预防或轮状病毒感染的微生物代谢物制剂及其用途

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种预防或轮状病毒感染的微生物代谢物制剂及其用途。更具体地，本发明涉及一种包含高丝氨酸的微生物代谢物制剂及其用途。

背景技术：

2.轮状病毒感染引起的婴幼儿腹泻是儿科常见疾病，在小儿腹泻中轮状病毒性肠炎具有高达50％的发病率，每年全世界因轮状病毒感染而死亡的婴幼儿超过100万人，是who和我国重点防治的疾病之一。轮状病毒除了会导致患儿出现肠道内感染，还会引发脱水、呕吐、发热和腹泻等一系列症状。采取积极有效的措施加以对于小儿轮状病毒性肠炎的患儿具有重要的意义。目前，对轮状病毒腹泻实施的过程中，大多采用抗病毒广谱药物，但效果并不理想，无法满足临床需求。
3.当前防治轮状病毒感染的最有效方式是接种疫苗，2018年4月12日，默沙东公司的五价轮状病毒疫苗获得国家药品监督管理局的上市批准，成为我国首个多价轮状病毒疫苗。但是，疫苗的推广和普及仍然需要较长的时间。此外，尽管疫苗的使用可以显著减少重症患儿的数量和症状，由于轮状病毒极快的突变和重组速度，仍然不能完全消除轮状病毒对婴幼儿的感染。因此，开发临床的药物，加快患儿的恢复速度，依然是轮状病毒研究中的当务之急。

技术实现要素：

4.针对轮状病毒临床缺乏特效药的现况，本发明提供了一种氨基酸药物，经实验发现，添加该氨基酸药物可以在体外显著减少轮状病毒易感细胞ht-29和ma-104中病毒的拷贝数，抑制轮状病毒的感染，在小鼠体内使用该氨基酸药物，可以显著减少小鼠的轮状病毒感染腹泻症状，显著抑制轮状病毒感染。
5.本发明提供了一种可以在体外显著抑制轮状病毒感染的氨基酸—高丝氨酸(图1)。高丝氨酸(c4h4no4)是一种微生物的代谢物，是苏氨酸、甲硫氨酸和胱硫醚生物合成的中间产物，存在于细菌的肽聚糖中，也存在于人体的血液、尿液和粪便中。高丝氨酸是丝氨酸的一种活跃变体，不适合形成蛋白质。本发明通过实验发现，高丝氨酸可以在体外显著抑制轮状病毒的感染，在体外，终浓度为20mm的高丝氨酸可以在宿主细胞人结肠细胞ht-29和猴肾细胞ma-104细胞中显著减少猴轮状病毒rrv的感染，并且这种抗病毒能力是剂量依赖的。
6.本发明还对高丝氨酸在小鼠体内的抗病毒能力进行了检测，发现高丝氨酸可以在体内显著抑制轮状病毒的感染。相比对照组，腹腔注射了高丝氨酸的小鼠肠道组织中轮状病毒含量显著减少，高丝氨酸药物的腹腔注射表现出了良好的体内抗轮状病毒能力，对组织病毒的复制和腹泻症状的减轻均有显著疗效，而小鼠并无明显不良反应。
7.基于上述研究，一方面，本发明提供了一种药物组合物，其用于预防、抑制或受试者的轮状病毒感染或由轮状病毒感染导致的腹泻，所述药物组合物包括高丝氨酸。
8.在一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
9.在一些实施方式中，所述药物组合物为口服剂或注射剂。
10.在一些实施方式中，所述轮状病毒包括但不限于轮状病毒ew株和轮状病毒rrv株。
11.在一些实施方式中，所述受试者为人或动物。
12.在一些实施方式中，所述受试者为婴儿或幼儿。
13.另一方面，本发明提供了高丝氨酸在制备预防、抑制或受试者的轮状病毒感染的药物组合物中的用途。
14.又一方面，本发明提供了高丝氨酸在制备预防或受试者由轮状病毒感染导致的腹泻的药物组合物中的用途。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
16.1.本发明发现轮状病毒感染能够显著减少肠道高丝氨酸的含量；
17.2.高丝氨酸体外使用可以有效抑制轮状病毒在宿主细胞中的复制和扩增；
18.3.体内药物的使用有效抑制了轮状病毒感染造成的腹泻表型，有效抑制了肠道轮状病毒的感染；
19.4.高丝氨酸具有生物相容性和安全性，轮状病毒感染过程中使用该高丝氨酸药物，不影响小鼠的存活。
附图说明
20.图1为高丝氨酸的化学结构式；
21.图2为本发明实施例中轮状病毒感染组和对照组的组织原位质谱检测结果，使用学生t检验对两组数据的显著程度进行统计学计算，*：p《0.05； **：p《0.01；***：p《0.001；
22.图3为本发明实施例中感染轮状病毒的恒河猴肾细胞中病毒基因表达量，使用学生t检验对各组数据的显著程度进行统计学计算，*：p《0.05； **：p《0.01；***：p《0.001；
23.图4为本发明实施例中感染轮状病毒的人结直肠癌细胞中病毒基因表达量，使用学生t检验对两组数据的显著程度进行统计学计算，*：p《0.05； **：p《0.01；***：p《0.001，ns表示两组数据没有显著差异
24.图5a为本发明实施例中轮状病毒感染2天时病毒基因表达量和小鼠腹泻的比例，使用学生t检验对各组数据的显著程度进行统计学计算，*： p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001；
25.图5b为本发明实施例中轮状病毒感染4天时病毒基因表达量和小鼠腹泻的比例，使用学生t检验对各组数据的显著程度进行统计学计算，*： p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001，ns表示两组数据没有显著差异。
具体实施方式
26.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
27.实施例1质谱检测轮状病毒感染组相对于对照组发生变化的物质
28.通过组织原位质谱技术，将感染小鼠轮状病毒ew株(来自美国圣路易斯华盛顿大学，参见nature.2017jun 29；546(7660):667-670,doi: 10.1038/nature22967.epub 2017jun 21.)10dd50(1dd50代表了该剂量病毒感染小鼠后野生型小鼠50％的小鼠发生腹
泻，10dd50剂量为1dd50 的10倍)的感染组(感染2天，3只)c57小鼠肠道与对照组(3只)小鼠肠道组织包埋，冰冻切片，对切片进行组织原位质谱检测，得到肠道组织中不同代谢物的含量，到变化差异明显的代谢物。部分检测结果如下表所示(各代谢物含量以感染组平均值的相对含量表示)：
[0029][0030]
如图2所示，通过对比感染组和对照组的组织原位质谱检测结果，我们发现高丝氨酸在肠道中的含量在感染后显著减少，对照组中高丝氨酸相对含量是感染组的大约四倍。因此，在下面的实施例中，我们选取高丝氨酸来研究其对轮状病毒的作用。
[0031]
实施例2高丝氨酸对感染轮状病毒的恒河猴肾细胞的体外抑制作用
[0032]
宿主细胞恒河猴肾ma-104细胞按照5*105每孔铺于24孔细胞培养板，将高丝氨酸(mce,hy-w002292)按照5mm、10mm、20mm浓度加入培养宿主细胞恒河猴肾ma-104细胞的dmem培养基作为高丝氨酸处理组，而对照组在培养基中不添加代谢物，而是只添加用来溶解代谢物的水。将高丝氨酸处理组和对照组按照5％co2和37℃的培养条件进行培养，然后分别加入猴轮状病毒rrv(病毒滴度5*106ffu/ml，来自美国圣路易斯华盛顿大学，参见nature.2017jun 29；546(7660):667-670,doi: 10.1038/nature22967.epub 2017jun 21.)，按照感染复数0.1进行感染，12 小时后提取细胞rna，使用trizol试剂(天根生化科技(北京)有限公司，产品编号：dp424)，加入氯仿和异丙醇，按照说明手册进行rna抽提，通过rt-qpcr方法，使用sybr green qpcr酶(南京诺维赞生物科技股份有限公司，hiscriptiii rt supermix for qpcr+gdna wiper r323-01； sybr qpcr master mix q311-03)对轮状病毒基因nsp2和vp7进行pcr 检测，pcr过程按照产品说明手册严格执行，观察高丝氨酸对轮状病毒体外感染宿主细胞的病毒基因nsp2和vp7复制情况的影响。
[0033]
通过rt-qpcr对轮状病毒感染宿主细胞ma104细胞进行检测，轮状病毒基因nsp2和vp7相对于管家基因gapdh的表达量如下表所示。
[0034][0035]
其中，rt-qpcr中使用的引物如下：
[0036]
vp7-f:acggcaacatttgaagaagtc(seq id no:1)
[0037]
vp7-r:tgcaagtagcagttgtaacatc(seq id no:2)
[0038]
nsp2-f:gagaatcatcaggacgtgctt(seq id no:3)
[0039]
nsp2-r:cggtggcagttgtttcaat(seq id no:4)
[0040]
gapdh-f:tgcaccaccaactgcttagc(seq id no:5)
[0041]
gapdh-r:ggaaggccatgccagtga(seq id no:6)
[0042]
如图3所示，其中nsp2和vp7分别是轮状病毒的一个基因，其表达量的高低代表了病毒复制的快慢和病毒的滴度，gapdh是管家基因，表达量不会被病毒感染所影响，因此作为qpcr的内参，用于均一化不同基因的表达量。在研究中，通常根据目标基因的表达量选取表达量相对比较接近的管家基因作为内参，在该实施例中以不同基因的表达量相对于gapdh 的表达量绘图，使不同样品可以进行横向的比较。结果发现培养基中添加不同浓度的高丝氨酸后，相比于在培养基中添加水的对照组，细胞中感染的轮状病毒基因的复制被有效抑制，因此添加该代谢物，可以有效抑制轮状病毒在宿主细胞中的复制，说明高丝氨酸具有良好的体外抗轮状病毒感染作用，且这种作用随着高丝氨酸的剂量增大而增强。
[0043]
实施例3高丝氨酸对感染轮状病毒的人结直肠癌细胞的体外抑制作用
[0044]
将人结肠癌ht-29细胞按照5*105每孔铺于24孔细胞培养板，将高丝氨酸(mce,hy-w002292)按照20mm浓度(肠道中生理浓度)加入培养人结肠癌ht-29细胞的dmem培养基作为高丝氨酸处理组，而对照组在培养基中不添加代谢物，而是只添加用来溶解代谢物的水，然后加入猴轮状病毒rrv，按照感染复数0.1进行感染，12小时后提取细胞rna，使用trizol试剂(天根生化科技(北京)有限公司，产品编号：dp424)，加入氯仿和异丙醇，按照说明手册进行rna抽提，通过rt-qpcr方法，使用sybr green qpcr酶(南京诺维赞生物科技股份有限公司，hiscriptiiirt supermix for qpcr+gdnawiper r323-01；sybr qpcr master mixq311-03)对轮状病毒基因nsp2和vp7进行pcr检测，pcr过程按照产品说明手册严格执行，观察高丝氨酸对轮状病毒体外感染宿主细胞的病毒基因nsp2和vp7复制情况的影响，并检测高丝氨酸添加对干扰素和下游干扰素刺激基因的影响。
[0045]
通过rt-qpcr对轮状病毒感染人肠道细胞ht-29细胞进行检测，检测结果如下表所示，其中各表达量是相对于管家基因gapdh的相对表达量。
[0046]
[0047]
结果如图4所示，干扰素β是细胞分泌的重要的抗病毒细胞因子，其表达量的高低代表了细胞的抗病毒能力，cxcl10是能够被干扰素诱导表达的重要的干扰素刺激基因。结果发现，培养基中添加20mm高丝氨酸后，病毒基因显著减少，表明高丝氨酸可以有效抑制轮状病毒在人肠道细胞中的复制，具有良好的体外抗轮状病毒感染作用，而干扰素β和下游干扰素刺激基因cxcl10的表达没有显著变化，说明高丝氨酸对病毒复制的抑制不依赖于干扰素。
[0048]
实施例4高丝氨酸对轮状病毒的体内抑制作用
[0049]
按照高丝氨酸20mm(肠道中生理浓度)，10ul/只腹腔注射5天大的 c57品系小鼠作为组，对照组腹腔注射等量的水，12h后按照10dd50/ 只小鼠(1dd50代表了该剂量病毒感染小鼠后野生型小鼠50％的小鼠发生腹泻，10dd50剂量为1dd50的10倍)的剂量灌胃小鼠轮状病毒ew 株(来自美国圣路易斯华盛顿大学，参见nature.2017jun 29；546(7660):667-670,doi:10.1038/nature22967.epub 2017jun 21.)，并每隔12h对小鼠进行腹腔注射，组注射10ul高丝氨酸(20mm)，对照组注射等量的水，直至2天或者4天杀鼠时。每天观察小鼠腹泻情况，打分(评分标准：0分，粪便形态正常，干燥。1分，粪便不成型，金黄，粘稠但不透明。2分，粪便不成型，含有透明液体和金黄粪便。3分，粪便不成型，基本是透明液体)。在2天(图5a)和4天(图5b)分别杀鼠(2天代表了感染的早期，4天代表了感染的中晚期，轮状病毒一般病程一周左右，取两个时间点的目的是研究不同时间点轮状病毒感染的程度)，利用rt-qpcr方法，使用sybr green qpcr酶(南京诺维赞生物科技股份有限公司，hiscriptiii rt supermix for qpcr+gdna wiperr323-01；sybr qpcr master mix q311-03)对轮状病毒基因nsp2和vp7 进行qpcr检测，qpcr过程按照产品说明手册严格执行，检测小鼠肠道组织中的病毒滴度和肠道上皮细胞中的病毒滴度，观察高丝氨酸对轮状病毒体内感染的影响。实验中没有小鼠在注射高丝氨酸后死亡。
[0050]
感染后第2天的rt-qpcr检测结果如下表所示(对照组5只，组 3只)，其中nsp2和vp7的表达量是相对于管家基因hprt的相对表达量。
[0051][0052]
感染后第4天的rt-qpcr检测结果如下表所示(对照组5只，组 5只)，其中nsp2和vp7的表达量是相对于管家基因hprt的相对表达量。
[0053][0054]
其中，rt-qpcr中使用的引物如下：
[0055]
vp7-f tcaaccggagacatttctga(seq id no:7)
[0056]
vp7-r ttgcgataacgtgtctttcc(seq id no:8)
[0057]
nsp2-f gagaatgttcaagacgtactcca(seq id no:9)
[0058]
nsp2-r ctgtcatggtgggtttcaatttc(seq id no:10)
[0059]
hprt-f acctctcgaagtgttggatacagg(seq id no:11)
[0060]
hprt-r cttgcgctcatcttaggctttg(seq id no:12)
[0061]
结果如图5a和图5b所示，其中hprt是管家基因，表达量不会被病毒感染所影响，因此作为qpcr的内参，用于均一化不同基因的表达量，以不同基因的表达量相对于hprt的表达量绘图，使不同样品可以进行横向的比较。hprt表达量低于gapdh表达量。由于感染小鼠后病毒基因nsp2 的表达量较低，因此在该实施例中选择表达量较gapdh低的hprt管家基因作为内参。
[0062]
从腹泻情况打分结果可以看出，轮状病毒感染后第2天开始，对照小鼠出现腹泻症状，表现为粪便颜金黄，含水量明显增加，小鼠腹部与下肢皮肤有明显的腹泻产生的粪便黏连。而腹腔注射了高丝氨酸的小鼠在感染后，相比对照小鼠，腹泻程度明显减轻，下肢和腹部皮肤洁净。
[0063]
在2天和4天时，检测小鼠肠道组织和肠道上皮细胞中的轮状病毒，从qpcr结果可以看出，相比对照组，腹腔注射了高丝氨酸的小鼠肠道组织和肠道上皮细胞中轮状病毒含量显著减少，同时腹泻程度明显减轻，说明高丝氨酸药物的腹腔注射表现出了良好的体内抗轮状病毒能力，对组织病毒的复制和腹泻症状的减轻均有显著疗效，而小鼠并无明显不良反应。
[0064]
因此，高丝氨酸可用于制备预防、抑制或轮状病毒感染的药物组合物，药物组合物还包括药学上可接受的载体。该药物组合物经腹腔注射、静脉输注、肌肉注射、口服施用给受试者。
[0065]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种药物组合物，其用于预防、抑制或受试者的轮状病毒感染或由轮状病毒感染导致的腹泻，其特征在于，所述药物组合物包括高丝氨酸。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为口服剂或注射剂。4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述轮状病毒包括但不限于轮状病毒ew株和轮状病毒rrv株。5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述受试者为人或动物。6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述受试者为婴儿或幼儿。7.高丝氨酸在制备预防、抑制或受试者的轮状病毒感染的药物组合物中的用途。8.高丝氨酸在制备预防或受试者由轮状病毒感染导致的腹泻的药物组合物中的用途。

技术总结

本发明提供了预防、抑制或受试者的轮状病毒感染或由轮状病毒感染导致的腹泻的药物组合物，所述药物组合物包括高丝氨酸。本发明还提供了高丝氨酸在制备预防、抑制或受试者的轮状病毒感染或由轮状病毒感染导致的腹泻的药物组合物中的用途。腹泻的药物组合物中的用途。

技术研发人员：

朱书 王安民 张国荣

受保护的技术使用者：

中国科学技术大学

技术研发日：

2021.06.30

技术公布日：

2022/12/29