源三聚体；o42八面体结构中的同源四聚体；以及i52二十面体结构中的同源五聚体。[0181]为了进行融合，方案首先沿着指定构型的c2轴对齐fc和fc结合蛋白的模型(图1a-b)。然后将fc-结合剂融合至单体，单体再融合至均聚物。刚性螺旋融合是通过在每个构建块的α螺旋二级结构中叠加残基来实现的；在所得的融合结构中，一个构建块的链结束，另一个在融合点开始，形成一个新的、连续的α螺旋(图1c)。为了进行适当的纳米笼组装，进行融合，使抗体的双重轴和同源寡聚体的对称轴在构型的中心以精确角度相交(图1d)。为了生成d2二面体、t32四面体、o32或o42八面体以及i32或i52二十面体纳米笼，所需的交角分别为90.0°、54.7°、35.3°、45.0°、20.9°和31.7°。我们允许与理想构型的角度和距离偏差最多分别为5.7°和(见方法)。根据融合点周围的接触次数(以测量结构刚度)和主链原子之间的碰撞，进一步筛选候选融合模型。接下来，使用rosettatm中的sympackrotatmersmover对在新形成构建块连接周围的氨基酸特征和构象进行优化，以保持组装所需的刚性融合几何形状(图1e)。按照设计顺序，我们选择了六个d2二面体、十一个t32四面体、四个o32八面体、两个o42八面体，十四个i32二十面体和十一个i52二十面体设计来进行实验表征，这些设计预计会形成abc(图1f)。[0182]结构表征[0183]在大肠杆菌中表达了编码设计蛋白序列的合成基因，该序列附加有c末端6×组氨酸标签。使用固定化金属亲和谱(imac)从澄清的裂解液中纯化设计物，并使用尺寸排除谱(sec)作为最终纯化步骤。在所有几何形状中，48个abc成形设计中有34个在sec上有大致与设计模型的预期尺寸相当的峰。然后将设计与人igg1fc组合，并通过sec重新纯化组装物。其中八种abc成形设计与fc结合成一种类型，该类型与目标纳米颗粒分子量在相同体积下被洗脱出的为单分散峰(图2a-b；3d2二面体、2t32四面体、1o42八面体和2i52二十面体abc)。对于i52.6设计，向组装缓冲液中添加100mml-精氨酸可防止与fc结合后的聚集；所有其他设计都容易在tris缓冲盐水中自我组装。大多数其他设计仍然结合fc，如sec、天然凝胶或结合后与fc明显沉淀所证明的，但sec没有形成单分散纳米颗粒(表6)，可能是因为偏离了目标融合几何形状。[0184]表6.设计抗体结合笼形成寡聚体的成功率。溶解度(第2列)是指sds凝胶读出的裂解后、离心后、imac前可溶性部分中存在的蛋白质。良好的sec组分(第3列)是指具有一些峰值的sec轨迹，对应于纳米笼成型设计模型的近似预测尺寸。带有fc的笼形结构数据如图2和3所示。[0185][0186]ns-em显微照片和2d聚类平均值显示，纳米笼的形状和尺寸与设计模型相对应(图2c)。当abc与完整抗体(带有fc和fab结构域的igg)组装时，abc也会形成，再次生成单分散纳米笼，如sec和ns-em所示(图2d-e)。与预期的一样由于fc-fab铰链的柔性，igg-abc的电子显微照片中有相当多的比fc-abc有更大的柔性的证据。在所有情况下，从使用完整igg制成的抗体的ns-em数据中收集的2d聚类平均值仍然能够解析组件非柔性部分对应的密度(图2e)。[0187]用fc形成的abc的单颗粒ns-em和低温电镜重建3d图与计算设计模型非常一致(图3)。二面体(d2.3、d2.4、d2.7)、四面体(t32.4、t32.8)和二十面体(i52.6)纳米笼之一的负染em重建清楚地显示出二聚体“u”形fc和更长设计的蛋白质区域，它们如计算预测的那样结合在一起。o42.1设计的单颗粒低温电镜重建具有位于c4顶点的六个设计四聚体的清晰密度，它们沿着八面体构型的边缘扭曲以结合十二个二聚体fc，使八个c3面空置。带有fc的i52.3的低温电镜密度同样再现了正二十面体的20面形状，其中12个设计的五聚体在c5顶点向外突出(由于与单体或fc-结合剂相比，c5构建块的长度更长)，与边缘中心的30个二聚体fc结合，其中20个未占用的c3面。在所有情况下，计算设计的模型都明显符合em密度。[0188]用abc增强细胞信号[0189]设计的abc为研究细胞表面受体成簇结合对信号通路激活的影响提供了一个通用平台。由于天然配体的结合被阻断，抗体与细胞表面受体的结合可导致信号拮抗(25)。虽然在某些情况下，受体聚集已被证明可导致激活(11、26、27)，但还没有可以很容易地应用于许多不同信号通路的系统方法来改变受体结合的组配数(valency)和几何形状。我们利用了这样一个事实，即几乎任何受体结合抗体(其中有许多)都可以通过我们的abc成形设计很容易地组装成各种不同的构型，以研究受体聚集对信号传导的影响。我们将针对各种信号通路的抗体和fc融合物组装成纳米颗粒，并按照下文所述研究其效果。[0190]通过α-dr5纳米笼诱导肿瘤细胞凋亡[0191]死亡受体5(dr5)是一种肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族细胞表面蛋白，当其被三聚体天然配体、tnf相关凋亡诱导配体(trail)交联时，它会启动半胱天冬酶介导的凋亡信号级联，终止细胞死亡(9、10、27–30)。与家族其他成员一样，dr5也可以形成替换信号复合物，激活非凋亡信号通路，如nf-κb促炎通路和促进配体结合时增殖和迁移的通路(29)。由于dr5在一些肿瘤中过度表达，已经开发出多种候选方案来激活dr5，例如α-dr5单克隆抗体和重组trail，但由于疗效低和肿瘤细胞对trail产生耐药性，这些临床试验已失败(29，30)。三聚体trail与二价结合α-dr5igg导致的凋亡反应比任何一种组分本身都强烈得多，这可能是由于通过在细胞表面形成二维阵列诱导更大规模的dr5聚集所致(27)。[0192]我们研究了用相同igg(可那木单抗(conatumumab))形成的α-dr5abc是否可能具有类似的抗肿瘤作用，而不会形成未结合阵列。选择了四种几何形状的五种设计物(d2.4、t32.4、t32.8、o42.1和i52.3)来表示组配数和形状的范围(图4a)。发现全部的α-dr5abc在sec上形成单峰，并产生与组装颗粒形成一致的相应ns-em显微照片(图2d-e)。所有五个α-dr5abc导致半胱天冬酶3/7介导的凋亡水平与结直肠癌细胞系中的trail相似，而单独的抗体或仅fc形成的abc即使在测试的最高浓度下也不会导致半胱天冬酶-3/7激活或细胞死亡(图7a)。在trail耐药肾细胞癌细胞株rcc4上，我们发现α-dr5抗体诱导半胱天冬酶-3,7活性(图4b)，而且设计物t32.4、t32.8和o42.1在150nm浓度下显著降低细胞活力(图4c)。游离的α-dr5抗体或仅含fc的抗体没有激活半胱天冬酶，虽然发现trail激活半胱天冬酶-3,7，但这并没有导致四天后细胞活力的显著降低(图4b-c，图7b-c)。浓度降低100倍(1.5nm)的设计物t32.4和o42.1激活了半胱天冬酶，且用150nm的α-dr5abct32.4和o42.1延长处理rcc4在六天后几乎杀死了所有细胞，表明rcc4细胞没有获得对纳米笼的抗性(图4d)。α-dr5abc未诱导健康原代肾小管细胞凋亡(图7d-e)。[0193]接下来，我们研究了由α-dr5abc通过分析其对裂解的parp(凋亡活性的度量)以及nf-κb靶点cflip的影响。与半胱天冬酶和细胞活力数据一致，o42.1α-dr5抗体增加了裂解的parp，而游离α-dr5abc、trail或o42.1fcabc未导致裂解parp高于基线水平(图4e-f)。我们还观察到，经150nm的o42.1α-dr5八面体abc处理后，rcc4细胞中cflip表达降低(图4e-f)。这些结果表明α-dr5abc可通过抑制抗凋亡通路克服trail抗性，从而增强dr5超聚集诱导的凋亡级联反应。[0194]fc-血管生成素1纳米笼激活tie-2途径[0195]某些受体酪氨酸激酶(rtk)，如血管生成素-1受体(tie2)，在聚集时激活下游信号级联(31，32)。将血管生成素-1(a1f)的f结构域构建成支架到纳米颗粒上可诱导akt和erk磷酸化，增强体外细胞迁移和管形成，并改善体内损伤后的伤口愈合(32)。具有这些活性的药物可用于以细胞死亡和炎症为特征的疾病，如败血症和急性呼吸窘迫综合征(ards)。为了确定abc平台是否可用于产生此类激动剂，我们组装了o42.1和i52.3abc，其中fc融合到a1f(图4g，图4a-b)。八面体和二十面体a1fabc，而非仅fc对照或游离fc-ang1f，显著增加基线以上的akt和erk1/2磷酸化(图4h-i)，并增强细胞迁移和血管稳定性(图4j-k，图8c-d)。这些结果表明，与游离a1f-fc相比，abc是更有效的血管生成诱导剂，并且由于组分易于大量生产，因此它们是很有前景的候选药物。[0196]α-cd40纳米笼激活b细胞[0197]cd40是在抗原提呈树突状细胞和b细胞上表达的tnfr超家族成员，被t细胞上的三聚体cd40配体(cd40l或cd154)交联，导致信号传导和细胞增殖(33，34)。通过添加诸如表达proteinadomaincomplexedwiththefabfragmentofahumanigmantibody:structuralbasisforrecognitionofb-cellreceptorsandsuperantigenactivity.proceedingsofthenationalacademyofsciences.97(2000),pp.5399–5404.[0225]17.t.j.brunette,f.parmeggiani,p.-s.huang,g.bhabha,d.c.ekiert,s.e.tsutakawa,g.l.hura,j.a.tainer,d.baker,exploringtherepeatproteinunive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,a.khramushin,i.c.king,r.kleffner,b.koepnick,t.kortemme,g.kuenze,b.kuhlman,d.kuroda,j.w.labonte,j.k.lai,g.lapidoth,a.leaver-fay,s.lindert,t.linsky,n.london,j.h.lubin,s.lyskov,j.maguire,l.e.marcos,o.marcu,n.a.marze,j.meiler,r.moretti,v.k.mulligan,s.nerli,c.norn,s.’conchúir,n.ollikainen,s.ovchinnikov,m.s.pacella,x.pan,h.park,r.e.pavlovicz,m.pethe,b.g.pierce,k.b.pilla,b.raveh,p.douglasrenfrew,s.s.royburman,a.rubenstein,m.f.sauer,a.scheck,w.schief,o.schueler-furman,y.sedan,a.m.sevy,n.g.sgourakis,l.shi,j.b.siegel,d.-a.silva,s.smith,y.song,a.stein,m.szegedy,f.d.teets,s.b.thyme,r.y.-r.wang,a.watkins,l.zimmerman,r.bonneau,macromolecularmodelinganddesigninrosetta:recentmethodsandframeworks.nat.methods.17,665–680(2020).[0249]43.l.jendeberg,p.nilsson,a.larsson,p.denker,m.uhlén,b.nilsson,p.-.nygren,engineeringoffc1andfc3fromhumanimmunoglobulingtoanalysesubclassspecificityforstaphylococcalproteina.journalofimmunologicalmethods.201(1997),pp.25–34.[0250]44.d.corti,s.bianchi,f.vanzetta,a.minola,l.perez,g.agatic,b.guarino,c.silacci,j.marcandalli,b.j.marsland,a.piralla,e.percivalle,f.sallusto,f.baldanti,a.lanzavecchia,cross-neutralizationoffourparamyxovirusesbyahumanmonoclonalantibody.nature.501,439–443(2013).[0251]45.k.n.dyer,m.hammel,r.p.rambo,s.e.tsutakawa,i.rodic,s.classen,j.a.tainer,g.l.hura,high-throughputsaxsforthecharacterizationofbiomoleculesinsolution:apracticalapproach.methodsmol.biol.1091,245–258(2014).[0252]材料和方法[0253]fc-结合剂螺旋重复蛋白(dhr79fcb)的计算设计和测试[0254]使用phenixrosettatm(39，40)，利用结构因子使金黄葡萄球菌蛋白a与fc片段(pdbid:1l6x)复合物中b结构域的晶体结构松散化。简而言之，rosettascriptstmmotifgraft移动器用于评估将从1l6x中提取的蛋白a结合基序插入先前报道的设计螺旋重复蛋白(dhr79)的合适解决方案(17)。具体而言，手动定义和提取一个最小蛋白a结合基序，并将其用作dhr79全骨架对准的模板，同时保留用户指定的热点残基，这些热点残基与fc/dhr界面晶体结构中的fc结构域相互作用，并在所有其他位置保留天然dhr残基。motifgraft校准后，进行了5次fastdesign迭代和5次fastrelax迭代，其中dhr侧链和主链旋转器可以在fc完全固定的情况下移动。根据启发式过滤值列表选择最佳设计。有关设计期间使用的完整xml文件，请参阅补充资料。图6a示出了dhr79fcb的设计模型。[0255]设计最初通过酵母表面呈现结合生物素化fc蛋白进行评估。在确认了一个定性结合信号后，将该设计封闭在带有c末端his标签的pet29b表达载体中。该蛋白在bl21de3中以225rpm(41)于27℃的自诱导培养基(10ml50×m，10ml50×5052，480ml近(almost)tb，1×氯霉素，1×卡那霉素)中表达20小时。细胞在裂解缓冲液(20mmtris，300mmnacl，30mm咪唑，1mmpmsf，5％甘油(v/v)，ph8.0)中重悬，并在18000psi下使用微流控器进行裂解。通过24000×g离心分离可溶性部分。采用imac和ni-nta批量树脂进行初步纯化；简而言之，镍-硝基三乙酸(ni-nta)树脂与结合缓冲液(20mmtris，300mmnacl，30mm咪唑，ph8.0)平衡，将可溶性裂解液倒在柱上，用20个柱体积的结合缓冲液清洗柱，并用5cv的洗脱缓冲液洗脱(20mmtris，300mm氯化钠，500mm咪唑，ph8.0)。使用带superdex200谱柱的尺寸排除谱法(sec)作为精细纯化(polish)步骤(图6b)。sec缓冲液为20mmtris/hcl，ph7.4，150mmnacl。[0256]使用octettm生物膜层干涉(bli)评估dhr79fcb对生物素化igg1和生物素化fc蛋白的亲和力。dhr79fcb对igg1(全抗体)的亲和力为71.7nm，对igg2fc蛋白的亲和力是113nm(图6c)。[0257]抗体纳米笼的计算设计[0258]输入pdb文件被编译为用于生成抗体笼的构建块。对于蛋白a结合剂模型，来自金黄葡萄球菌蛋白a(pdbid1dee)的结构域d和与fc结合的蛋白a的b结构域(pdbid1l6x)对齐(16，39)。另一个fc结合设计结构(其中蛋白a被接枝到螺旋重复蛋白上)，也使用来自1l6x的fc建模。单体螺旋重复蛋白接头(42)和循环寡聚体(2个c2、3个c3、1个c4和2个c5)的pdb文件模型至少已经通过saxs验证，这些模型是根据我们实验室以前的工作编译而来的(17–19)。人工检查构建块模型，以确定哪些氨基酸适合在不破坏现有蛋白质-蛋白质界面的情况下进行融合。[0259]这些构建块与指定的几何形状和融合方向一起被用作α螺旋融合软件的输入(关于如何操作worms的补充文本)(20、21)。融合是由所有可能允许的氨基酸位点上重叠的螺旋段形成的。然后根据几何标准评估融合的循环对称轴相交偏差：d2、t32、o32、o42、i32和i52交角分别为45.0°、54.7°、35.3°、45.0°，20.9°和31.7°，角度和距离公差分别为5.7°和post-fusion.pdb文件被手动过滤，以确保fc结构域的n端从笼中向外，从而使igg的fab位于笼表面的外部。序列设计是使用rosettatm对称序列设计(rosettascriptstm中的sympackrotatmersmover)对融合点及其周围的残基(42)进行的，重点是尽可能多地保持天然残基。如果残基与其他残基发生冲突，或者如果其化学环境在融合后发生变化(例如，以前的堆芯表面残基现在暴露在溶剂中)，则重新设计残基。索引残基选择器用于防止在fc残基位置的设计。[0260]抗体纳米笼的结构表征[0261]针对每个设计的抗体纳米笼形成寡聚体的细菌表达对基因进行密码子优化，附加了一个c端甘氨酸/丝氨酸接头和6×c端组氨酸标签。将合成基因克隆到ndei和xhoi限制位点之间的pet29b+载体中；质粒包含一个卡那霉素抗性基因和用于蛋白质表达的t7启动子。按照制造商(newenglandbiolabs)的描述，使用15秒的热休克程序将质粒转化为具有化学活性的lemo21(de3)大肠杆菌。如上所述，将转化细胞添加到自动诱导表达培养基中，并在37℃和200rpm振摇下培养16小时(41)。细胞以4000×g离心沉淀，并重新悬浮在裂解缓冲液中(150mmnacl，25mmtrishcl，ph8.0，添加蛋白酶抑制剂和dnase)。以85％振幅进行超声以溶解细胞，15秒开/关循环，总共2分钟的超声时间。通过16000×g离心分离可溶性物质。imac用于分离上述可溶性部分中的his标签蛋白。使用10kmwco旋转浓缩器将imac洗脱液浓缩至约1ml，通过0.22um旋转过滤器过滤，并在sec上运行，作为最终精细纯化步骤(sec运行缓冲液：150mmnacl，25mmtrishcl，ph8.0)。[0262]在预期保留体积周围产生单分散sec峰的设计物与来自人igg1的fc结合。fc是使用标准方法在hek293t细胞或大肠杆菌中表达的重组产生的(43)。笼组分在4℃下培养至少30分钟。在组装过程中，向用i52.6设计物形成的abc中添加100mml-精氨酸，因为观察到这可以最大限度地形成设计的abci52.6，并最大限度地减少可见“破碎”聚集物的形成(23)。通过sec确认fc结合和笼形成；保留时间的更早变化(与单独运行的任一组分相比)表明形成了更大的结构。如前所述，ns-em用于确认通过这些步骤的设计结构。[0263]为了确认具有完整igg的abc结构，根据相同的fc笼制作方案，将人igg1(higg1)与abc成形设计物相结合。下文报告的所有igg或fc融合抗体也遵循了此组装程序。图2d-e中的数据显示了由α-dr5抗体amg-655(23)形成的用于以下设计的abc：d2.3、d2.4、d2.7、t32.4、o42.1和i52.3。图2d-e所示t32.8和i52.6设计的数据来自higg1抗体mpe8(44)形成的abc。表9和表10示出了形成abc的igg和fc融合的列表。[0264]动态光散射测量(dls)在uncletm(unchainedlabs)上使用默认的尺寸和多分散性方法进行。用移液管将8.8μl的abc移入所提供的分类试管中。dls测量在25℃下进行三次，孵育时间为1秒；使用graphpadprism对结果进行平均并绘制。估计的流体动力学直径列在所有dls峰值旁边，如下所示。[0265]fc和iggabc的ns-em分析[0266]对于除o42.1fc和i52.3fc以外的所有样品，将3.0μl在0.008-0.014mg/ml范围内的tbs(ph8.0)中的每份sec纯化样品涂在400目或200目铜栅极辉光放电碳涂层铜栅极上20秒，然后2倍涂敷3.0μl2％nano-w染剂。使用leginon软件在120kvfeitecnaig2spirittm上用gatanultrascantm40004k×4kccd摄像机以67000标称放大率(像素大小/像素)或52000标称放大率(像素大小/像素)，1.5–2.5μm的离焦范围记录显微照片。使用dogpicker或cistem摄取颗粒；两者都是无参照选取器。使用gctf或cistem评估对比度传递函数。在cronicsparc或cistem中生成2d聚类平均值。在cryosparc或cistem中对每个数据集的选定2d聚类平均值进行无参照从头3d重建(表11)。[0267]表10.不同纳米笼样品的数据采集和数据处理详情。[0268][0269][0270]o42.1和i52.3abc的低温电镜分析[0271]将3.0μli52.3fc样品(0.8mg/ml，tbsph8.0，含100mm精氨酸)涂敷在1.2μmc平面辉光放电铜格栅上。然后将格栅插入液态乙烷中冷冻，使用feimk4vitrobot和液氮冷却，吸液时间为6秒，力为0。在20℃和100％湿度的条件下，在virtrobot室内进行吸液过程。使用leginon数据采集软件在200kvfeitalos电子显微镜和gatank2summit相机上进行数据采集。标称放大倍数为36000×，像素大小为/像素。剂量率调整为8次/像素/秒。每一部(movie)都是在计数模式下采集的，分为50帧，每帧200毫秒。使用motioncorr2执行帧对齐。在appion界面中手动摄取颗粒。使用gctf估计离焦参数。使用无对照2d聚类和cronicsparc，为cronicparc中的ab-initio3d重建功能选择颗粒子集。[0272]数据采集和处理汇总见表11。[0273]dr5和a1f-fc实验[0274]细胞培养[0275]从atcc获得大肠腺癌细胞系colo205和肾细胞癌细胞系rcc4。原代肾小管上皮细胞ram009是akilesh博士(华盛顿大学)的赠与。colo205细胞在含有10％胎牛血清(fbs)和青霉素/链霉素的rpmi1640培养基中生长。rcc4细胞在含有10％fbs和青霉素/链霉素的dulbecco改良eagle’s培养基中生长。ram009在含有10％fbs、its补充剂、青霉素/链霉素和非必需氨基酸(neaa)的rpmi中生长。所有细胞系均保持在37℃的含5％co2的增湿气氛中。[0276]人脐静脉内皮细胞(huvec，lonza，德国，目录号c2519as)在0.1％明胶涂层的egm2培养基中的35mm细胞培养皿上生长。简而言之，egm2由20％胎牛血清、1％青霉素链霉素、1％谷氨酰胺(gibco，目录号35050061)、1％内皮细胞生长因子(31)、1mm丙酮酸钠、7.5mmhepes、0.08mg/ml肝素、0.01％两性霉素b组成，含和不含葡萄糖的1×rpmi1640混合物，在终体积中达到5.6mm葡萄糖浓度。培养基通过0.45微米过滤器过滤。第7代的huvec用于tie2信号传导和细胞迁移实验。第6代的huvec用于血管形成分析。[0277]半胱天冬酶3/7glo分析[0278]使用胰蛋白酶传代细胞，将20000个细胞/孔接种到96孔白组织培养板上，并在适当的培养基中生长。第二天更换培养基(100μl/孔)，用未成笼α-dr5amg655抗体(150nm)、重组人tnf相关凋亡诱导配体(rhtrail；150nm)、仅fcabc或α-dr5abc(150nm、1.5nm、15pm)处理细胞，并在37℃下培养24小时。第二天，在培养基顶部添加100μl/孔半胱天冬酶glotm试剂(美国promega)，并在37℃下培养2小时。然后使用perkinenvision酶标仪(perkinelmer)记录发光。使用graphpadprismtm进行统计比较(详情见表11)。[0279]表11.dr5实验的统计信息。[0280][0281][0282][0283][0284][0285][0286][0287][0288][0289]滴定glo细胞活力测定(4天活力)[0290]细胞以20000个细胞/孔平铺到96孔板上。第二天，用150nm的α-dr5abc、rhtrail和α-dr6抗体处理细胞4天。第4天，将100μlcelltiterglo试剂(美国promega公司，#g7570)添加到每孔100μl培养基中，在37℃下培养10分钟，并使用perkin-elmerenvision酶标仪10％sds-page凝胶上以250伏电压分离30分钟。然后，使用半干涡轮转移免疫印迹仪(bio-rad，美国)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上12分钟。转移后，将膜在5％脱脂奶粉中封闭1小时。1小时后，用相应的抗体对膜进检测：以1:2000的稀释度裂解parp(cellsignaling，美国)；cflip(researchsystem，美国)，稀释度为1:1000；perk1/2(cellsignaling)，1:5000稀释；pfak(cellsignaling)1:1000稀释；1:2000稀释的p-akt(s473)(cellsignaling)；和肌动蛋白(cellsignaling，美国)，稀释度为1:10000。另外，对于p-akt(s473)，在添加一级抗体后，在5％bsa中封闭膜3小时。将带有一抗的膜在4℃的摇床上培养过夜。第二天，用1×tbst清洗膜(3次，间隔10分钟)，添加相应的hrp结合二抗(bio-rad，美国)(1:10000)，并在室温下培养1小时。对于p-akt(s473)，清洗后，将膜在室温下的5％牛奶中封闭1小时，然后在5％牛奶中制备的相应hrp结合二抗(1:2000)中孵育2小时。二抗孵育后，用1×tbst(3次，间隔10分钟)冲洗所有膜，并使用鲁米诺试剂进行显影，并使用bio-radchemidoctm成像仪进行成像。使用imagejtm软件量化数据，以分析条带强度。通过计算每个条带的峰面积进行量化。每个信号都归一化为来自同一凝胶通道的肌动蛋白定量，以便进行交叉凝胶比较。然后计算所有样本与pbs相比的倍数变化，但a1f-fc蛋白印迹报告的pakt除外(没有足够的pakt信号进行比较，因此使用o42.1a1f-fc进行归一化)。使用graphpadprismtm进行统计比较(详见表11和表12)。[0300]表12.a1f-fc实验的统计信息[0301][0302][0303][0304]管腔形成分析(血管稳定性)[0305]使用liang等人2007年的改良方案进行管腔形成。简单地说，将第6代huvec接种到24孔板上，板预包被150μl100％冷matrigeltm(corning，美国)，密度为150000个细胞/孔，以及89nma1f-fc浓度的支架或添加0.5％fbs的低血糖dmem培养基中的pbs，持续24小时。在24小时的时间点，吸出旧培养基并用无支架的新培养基替换。细胞继续培养至72小时。细胞在48小时和72小时的时间点用leica显微镜反相下放大10倍成像。此后，通过使用imagej软件中的angiogenesisanalyzer插件计算节点、网格和管腔的数量，对管腔结构进行量化。血管稳定性是通过平均节点、网格和管腔的数量，然后归一化为pbs来计算的。使用graphpadprismtm进行统计比较(详情见表12)。[0306]免疫细胞激活材料和方法[0307]cd40发光分析[0308]如上文所述，将非竞争性抗体(克隆lob7/6，产品代码mca1590t，biorad)与如上所述的八面体o42.1abc成形设计结合，abc用dls和ns-em对abc进行表征(图5)。使用非cd40结合igg(mpe8)制成阴性对照o42.1abc，该igg与rsv峰蛋白(45)结合。将这两个abc，连同未笼化的lob7/6和阳性对照cd40激活igg(promega，目录号k118a)稀释成10点、三倍稀释系列，用于从1.2μm开始的三次重复技术。阳性对照cd40激活igg(k118a)是一种小鼠igg1a抗体，因此它与o42.1设计不兼容，可能是由于蛋白a和migg1b之间的结合界面较低(数据未示出)。[0309]为了检测cd40的激活，我们按照制造商的说明进行了基于生物发光细胞的检测，该检测用于测量cd40对igg等外部刺激的反应效力(promega，ja2151)。简而言之，cd40效应物中国仓鼠卵巢(cho)细胞被培养，并根据检测方案制备试剂。抗体和abc与cd40效应物cho细胞在37℃、5％co2下孵育8小时。使用检测试剂盒中的bio-glotm荧光素酶检测系统(g7941)根据平板读取器的发光读数观察cd40的激活。将bio-glotm试剂应用于细胞，并通过synergyneo2平板阅读器每分钟检测一次发光，持续30分钟。通过重复样品之间的平均发光减去平板背景来分析数据。cd40结合反应的倍数诱导由归一化为无抗体对照的rlu样本的rlu确定。绘制数据曲线，并使用graphpadprismtm计算ec50，使用对数(激动剂)与反应——可变斜率(四参数)；ec50值和95％ci值见表7。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.一种多肽，其氨基酸序列与选自seq id no:1-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，其中括号中的残基是任选的(即：在百分比同一性要求中不考虑)，其中，所述多肽能够(a)组装成聚合物，包括但不限于均聚物，以及(b)结合到igg抗体的恒定区。2.根据权利要求1所述的多肽，其中，如表2所示，在seq id no:1-9中任何一种多肽的聚合物中，存在于聚合物界面的氨基酸残基是保守的。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中表3中定义的存在于fc结合界面的氨基酸残基是保守的。4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中相对于参考序列的氨基酸替换包含参考多肽中极性残基的替换、基本由参考多肽中极性残基的替换组成或由参考多肽中极性残基的替换组成。5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中相对于参考序列的氨基酸替换包含参考多肽环位置非gly/pro残基的极性残基的替换、基本由参考多肽环位置非gly/pro残基的极性残基的替换组成或由参考多肽环位置非gly/pro残基的极性残基的替换组成，如表4所定义。6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述参考多肽的氨基酸改变为保守氨基酸替换。7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与选自seq id no:2-3、5-6和8-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，其进一步包含共价连接至氨基末端及/或羧基末端的功能多肽。9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述功能多肽可包括但不限于诸如荧光或发光多肽、受体结合域等的可检测多肽。10.一种编码权利要求1-9中任一项所述多肽的核酸。11.一种表达载体，包含与控制序列可操作连接的权利要求10所述的核酸。12.包含任何前述权利要求所述的多肽、核酸和/或表达载体的宿主细胞。13.根据权利要求1-9中任一项所述的多肽的聚合物，其中(i)聚合物中的每个单体包含与seq id no:1的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(ii)聚合物中的每个单体包含与seq id no:2的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(iii)聚合物中的每个单体包含与seq id no:3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(iv)聚合物中的每个单体包含与seq id no:4的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％相同的氨基酸序列；(v)聚合物中的每个单体包含与seq id no:5的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(vi)聚合物中的每个单体包含与seq id no:6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(vii)聚合物中的每个单体包含与seq id no:7的氨基酸序至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％列相同的氨基酸序列；(viii)聚合物中的每个单体包含与seq id no:8的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(ix)聚合物中的每个单体包含与seq id no:9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；其中括号中的残基是任选的(即：在百分比同一性要求中不考虑)。14.根据权利要求13所述的聚合物，其中所述聚合物包含具有某些氨基酸差异的单体。15.根据权利要求13所述的聚合物，其中聚合物中的每个单体都是相同的。16.根据权利要求13-15中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物包含二聚体。17.根据权利要求16所述的聚合物，其中所述二聚体包含多肽，所述多肽包含与选自seq id no:1-3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。18.根据权利要求13-15中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物包含三聚体。19.根据权利要求18所述的聚合物，其中所述三聚体包含多肽，所述多肽包含与选自seq id no:4-6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。20.根据权利要求13-15中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物包含四聚体。21.根据权利要求20所述的聚合物，其中所述四聚体包含多肽，所述多肽包含与seq id no:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。22.根据权利要求13-15中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物包含五聚体。23.根据权利要求22所述的聚合物，其中所述五聚体包含多肽，所述多肽包含与选自seq id no:8-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。24.一种颗粒，包括：(a)根据权利要求13和15-23中任一项所述的多个相同聚合物；和(b)包含fc结构域的多个抗体；其中
(i)所述多个抗体中的每一抗体包括第一fc结构域和第二fc结构域；(ii)多个抗体中的每个抗体(a)通过第一fc结构域与第一均聚物的一条多肽单体链非共价结合，以及(b)通过第二fc结构域与第二均聚物中的一条多肽单体非共价结合；(iii)每个均聚物的每个多肽单体链与一个fc结构域非共价结合；其中所述颗粒包含二面体、四面体、八面体或二十面体对称。25.根据权利要求24所述的颗粒，其中所述多个均聚物包含多肽的均聚物，所述多肽包含与选自seq id no:1-3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。26.根据权利要求24所述的颗粒，其中所述多个均聚物包含多肽的同源三聚体，所述多肽包含与选自seq id no:4-6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。27.根据权利要求24所述的颗粒，其中所述多个均聚物包含多肽的同源四聚体，所述多肽包含与seq id no:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。28.根据权利要求24所述的颗粒，其中所述多个均聚物包含多肽的同源五聚体，所述多肽包含选自seq id no:8-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。29.一种颗粒，包括：(a)多种多肽聚合物，其中(i)聚合物中的每个单体包含与seq id no:1的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(ii)聚合物中的每个单体包含与seq id no:2的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(iii)聚合物中的每个单体包含与seq id no:3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(iv)聚合物中的每个单体包含与seq id no:4的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(v)聚合物中的每个单体包含与seq id no:5的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(vi)聚合物中的每个单体包含与seq id no:6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(vii)聚合物中的每个单体包含与seq id no:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(viii)聚合物中的每个单体包含与seq id no:8的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(ix)聚合物中的每个单体包含与seq id no:9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；其中括号中的残基是任选的(即：在百分比同一性要求中不考虑)；和(b)包含fc结构域的多个抗体，其中(i)所述多个抗体中的每一抗体包括第一fc结构域和第二fc结构域；(ii)多个抗体中的每一抗体(a)通过第一fc结构域与第一聚合物的一条多肽单体链非共价结合，以及(b)通过第二fc结构域与第二聚合物的一个多肽单体非共价结合；(iii)每种聚合物的每个多肽单体链与一个fc结构域非共价结合；其中所述颗粒包含二面体、四面体、八面体或二十面体对称。30.根据权利要求29所述的颗粒，其中所述聚合物包含具有某些氨基酸差异的单体。31.根据权利要求29或30所述的颗粒，其中所述颗粒包含非同源寡聚体的聚合物。32.根据权利要求29-31中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒中的每个聚合物都是相同的。33.根据权利要求29所述的颗粒，其中每个聚合物中的每个单体都是相同的，并且每个聚合物都是均聚物。34.根据权利要求33所述的颗粒，其中所述颗粒中的每个均聚物都是相同的。35.根据权利要求29-34中任一项所述的颗粒，其中所述多个聚合物包含多肽的二聚体，所述多肽包含与选自seq id no:1-3的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。36.根据权利要求29-34中任一项所述的颗粒，其中所述多个聚合物包含多肽的三聚体，所述多肽包含与选自seq id no:4-6的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。37.根据权利要求29-34中任一项所述的颗粒，其中所述多个聚合物包含多肽的四聚体，所述多肽包含与seq id no:7的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。38.根据权利要求29-34中任一项所述的颗粒，其中所述多个聚合物包含多肽的五聚体，所述多肽包含与选自seq id no:8-9的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
39.根据权利要求29-38中任一项所述的颗粒，其中存在于表2中所定义的聚合物界面上的氨基酸残基在seq id no:1-9中任一多肽的聚合物中是保守的。40.根据权利要求29-39中任一项所述的颗粒，其中存在于表3中定义的seq id no:1-9中任一个的fc结合界面上的氨基酸残基是保守的。41.根据权利要求29-40中任一项所述的颗粒，其中相对于seq id no:1-9中任一个的参考序列的氨基酸替换包含参考多肽中极性残基的替换、基本由参考多肽中极性残基的替换组成或由参考多肽中极性残基的替换组成。42.根据权利要求29-41中任一项所述的颗粒，其中，与seq id no:1-9中任一项的参考序列相关的氨基酸替换包含参考多肽环位置中非gly/pro残基的极性残基的替换、基本由参考多肽环位置中非gly/pro残基的极性残基的替换组成或由参考多肽环位置中非gly/pro残基的极性残基的替换组成，如表4所定义。43.根据权利要求29-42中任一项所述的颗粒，其中，来自seq id no:1-9中任一个的参考多肽的氨基酸变化是保守氨基酸替换。44.根据权利要求24-43中任一项所述的颗粒，其中所述抗体选择性地结合到靶标，所述靶标包括但不限于病原体特异性抗原(包括但不限于细菌、病毒、原生动物或其他病原体抗原)、细胞表面受体，疾病相关抗原(包括但不限于肿瘤细胞抗原、阿尔茨海默病和其他淀粉样蛋白疾病的β-淀粉样蛋白)、酶、生长因子、毒素、小分子、诊断相关肽或表5中列出的抗体或抗原，或一种或多种肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型等)病毒、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒的抗原、巨细胞病毒、冠状病毒，包括但不限于mers-cov(中东呼吸综合征相关冠状病毒)和严重急性呼吸综合征相关性冠状病毒(包括sars-cov和sars-cov-2)、eb病毒、流感病毒、副流感病毒、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、人体免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、埃博拉病毒、巨细胞病毒、马尔堡病毒、诺如病毒、天花病毒，任何黄病毒属，包括但不限于西尼罗河病毒、黄热病病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒和日本脑炎病毒；人类免疫缺陷病毒(hiv)、杆菌、百日咳杆菌、沙眼衣原体、破伤风梭菌、艰难梭菌、白喉棒状杆菌、贝氏柯克氏体、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、杜诺凡利什曼原虫、热带乳杆菌和巴西乳杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、脑膜炎奈瑟菌、恶性疟原虫、卵形疟原虫、疟疾疟原虫和间日疟原虫、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、血吸虫、曼氏血吸虫、肺炎链球菌(a组和b组)、金黄葡萄球菌、弓形虫、布氏锥虫、克氏锥虫和弧菌。45.一种组合物，其包含权利要求24-44中任一项中的多个颗粒。46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述组合物中的所有抗体对相同抗原具有选择性。47.根据权利要求45所述的组合物，其中所述组合物中的抗体总共对两种或多种不同抗原具有选择性。48.一种药物组合物，包含(a)本文任何权利要求的多肽、聚合物、颗粒或组合物，以及(b)药学上可接受的载体。49.多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、聚合物、颗粒、组合物或药物组合物用于任何适当的用途，包括但不限于示例中所述的用途，包括用于颗粒和组合物中存在的抗体的诊断或用途。
50.实施例中公开的多肽计算设计方法。51.任何前述权利要求中的多肽或颗粒，其中所述多肽或颗粒以共价或非共价方式连接到一种或多种化合物，以促进体内半衰期的延长，包括但不限于聚乙二醇化、羟乙基淀粉化、pas化或糖基化。

技术总结

本发明公开了包含(Fc)结合结构域、螺旋多肽单体和寡聚体结构域的多肽，其聚合物及其用途。途。

技术研发人员：

罗伯特

受保护的技术使用者：

华盛顿大学

技术研发日：

2021.06.07

技术公布日：

2022/12/29