肿瘤靶向药物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及肿瘤靶向药物及其应用。

背景技术：

2.肿瘤正在成为威胁人类健康的最严重疾病之一，而且随着人口的老龄化、工业化带来的环境污染和城市化等因素带来的生活习惯改变，肿瘤患病率和死亡率出现明显提高，目前恶性肿瘤已经超过心脑血管疾病，成为头号杀手。从肿瘤分类来看，脑瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等仍是最常见的恶性肿瘤，其中脑瘤也是目前最难对付的癌症，脑癌亦称恶性脑瘤，是生长于颅内的恶性肿瘤，是神经系统中常见的疾病之一，对人类神经系统的功能有很大的危害。
3.虽然随着医疗水平的提高，脑癌的现状较过去已有明显改善，但现阶段的手段对人体的伤害仍然很大。目前常用的肿瘤手段有手术、化疗和放疗等。其中，手术是早期癌症的首选方法，因为癌肿较小，通过手术将癌症组织进行全部或局部的切除，效果直接迅速，但手术或无法做到彻底清除癌细胞。对于中晚期脑癌的现状更不乐观，已经发生转移的癌症患者只能做局部切除。由于手术给机体带来的损伤，会使患者的免疫力降低，术后容易出现一系列并发症。
4.放疗是中晚期癌症常用方法之一，其对癌肿有较为直接的杀灭作用，主要是通过放射线使癌细胞核内的核糖核酸长链遭受致命性的破坏，最后致其死亡。因此，照射强度、照射范围、照射时间应根据全身情况慎重选择，对患者身体机能有一定的要求。但是放疗也不能杀死所有的癌细胞，并且会降低人体免疫力。化疗亦是中晚期脑癌的辅助方法，可与放疗合用，能在一定程度上延长生存期。
5.虽然手术、放疗以及化疗能一定程度上延长癌症患者的生存期，但对人体的毒副作用较大，降低了患者生存质量。而市场上癌症的可用药物极少，且毒性大，5年生存率极低(小于5％)，故急需要开发新药。

技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明目的在于提供肿瘤靶向药物及其应用。本发明提供的肿瘤靶向药物适用于多种肿瘤，在增加肿瘤杀伤作用的同时，还能降低毒副作用。
7.在第一方面，本发明的肿瘤靶向药物的具体技术方案如下：
8.一种肿瘤靶向药物，所述肿瘤靶向药物含epsin uim的多肽化合物，所述多肽化合物的氨基酸序列为seq id no:1。
9.进一步，所述肿瘤为多发性肿瘤。
10.进一步，所述肿瘤为脑癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、头颈部癌、喉癌、鼻咽癌、食道癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌。
11.进一步，所述脑癌为神经胶质瘤。
12.进一步，所述肿瘤靶向药物是通过静脉给药的。
13.在第二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含epsin uim的多肽化合物以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，所述epsin uim的多肽化合物的氨基酸序列为seq id no：1。
14.在第三方面，本发明提供一种试剂盒，包含本发明第一方面任一项所述的epsin uim的多肽化合物、或第二方面所述的药物组合物。
15.在第四方面，本发明提供一种肿瘤靶向药物在制备肿瘤药物中的应用，包括给需要的个体施用有效剂量的肿瘤靶向药物，所述肿瘤靶向药物含epsin uim的多肽化合物，所述多肽化合物的氨基酸序列为seq id no:1。
16.进一步，所述个体为人。
17.在第五方面，本发明提供一种肿瘤靶向药物，其因素是epsin，将epsin的shrna靶序列为seq id no:2克隆于表达载体上，所述表达载体为aav2、aav29或aavrh.10。
18.本发明的肿瘤靶向药物及其应用具有如下优点：肿瘤靶向药物含epsin uim的多肽化合物，其肽段小，可节约合成成本；适合于多种癌症，包括脑癌、前列腺癌，肺癌，乳腺癌等多种常见癌症；增加肿瘤杀伤作用提高疗效，降低毒副作用。
附图说明
19.图1显示人和老鼠epsins的同源性对比；
20.图2显示supi和upi在抑制脑瘤中的实验结果；
21.图3显示在老鼠前列腺癌模型tramp中，supi多肽化合物显著抑制前列腺癌肿瘤细胞生长的实验结果；
22.图4显示在人源化的老鼠pdx模型中，supi多肽显著抑制三阴乳腺癌细胞生长的实验结果；
23.图5显示在脑瘤动物模型中通过aav2载体特异性导入epsin1 shrna抑制脑瘤生长的实验结果；
24.图6显示包被epsin1/2的sirna纳米粒子注射抑制脑瘤生长的实验结果。
具体实施方式
25.为了更好地了解本发明，对本发明的肿瘤靶向药物及其应用做进一步详细的描述。
26.epsins是负责细胞信号淬灭的内吞分子，在各种疾病条件下起非常重要的作用。通过组织特异性敲除老鼠的epsins，发现在肿瘤疾病动物模型中，肿瘤显著的降低，成活率显著的提高。在许多癌症模型中，如脑神经胶质瘤，前列腺癌，乳腺癌，黑素瘤，肺癌等多发性癌症中得到验证。
27.实施例1
28.epsin uim的多肽化合物及其在脑瘤中的应用
29.在肿瘤血管或者上皮细胞中，epsin uim对于vegfr2血管再生和tnfr1信号通路起重要的作用.因此设计合成了含有uim的多肽化合物靶向肿瘤细胞，形成竞争性抑制剂干扰细胞信号通路，破坏蛋白质互作，可达到灭杀肿瘤之目的。
30.epsin uim含有一段特别保守序列：φ-x-x-a-x-x-x-s-x-x-ac，φ代表疏水氨基
酸，ac代表酸性氨基酸，x代表任何氨基酸。图1是老鼠和人的uim序列对比。人和老鼠epsin 1和epsin 2同源性都是100％。
31.1、实验目的和设计：
32.研究判断核心uim保守序列对癌症的作用uim核心保守序列为lqlalamskee，11个氨基酸，比现有技术中公开的序列sgeeelqlqlalamskee少7个氨基酸，构成短的upi peptide，命名为supi：lqlalamskee mgcikskrk crgdkgpdc，其中，lqlalamskee代表短的uim，mgcikskrk代表挂膜蛋白肽，crgdkgpdc代表irgd，即肿瘤靶向多肽。在体内处理完毕后的多肽实际上是：lqlalamskee mgcikskrk crgdk，即c-端最后的4个氨基酸(gpdc)被体内肽酶切除，最后成为含25个氨基酸的小肽进入细胞内。
33.2、实验方法：
34.1)细胞培养：gl261老鼠胶质瘤细胞于含5％co2的37℃培养箱中培养传代。培养基为含10％胎牛血清、100u
·
ml-1青霉素、100μg
·
ml-1链霉素和200μg
·
ml-1潮霉素的dmem；待细胞密度达到90％时,0.25％胰酶-edta消化传代。
35.2)脑瘤模型的建立：小鼠用50mg
·
kg-1钠腹腔注射麻醉后,将动物俯卧位固定于小鼠脑立体定位仪上。用酒精消毒小鼠头皮后,手术刀矢状切开小鼠头皮,3％h2o2清洁切口,暴露颅骨。延前囟后2mm,旁开右侧1.5mm,牙科钻打孔。26号微量注射器手动注射5μl细胞悬液(10，000个细胞),进针深度3mm,退针0.5mm,注射时间约30s。停针5min后,缓慢拔针,消毒缝合切口。腹腔注射5万单位青霉素抗感染。待手术后进行活体磁共振成像(mri)检测。监测脑瘤生长速度，一般9-12天小鼠脑瘤模型建立完毕。
36.3)给药方法：按照10mg/kg静脉给药，每周两次。
37.结果如图2所示，和对照相组比，给药组supi和upi均极显著抑制脑瘤生长。supi和upi没有显著差异，表面短肽supi可以和长肽一样，抑制脑肿瘤生长，且生物学特性不变。但经济上由于肽段变小，可以节约多肽合成成本。对患者来说，也可以减少开支。
38.实施例2
39.含epsin uim的多肽化合物supi及其在前列腺癌中的应用
40.在老鼠前列腺癌模型tramp中腹腔注射(ip)对照或supi多肽化合物发现，supi(20mg/kg，每周2次)。
41.结果如图3所示，在老鼠前列腺癌模型tramp中，supi多肽化合物显著抑制前列腺癌肿瘤细胞生长(n＝5，p《0.0001)。
42.实施例3
43.含epsin uim的多肽化合物supi及其在三阴乳腺癌中的应用
44.用人的三阴乳腺癌细胞建立人源化的老鼠pdx模型，老鼠用免疫缺陷性nod/scid品系。模型建立以后，腹腔注射(ip)对照或supi多肽化合物发现，supi(40mg/kg，每周2次)。
45.结果如图4所示，在人源化的老鼠pdx模型中，supi多肽显著抑制三阴乳腺癌细胞生长，症状得到显著改善(n＝5；p《0.001)。
46.实施例4
47.神经胶质瘤的基因药物及其应用
48.基因(gene therapy)是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或下调基因表达，从而达到肿瘤之目的。目前研究已从单基因遗传病逐步拓展到恶性
肿瘤、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病等重大疾病。根据统计，基因用于肿瘤的临床研究占临床试验总数的65％左右。相对于传统肿瘤，例如化疗、放疗、靶向药物等，肿瘤基因具有服用方便，时间减少，有机会更好提高患者的生活质量。基因最近10年中取得了长足进展，显著进展之一是各种组织或细胞的靶向载体开发。现有技术中av2/9和aavrh.10可有效跨越血脑屏障和靶向神经胶质瘤。
49.实验方法如下：
50.1)细胞培养：gl261老鼠胶质瘤细胞于含5％co2的37℃培养箱中培养传代。培养基为含10％胎牛血清、100u
·
ml-1青霉素、100μg
·
ml-1链霉素和200μg
·
ml-1潮霉素的dmem；待细胞密度达到90％时,0.25％胰酶-edta消化传代。
51.2)脑瘤模型的建立：小鼠用50mg
·
kg-1钠腹腔注射麻醉后,将动物俯卧位固定于小鼠脑立体定位仪上。用酒精消毒小鼠头皮后,手术刀矢状切开小鼠头皮,3％h2o2清洁切口,暴露颅骨。延前囟后2mm,旁开右侧1.5mm,牙科钻打孔。26号微量注射器手动注射5μl细胞悬液(10，000个细胞),进针深度3mm,退针0.5mm,注射时间约30s。停针5min后,缓慢拔针,消毒缝合切口。腹腔注射5万单位青霉素抗感染。待手术后进行活体磁共振成像(mri)检测。监测脑瘤生长速度，一般9-12天小鼠脑瘤模型建立完毕。
52.3)载体构建：选用aav2载体，将epsin 1的shrna克隆到aav2载体，由专业公司vector biolabs完成。shrna的靶序列为：aaggacttccagtatgtggac,该序列被成功克隆到aav2载体(u6启动子)，在细胞实验中得到验证epsin1的表达量显著降低。
53.4)给药方法：按2x10
11
vg/kg(大约每只脑瘤模型按照5x10
10
vg/次/50μl)给药，静脉注射，每周2次。aav2空载体或者aav2-gfp作为对照。
54.实验结果如图5所示，在脑瘤中下调epsin1能显著的抑制神经胶质瘤生长，统计分析达到极显著差异(n＝6，p《0.0001)。
55.实施例5：神经胶质瘤的纳米药物及其应用
56.实验方法如下：
57.1)epsin 1和epsin 2 sirna的设计与合成：
58.用于纳米封装的小鼠epsin 1和epsin2 sirna的序列是应用dharmacon(伊利诺伊州芝加哥)的网上应用程序设计的并由dharmacon生产制造。
59.小鼠epsin1序列(ctm-211157)是:
60.有义:5'g.a.a.c.u.g.g.a.g.g.c.a.c.g.u.c.u.a.c.a.a.u.u 3'和返义:5'u.u.g.u.a.g.a.c.g.u.g.c.c.u.c.c.a.g.u.u.c.u.u 3'。
61.小鼠epsin 2序列(ctm-211158)是:
62.有义:5'g.c.a.g.u.g.c.c.g.u.g.a.g.a.a.c.a.u.c.u.u.u.u 3'和反义:5'a.a.g.a.u.g.u.u.c.u.c.a.c.g.g.c.a.c.u.g.c.u.u 3'。
63.该公司将有义和反义sirna配制成sirna双链体(sirna duplex)。
64.2)纳米包被颗粒制造：表面靶向配体脂质-peg-siwv是通过dspe-peg琥珀酰亚胺酯(dspe-peg-nhs)和siwv肽之间的nhs/胺偶联反应合成的。相对于游离dspe-peg-nhs和siwv肽的保留时间，使用反相hplc的保留时间有了显着变化，证实了缀合的成功dspe-peg-siwv共轭物也将通过nmr(核磁共振)进一步验证。根据我们先前报道的方法，以10％的配体密度(dspe-peg-siwv/dspe-peg，w/w％)配制靶向的epsin1/2。dls(动态光散射)测量显示，
目标epsin1/2-np的大小(流体动力学直径)约为120nm.
65.3)动物实验：老鼠分为对照组和给药组，每组6只。每只老鼠按照15μg np/100μl(约0.6-0.75mg/kg)给药(静脉注射)，每周2次。对照用control sirna制造，剂量相同于给药组。
66.实验结果如图6所示，纳米颗粒注射可以显著的提高对脑瘤的抑制作用，在多数对照脑瘤老鼠死亡的情况下，给药组老鼠肿瘤极显著的缩小(n＝6，p《0.0001)。
67.本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本技术的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

技术特征：

1.一种肿瘤靶向药物，其特征在于：所述肿瘤靶向药物含epsin uim的多肽化合物，所述多肽化合物的氨基酸序列为seq id no:1。2.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向药物，其特征在于：所述肿瘤为多发性肿瘤。3.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向药物，其特征在于：所述肿瘤为脑癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、头颈部癌、喉癌、鼻咽癌、食道癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌。4.根据权利要求3所述的一种肿瘤靶向药物，其特征在于：所述脑癌为神经胶质瘤。5.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向药物，其特征在于：所述肿瘤靶向药物是通过静脉给药。6.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含epsin uim的多肽化合物以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，所述epsin uim的多肽化合物的氨基酸序列为seq id no：1。7.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-5中任一项所述的epsin uim的多肽化合物、或权利要求6所述的药物组合物。8.一种肿瘤靶向药物在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于：包括给需要的个体施用有效剂量的肿瘤靶向药物，所述肿瘤靶向药物含epsin uim的多肽化合物，所述多肽化合物的氨基酸序列为seq id no:1。9.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向药物，其特征在于：所述个体为人。10.一种肿瘤靶向药物，其特征在于：所述肿瘤靶向药物的因素是epsin，将epsin的shrna靶序列seq id no:2克隆于表达载体上，所述表达载体为aav2、aav29或aavrh.10。

技术总结

本发明涉及肿瘤靶向药物，所述肿瘤靶向药物含Epsin UIM的多肽化合物，本发明还提供了肿瘤靶向药物在制备肿瘤药物中的应用。本发明提供的肿瘤靶向药物适用于多种肿瘤，在增加肿瘤杀伤作用的同时，还能降低毒副作用。还能降低毒副作用。

技术研发人员：

董云洲

受保护的技术使用者：

神格（上海）生物医药科技有限公司

技术研发日：

2021.06.10

技术公布日：

2022/12/29