用于肿瘤免疫的多肽药物偶联物、载药系统、药物组合系统及应用

1.本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种用于协同增强肿瘤免疫的多肽药物偶联物、载药系统及应用。

背景技术：

2.目前临床上对肿瘤的不仅局限于直接杀伤肿瘤细胞，由于多种免疫逃逸途径的存在，肿瘤在后仍有极高的概率发生复发与转移，因此进一步加强肿瘤免疫是肿瘤的新兴手段。
3.现有的肿瘤免疫主要通过利用溶瘤病毒、上调机体免疫系统的应答、增强免疫原性死亡的诱导或者联用其他肿瘤杀伤性手段以增强机体免疫系统对残留肿瘤细胞的进一步清除。
4.溶瘤病毒是指通过基因工程改造后能够选择特定肿瘤进行增殖感染并杀伤肿瘤细胞的一种人工病毒。由于肿瘤的突变性，其细胞表面往往含有变异性的受体，人工基因编辑后的溶瘤病毒表面表达出特定的病毒表面蛋白能够选择性地与肿瘤细胞表面的受体实现受体-配体的特异性结合，实现其在肿瘤中特异性的增殖，并能够直接裂解肿瘤细胞从而引发肿瘤细胞凋亡或免疫原性死亡，诱导释放出肿瘤相关抗原、炎性细胞因子以及趋化因子等免疫原性物质引发机体的抗肿瘤免疫应答来实现对肿瘤的免疫。
5.吲哚胺2，3-双加氧酶ido是一种胞质酶，在哺乳动物的组织和细胞，特别是淋巴组织和胎盘组织中广泛表达，是肝脏以外唯一催化可氨酸分子中吲哚氧化裂解，该酶能够催化将l-氨酸(trp)转化为犬尿氨酸(kyn)，其中，犬尿氨酸具有抑制自然杀伤性细胞(nks) 和包含有树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞的抗原呈递细胞(apcs)的作用。同时犬尿氨酸还通过促进调节性t细胞(tregs)的增殖而抑制效应t细胞的增殖，诱导了t细胞的凋亡。在对ido酶进行抑制后，能够上调恢复被抑制的免疫系统，有望恢复部分受该通路介导的免疫抑制途径。
6.免疫原性死亡icd是指细胞在包括放射、光热、光动力或某些化疗药物的作用下死亡后释放出危险信号相关分子模式的过程，其典型特征为钙网蛋白(crt)暴露在细胞表面，高迁移率族蛋白b1(hmgb1)和atp的分泌；诱导免疫原性死亡不仅能够直接杀死肿瘤细胞，还能够刺激针对肿瘤的特异性免疫应答，一方面增强机体免疫系统应答增强效果，另一方面形成长效的免疫记忆预防肿瘤的复发与转移。
7.但是上述各种肿瘤免疫手段均存在一定的缺陷，具体体现在：
①
由于病毒的独特性，溶瘤病毒的免疫原性很高，但其所引发的免疫效应往往是更倾向于清除病毒的免疫途径，因此溶瘤病毒的免疫原性越强，其所诱导的抗病毒免疫效应也越强；且溶瘤病毒的穿透能力较弱，这对于深层肿瘤的浸润效果十分有限；
②
ido酶抑制剂则存在诸如：水溶性差、作用时间短、代谢快的问题，严重限制了其在临床的应用
③
仅依靠诱导免疫原性死亡释放的免疫原性物质还远远不够，由于多种免疫抑制机制的存在，免疫系统的
应答依然受到阻碍。
8.因此，如何开发出一种具有联合加强免疫激活，提高免疫效果的药物载体显得十分必要。

技术实现要素：

9.为解决上述肿瘤免疫手段存在的缺陷，本技术提供一种具有免疫原性死亡诱导和 ido抑制双重作用的多肽药物偶联物、载药系统及应用，利用ido酶抑制剂nlg919药物通过酯键与促凋亡多肽kla进行偶联形成多肽药物偶联物,一方面不仅能提高ido酶抑制剂的生物相容性，更主要的是利用促凋亡多肽kla在直接杀伤肿瘤诱导免疫原性死亡释放出免疫原性信号分子诱导免疫应答后，还能通过nlg919药物阻断ido酶通路介导下的免疫抑制，实现协同免疫增强的作用。
10.按照本发明的第一方面，提供了一种用于协同增强肿瘤免疫的多肽药物偶联物，所述多肽药物偶联物的结构简式为：p-l-d，其中，p为多肽、d为药物，l为可断裂的化学连接键，所述多肽为促凋亡多肽，所述药物为吲哚胺2，3-双加氧酶ido抑制剂。
11.本发明中的协同增强肿瘤免疫主要体现为具有免疫原性死亡诱导和ido抑制的双重协同作用，其中，多肽药物偶联物中的促凋亡多肽不仅能够造成线粒体的肿胀与透化，引起细胞素c等凋亡蛋白的释放，从而诱导肿瘤细胞凋亡，更重要的是具备潜在的免疫原性死亡诱导能力，且通过对促凋亡肽进行侧链订合，不仅能够提高多肽的稳定性和渗透性，还能显著增强免疫原性死亡的诱导能力，而ido酶抑制剂可以上调恢复被抑制的免疫系统，实现在细胞层面逆转ido酶介导的免疫代谢通路，实现双重联合加强免疫激活，提高免疫效果。此外，使用可断裂的化学键将ido抑制剂连接在促凋亡多肽链上，一方面可以显著改善ido抑制剂生物相容性差、渗透性差的不足，另一方面通过酶切作用释放的机制有利于实现ido抑制剂的缓慢释放，延长其作用时间，实现长效的抑制效果，采用化学键偶联而非包载的方式不仅可以提高负载率，同时具有准确的分子量，便于更好的控制药物的用量。
12.在另一优选例中，所述促凋亡多肽为kla，序列为klaklakklaklak；阳离子两亲性溶瘤肽ltx-315，序列为kkwwkkw-dip-k；氟化修饰的线粒体破坏多肽mdhps，结构为ano-3/3s溶瘤多肽，结构为
13.所述ido酶抑制剂可选自中的任意一种。
14.在另一优选例中，可断裂的化学连接键选自
胞处于失活状态，最终诱导免疫逃逸。pd-l1抗体可阻断pd-1和pd-l1的结合，上调t细胞的生长和增殖，增强t细胞对肿瘤细胞的识别，激活其攻击和杀伤功能，通过调动人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用，即pd-l1和nlg919都可作用于t细胞，通过两者联用可增强免疫反应，提高疗效。
28.按照本发明的另一方面，提供了一种多肽药物偶联物在制备用于肿瘤免疫药物中的应用。
29.所述药物可赋予的剂型包括但不限于可注射剂型、片剂和粉剂。
30.本发明提供的多肽药物偶联物，利用促凋亡多肽kla与ido酶抑制剂nlg919通过酯键与肽链偶联构建得到的多肽药物偶联物，一方面可以显著改善nlg919生物相容性差、渗透性差的不足，另一方面在肿瘤细胞内的各种裂解酶的作用下，能够实现kla多肽裂解肿瘤细胞、诱导免疫原性死亡，同时结合ido酶抑制剂nlg919的共同释放在细胞层面逆转ido 酶介导的免疫代谢通路，具有协同增效的肿瘤免疫效果，且通过对促凋亡肽kla进行疏水性侧链订合，能够提高多肽的稳定性和渗透性，增强免疫原性死亡的诱导能力，其获得的订合多肽药物偶联物具有最强的肿瘤免疫协同增效效果。
31.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：
33.图1为多肽nlg919偶联物kla-nlg的合成路线图。
34.图2为订书肽nlg919偶联物skla-nlg的合成路线图。
35.图3为多肽kla与订书肽skla的圆二光谱表征图。
36.图4为skla-nlg偶联物制备的纳米颗粒的dls与tem检测结果图。
37.图5为不同处理组与4t1细胞孵育后的线粒体形态的tem检测结果图。
38.图6为不同处理组与4t1细胞孵育后细胞中的crt与hmgb1免疫荧光检测图。
39.图7为不同处理组与4t1细胞孵育后细胞中的crt、hmgb1和atp含量的流式检测统计图。
40.图8为不同处理组与4t1细胞孵育后的细胞上清液中犬尿氨酸的含量检测图。
41.图9为不同处理组小鼠后21天后的双侧肿瘤大小图，标尺为2cm。
42.图10为不同处理组后的小鼠肿瘤组织切片的crt染显微图
43.图11为不同处理组后的小鼠肿瘤组织切片的hmgb1染显微图。
具体实施方式
44.下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例
所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
45.实施例1
46.本实施例主要提供具有免疫原性死亡诱导和ido抑制双重作用的线性多肽nlg919偶联物kla-nlg以及订书肽nlg919偶联物skla-nlg的具体结构和制备方法。
47.具体制备过程如下：
48.1、nlg919中间体nlg-sa合成方法
49.称取nlg919与丁二酸酐和dmap溶解在二氯甲烷溶剂中搅拌反应24小时。反应结束后使用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，之后将产物溶解于5％的碳酸氢钠溶液中，然后使用乙酸乙酯萃取3次以除去未反应完的丁二酸酐后收集碳酸氢钠水溶液。接着使用1mol/l浓度的盐酸溶液将水溶液ph值调制2-3，最后使用二氯甲烷溶液将中间体nlg-sa萃取收集后再使用旋转蒸发仪除去溶剂，获得粗产物，粗产物使用高效液相谱仪进行纯化，流动相设定为40 分钟内从10％acn至90％，检测波长设定为276nm，纯化后的产物溶解于dmso-d6中并使用核磁共振氢谱进行检测，同时还使用lc-ms对产物的分子量进行了进一步的确认。
50.2、线性多肽kla的合成
51.首先进行线性kla多肽的合成，其序列为klaklakklaklak。合成方法采用多肽固相合成技术(spps)，首先称取rink amide-mbha树脂400mg，加入dmf溶胀30min后，加入脱保护溶液(啉：dmf＝6:4,v/v)反应30min，重复反应2次。脱保护反应结束后依次使用dcm和dmf洗涤3次树脂，以除去残留的脱保护溶液。洗涤过后，称取带fmoc 基团保护的氨基酸与hatu充分溶解在dmf溶剂中后，加入调碱试剂dipea混匀，接着加入到树脂中反应2小时，重复反应2次。待反应结束后，再依次使用dcm和dmf洗涤3次树脂以除去残留的未反应液体。依次重复上述过程直至目标序列合成完毕。干燥后的树脂加入切割液(三氟乙酸：去离子水：tis＝95.0％:2.5％:2.5％,v/v/v)反应1.5小时将目标产物从树脂上切割下来，使用氮气流将切割液体吹干后加入冰乙醚沉淀目标产物，离心除去乙醚收集沉淀，如此重复三次，最后将产物溶解在去离子水中过滤以除去树脂。
52.3、订书肽skla的合成
53.该多肽的序列为cyclo-kl[cklakklc]klak，多肽合成方法参照步骤2，在完成多肽链段的合成后将侧链脱保护液(二氯甲烷：三氟乙酸：tis＝92.0％:1.5％:6.5％,v/v/v)加入到树脂中以脱去半胱氨酸侧链保护基团trt，待侧链脱保护液体颜的黄转变为透明时停止反应，使用dcm和dmf洗涤3次树脂以除去残留的侧链脱保护液。称取4,4
’‑
双(溴甲基) 联苯溶解在dmf中，加入dipea混匀后反应5小时。反应结束后脱去fmoc保护基，并使用切割液将订书肽从树脂上切割收集。
[0054]
4、线性多肽nlg919偶联物kla-nlg的合成
[0055]
该线性多肽偶联物的序列为nlg919-ahx-klaklakklaklak。在完成多肽部分的合成后，间隔基团与中间体nlg-sa按照多肽合成的方法依次连接至多肽链段上，具体合成路线如图1所示。
[0056]
5、订书肽nlg919偶联物skla-nlg的合成
[0057]
订书肽偶联物的序列为nlg919-ahx-cyclo-kl[cklakklc]klak。在完成多肽链段合成以及参照步骤4中的方法依次将间隔基团与中间体nlg-sa分子接枝到多肽链段后，再
利用侧链脱保护液对半胱氨酸保护基进行脱除，并用步骤3中的方法对多肽偶联物进行订合，具体合成路线如图2所示。
[0058]
分别使用核磁共振氢谱、质谱和高效液相谱仪对多肽以及多肽药物偶联物进行结构和纯度表征以验证其结构和纯度符合预期。
[0059]
实施例2
[0060]
本实施例主要提供圆二光谱检测多肽构象，环化可以有效约束多肽构象，而多肽构象被认为对其穿透能力有重要影响，多肽可以形成α-螺旋和β-折叠等多种二级结构，将线性多肽kla与订合多肽skla以1
×
10-5
m的浓度溶解在去离子水中，并在室温下进行检测。将圆二光谱仪检测步长分辨率设置为0.5nm，累计次数记为10，响应时间设置为1s，带宽设置为1nm，路径长度设置为10mm，记录数据并以平均残基摩尔椭圆度表示。
[0061]
获得的圆二谱图如图3所示，分析可知线性多肽kla在195nm处显示出负峰，表明其规则构象；而订合多肽skla在208nm与222nm处检测到α-螺旋构象具备的特征负峰，表明通过订合的方式成功约束多肽形成了α-螺旋的二级结构。
[0062]
实施例3
[0063]
本实施例主要提供由线性多肽nlg919偶联物kla-nlg和订书肽nlg919偶联物 skla-nlg制备得到的纳米颗粒(分别表示为kla-nlg nps和skla-nlg nps)的形貌和粒径表征。
[0064]
具体制备过程为：分别将适量kla-nlg与skla-nlg偶联物溶解在四氢呋喃溶剂中，接着缓慢滴加到去离子水中，搅拌，待四氢呋喃完全挥发后即可得到纳米颗粒。
[0065]
使用动态光散射粒度仪dls检测两种纳米颗粒的水合粒径，并使用透射电子显微镜tem 观察两种颗粒的形貌，其中，skla-nlg偶联物制备得到的纳米颗粒的dls与tem检测结果如图4所示，订合多肽偶联物skla-nlg nps的水合粒径在145.4
±
1.9nm，pdi为0.294
ꢀ±
0.036，此外，线性多肽偶联物kla-nlg nps的水合粒径在189.8
±
4.8nm，pdi为 0.189
±
0.031，两种颗粒均为均匀球形结构，尺寸为纳米级。
[0066]
实施例4
[0067]
本实施例主要提供促凋亡多肽的线粒体靶向性和破坏性研究。
[0068]
将4t1细胞接种在孔板中孵育24小时后弃去培养基，分别加入15μm线性促凋亡多肽kla、订合多肽skla、kla-nlg nps和skla-nlg nps四组不同的促凋亡多肽处理组，并以pbs作为对照组，与细胞再次孵育24小时后消化并离心获取细胞，接着加入0.5％戊二醛固定液对细胞进行重悬后于4℃静置10分钟，再次离心收集细胞并加入3％戊二醛固定液过夜。随后用pbs洗涤后使用4％染30分钟，然后依次使用30％、50％、70％、90％乙醇进行梯度脱水后再用100％乙醇冲洗3次。之后将细胞包埋在环氧树脂中并切成厚度在50-70nm的薄片，使用5％醋酸铀和2％柠檬酸铅对其染15分钟后，使用透射电子显微镜进行观察，获得的tem电镜图如附图5所示。
[0069]
结合附图5的形貌观察可知，对照组细胞内的线粒体形貌正常，具体表现为具有清晰的线粒体嵴结构同时线粒体内部未观察到空腔结构；然而在不同促凋亡多肽处理孵育组的细胞中均观察到了不同程度的线粒体结构损伤，其中订合多肽skla对线粒体结构的损伤明显强于线性多肽kla，而形成颗粒后损伤进一步加强，证明了kla多肽能够对线粒体的结构进行有力的破坏，而订合与自组装修饰手段均能增强破坏性，达到更严重的线粒体
细胞经过滤后使用流式细胞仪进行检测钙网蛋白(crt)含量。
[0081]
接种细胞并与各组材料共孵育24小时后，取20μl培养上清液并加入100μl配置好的atp检测工作液,间隔2秒后置于酶标仪中用化学发光模式(luminometer)进行测定并计算atp的含量。
[0082]
接种细胞并与各组材料共孵育24小时后按照试剂盒厂商提供的操作指南对细胞培养上清液进行检测高迁移率族蛋白b1的含量。
[0083]
获得的检测结果如图7所示。
[0084]
结合图6对crt进行免疫荧光成像分析可知，在细胞发生免疫原性死亡后，crt会转移到细胞膜表面诱导dc细胞对其进行捕获，crt用绿荧光标记，细胞核使用蓝荧光标记，可以观察到所有组细胞表面均检测到绿荧光信号，表明crt已转移至细胞膜表面，且通过流式细胞术对孵育后细胞表面绿荧光强度进行定量对比可知，将线性多肽kla订合修饰后的skla多肽诱导的相对荧光强度提高了3.1倍，skla-nlg nps由于更强的细胞毒性，在孵育后检测到细胞表面的crt信号强度是kla线性多肽的2.2倍。对hmgb1 进行免疫荧光检测分析可知，不同于crt荧光信号，由于hmgb1蛋白通常表达在细胞核内，可以从图6观察到对照组pbs孵育下的细胞核区域有绿荧光信号，而细胞发生免疫原性死亡时，其hmgb1蛋白会从细胞核内泄露至细胞外，从而导致荧光信号的缺失；从图 6中可以看出组细胞核心的绿荧光信号都有所衰减，这表明在这些材料共孵育后，细胞核内的hmgb1已经泄露出细胞。
[0085]
结合图7的定量检测结果，可以发现hmgb1的检测量与免疫荧光信号图中丢失信号的情况相对应，订合多肽skla以及订合多肽偶联物skla-nlg nps组检测到的含量分别为 681.9pg/ml及854.8pg/ml，显著高于线性kla多肽组(137.1pg/ml)，同时可以发现线性肽kla通过药物偶联自组装成纳米颗粒kla-nlg nps后，其检测量也有3.3倍的提高。最后使用增强型atp检测试剂盒对材料共孵育后的细胞上清液中atp含量进行检测后的结果可以看到atp的诱导释放情况与crt与hmgb1检测结果一致，最优组 kla-nlg nps诱导的atp含量达到了0.086nm。
[0086]
通过上述定性和定量表征可以有效证明kla多肽具备诱导免疫原性死亡的能力，并发现对kla多肽进行订合及药物偶联修饰后，skla-nlg nps具备最强效的免疫原性死亡诱导能力。
[0087]
实施例6
[0088]
本实施例考察多肽药物偶联物制备得到的纳米颗粒在体外阻断ido酶活性，实现细胞层面逆转ido酶介导的免疫代谢通路的能力。
[0089]
具体过程如下：将含有氨酸的细胞培养基中加入ifn-γ以刺激4t1细胞的ido酶表达，并通过对ido酶催化产物犬尿氨酸进行hplc追踪定量来对比不同组对ido酶抑制的效果。犬尿氨酸的检测结果如图8所示，nlg919裸药组的平均抑制率在75.8％，在所有材料组中抑制率最高，skla-nlg nps组的平均抑制率为65.9％，同时也高于kla-nlgnps组(41.5％)，仅次于裸药组。由此可见，多肽订合修饰后改善了细胞的摄取使得 skla-nlg nps药物释放更加充分获得更强的ido酶抑制效果。由于未偶联ido酶抑制剂， kla多肽与skla多肽未显示出ido酶抑制作用。
[0090]
实施例7
[0091]
免疫检查点抑制剂单一疗法在一些患者中不敏感或无法达到长期抗肿瘤效果。主要原因是肿瘤微环境的免疫原性差，即所谓的“冷肿瘤”，原因是1)抗原向t细胞呈递缺陷，2)缺乏t细胞活化，3)肿瘤组织中缺乏或、活化的t细胞浸润较少，4)存在免疫抑制细胞，例如调节性t细胞(tregs)和髓源性抑制细胞(mdscs)。因此，为了克服免疫检查点抑制剂单一疗法的局限性，将pd-l1抗体与材料进行联用。
[0092]
本实施例主要考察多肽药物偶联物制备得到的纳米颗粒在体内诱导免疫原性死亡以及其对肿瘤微环境中ido酶免疫代谢途径的抑制的能力，并综合评估其抗肿瘤免疫效果。
[0093]
体内肿瘤模型的建立为：
[0094]
将4t1细胞重悬在不含有血清的dmem培养基中，在实验小鼠左侧乳腺脂肪垫处注射100μl 4t1细胞悬浮液建立主要侧肿瘤，6天后，在实验小鼠右侧乳腺脂肪垫注射100μl 4t1细胞的混悬液建立远端肿瘤，由此建立双侧乳腺癌模型。
[0095]
具体的方案为：
[0096]
待模型建立后，将实验小鼠随机分成6组，从第七天起开始进行，分为(1) pbs缓冲液、(2)线性多肽kla、(3)订合多肽skla、(4)纳米颗粒kla-nlg nps、 (5)纳米颗粒skla-nlg nps和(6)纳米颗粒skla-nlg nps与pd-l1抗体联合组，给药方法为主要侧瘤内注射，给药剂量以最优组15mg/kg计算，单次给要药体积100μl。共在开始时的第1、3、5天给药3次，联合组在注射药物后的第二天注射剂量为 200μg的pd-l1抗体，共给药3次。
[0097]
在其余可选的实施例中，各处理组也可以制成片剂或者粉末状药物便于贮存，给药时经溶液复溶注射。
[0098]
获取给药21天后的肿瘤离体照片如图9所示，可以观察到skla-nlg nps与 pd-l1抗体联合组的实验小鼠主要侧与远端肿瘤体积均最小，主要侧肿瘤抑制率达 88.0％，远端肿瘤抑制率达97.3％，展现出最佳的效果以及远端肿瘤抑制效果，同时该组有两只小鼠的远端肿瘤位肿瘤已消融。同时，订合多肽skla的效果也强于线性多肽kla，联合ido酶抑制也能进一步抑制肿瘤的生长。
[0099]
此外，根据离体肿瘤的重量计算抑瘤率，经统计，在主要测，线性多肽kla的抑瘤率仅为23.3％，对肿瘤无法产生有效的抑制效果，而通过订合手段则增强了多肽的稳定性与细胞摄取后其效果显著提高至52.3％。而kla与ido酶阻断相结合后，线性组和订合组进一步提高了2.4倍和1.5倍，在与pd-l1抗体联用后抑瘤率进一步提高至88.0％，显示出恢复ido酶介导的免疫抑制后，免疫系统对肿瘤的进一步消融，同时ido酶抑制与 pd-l1阻断的协同作用。
[0100]
在第三次给药的次日，处死小鼠，取出肿瘤组织，并制备成肿瘤组织切片，分别对肿瘤区域表达的crt和hmgb1进行免疫荧光染考察。如图10-11所示，其中，线性多肽kla 处理组即具备诱导免疫原性死亡的能力，并发现对线性多肽kla进行订合及药物偶联修饰后，均能提高免疫原性死亡诱导能力，且以skla-nlg nps的免疫原性死亡诱导能力最强， crt和hmgb1的阳性率在不同组的趋势与体外免疫原性死亡诱导一致，均能有效实现体内有效的免疫原性死亡诱导能力。
[0101]
在第三次给药后的次日随机从各实验组选取三只实验小鼠，处死并取得肿瘤组
织，利用流式细胞术对肿瘤组织浸润的免疫相关细胞进行检测分析以考察免疫效能，如图11所示。
[0102]
成熟的dc细胞能够促进免疫应答，因此对成熟的dc细胞进行检测，结果显示，线性多肽给药组实验小鼠成熟dc细胞比例平均为10.2％，得益于更强的免疫原性死亡诱导能力释放出更多危险信号相关分子与肿瘤相关抗原，订合多肽skla给药实验小鼠浸润成熟dc 细胞数目提高至15.3％；多肽偶联物组kla-nlg nps与skla-nlg nps平均比例在 12.7％和26.5％，相较多肽有所提高，而skla-nlg nps与apd-l1联合组dc细胞成熟比例最高，达到了37.6％。
[0103]
由于treg细胞会下调免疫应答，导致肿瘤细胞逃逸，故对肿瘤区域浸润的treg细胞进行了检测，nlg919药物能够抑制ido酶，实现对其免疫代谢通路介导的免疫抑制的逆转，因此多肽偶联nlg919纳米颗粒组kla-nlg nps与skla-nlg nps给药组相比于多肽组kla与skla，treg细胞比例分别显著下调32.0％和32.1％。
[0104]
cd8
+
t细胞是免疫应答中直接杀伤肿瘤的免疫细胞，订合组多肽skla组浸润的cd8
+ t细胞高于线性多肽组，在阻断了ido酶介导的免疫抑制后，skla-nlg nps给药组肿瘤区域检测到32.4％的cd8
+
t细胞，在与apd-l1联合后，实验小鼠肿瘤区域浸润的效应t细胞达到最高，分别检测到平均44.8％的cd8
+
t细胞，表明ido酶抑制与pd-1/pd-l1 通路阻断具有协同效应。
[0105]
本发明通过将促凋亡多肽kla与ido酶抑制剂通过酯键与肽链偶联构建得到多肽药物偶联物，一方面能够实现kla 多肽裂解肿瘤细胞、诱导免疫原性死亡，同时结合ido酶抑制剂实现细胞层面逆转ido酶介导的免疫代谢通路以解除免疫微环境的抑制，具有协同增效的肿瘤免疫效果。
[0106]
本领域内的技术人员应明白，在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
[0107]
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0108]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.一种用于协同增强肿瘤免疫的多肽药物偶联物，其特征在于，所述多肽药物偶联物的结构简式为：p-l-d，其中，p为多肽、d为药物，l为可断裂的化学连接键，所述多肽为促凋亡多肽，所述药物为吲哚胺2，3-双加氧酶ido抑制剂。2.如权利要求1所述的一种用于协同增强肿瘤免疫的多肽药物偶联物，其特征在于，所述可断裂的化学连接键选自中的任一种。3.如权利要求1所述的一种用于协同增强肿瘤免疫的多肽药物偶联物，其特征在于，所述促凋亡多肽为具有侧链环化结构的订书肽。4.如权利要求1所述的一种用于协同增强肿瘤免疫的多肽药物偶联物，其特征在于，所述多肽和药物之间还连接有间隔分子，所述间隔分子选自6-ahx、β-ala中的任一种。5.如权利要求1所述的一种用于协同增强肿瘤免疫的多肽药物偶联物，其特征在于，所述多肽药物偶联物的结构如式1所示：6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽药物偶联物制备得到载药系统，其特征在于，所述载药系统包括将多肽药物偶联物通过自组装形成溶瘤病毒样纳米颗粒。7.根据权利要求6所述的载药系统，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为150nm-180nm。8.一种用于肿瘤免疫的药物组合系统，其特征在于，包含权利要求6-7中任一项所述的载药系统和pd-l1抗体。9.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽药物偶联物在制备用于肿瘤免疫药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述药物为可注射剂型、片剂或粉剂。

技术总结

本发明公开了一种协同增强肿瘤免疫的多肽药物偶联物、载药系统、药物组合系统及应用，所述多肽药物偶联物结构简式为：P-L-D，其中，P为多肽、D为药物，L为可断裂的化学连接键，所述多肽为促凋亡多肽，所述药物为吲哚胺2，3-双加氧酶IDO抑制剂。所述多肽药物偶联物通过简单自组装制备成纳米颗粒，可用于体内和体外多重肿瘤免疫，一方面能够实现促凋亡多肽裂解肿瘤细胞、诱导免疫原性死亡，同时结合的IDO酶抑制剂实现细胞层面逆转IDO酶介导的免疫代谢通路以解除免疫微环境的抑制，具有协同增效的肿瘤免疫效果，具有良好的药物递送领域应用前景。递送领域应用前景。递送领域应用前景。