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用于优化的药物缀合的经修饰的结合多肽的制作方法

用于优化的药物缀合的经修饰的结合多肽
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2020年2月28日提交的美国临时申请序列号62/982,943的权益，将其全部公开内容通过引用特此并入本文。
技术领域
2.本公开文本涉及制备用于配体缀合的双工程化抗原结合蛋白的组合物和方法。

背景技术：

3.使用特异性抗原结合蛋白或抗体来人和其他动物是一种强大的工具，其在许多病症和障碍方面非常有效。然而，对更有效的靶向疗法，特别是功效更高且窗口更大的靶特异性疗法存在巨大需求。这些靶特异性中的一种采用抗体-配体缀合物，其中将特异性抗体引导至所需的位点以递送靶向所述位点的配体。此配体可以是药物，如生物活性细胞毒性有效载荷。使用抗体-配体缀合分子的优点是，它们可以被设计成区分健康组织和患病组织。实际上，在临床环境中，与未靶向抗体相比，此类分子已显示出改善的指数，即更高的功效和/或更低的毒性特征。然而，此类疗法的发展可能是具有挑战性的，因为包括抗体本身和连接稳定性在内的许多因素可能对疾病靶标(例如，肿瘤)特异性具有显著影响，从而降低功效。展示出高非特异性结合和低循环稳定性的抗体-配体缀合物在通过正常组织的过程中，甚至在它们到达靶位点之前被清除。此外，具有高药物载荷的显著亚的抗体-配体缀合物可以产生被巨噬细胞消除的聚集体，从而导致较短的半衰期。因此，对关键过程控制和抗体-配体缀合物的改进以及防止并发症(如产物聚集和非特异性毒性)的需求日益增加。
4.一些特定于某些适应症的抗体-配体缀合物已在美国获得批准。例如：本妥西单抗瑞他汀(brentuximab vedotin)用于复发性或难治性霍奇金淋巴瘤和全身性间变性大细胞淋巴瘤(alcl)；曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)用于her2+乳腺癌；奥英妥珠单抗奥加米星(inotuzumab ozogamicin)用于急性淋巴细胞白血病(all)；以及吉妥珠单抗奥加米星(gemtuzumab ozogamicin)用于复发性急性髓性白血病(aml)。然而，仍需要稳定的、可以携带高有效载荷(即高的配体/药物与抗体比)并可以用于多种适应症的抗体-配体缀合物。
5.本文中，我们公开了工程化抗体，其是稳定的并且可以以高于3的配体/药物与抗体比与配体或药物缀合，从而使得这些缀合物适用于多种适应症。

技术实现要素：

6.本公开文本提供了一种抗原结合蛋白或其片段。
7.在一方面，本公开文本提供了一种抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是
位置274，并且所述第二位置选自：339、360、384、385、422、440及其任何组合。
8.在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置是339。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置是360。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置是384。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置是385。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置是422。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置是440。
9.在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的k274c氨基酸取代和所述第二位置处的a339c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的k274c氨基酸取代和所述第二位置处的k360c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的k274c氨基酸取代和所述第二位置处的n384c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的k274c氨基酸取代和所述第二位置处的g385c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的k274c氨基酸取代和所述第二位置处的v422c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的k274c氨基酸取代和所述第二位置处的s440c氨基酸取代。
10.在另一方面，本公开文本提供了一种抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置选自：290、360、384、385、422、440及其任何组合。
11.在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置是290。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置是360。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置是384。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置是385。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置是422。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置是440。
12.在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a339c氨基酸取代和所述第二位置处的k360c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a339c氨基酸取代和所述第二位置处的n384c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a339c氨基酸取代和所述第二位置处的g385c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a339c氨基酸取代和所述第二位置处的v422c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a339c氨基酸取代和所述第二位置处的s440c氨基酸取代。
13.在另一方面，本公开文本提供了一种抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置选自：274、339、384、385、422、440及其任何组合。
14.在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置是274。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置是339。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置是384。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置是385。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置是422。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置是440。
15.在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a118c氨基酸取代和所述第二位置处的k274c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a118c氨基酸取代和所述第二位置处的a339c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a118c氨基酸取代和所述第二位置处的n384c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a118c氨基酸取代和所述第二位置处的g385c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a118c氨基酸取代和所述第二位置处的v422c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的a118c氨基酸取代和所述第二位置处的s440c氨基酸取代。
16.在另一方面，本公开文本提供了一种抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置384，并且所述第二位置选自：118、274、290、339及其任何组合。
17.在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置384，并且所述第二位置是118。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置384，并且所述第二位置是274。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置384，并且所述第二位置是290。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置是118。
18.在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的n384c氨基酸取代和所述第二位置处的a118c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的n384c氨基酸取代和所述第二位置处的k274c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的n384c氨基酸取代和所述第二位置处的k290c氨基酸取代。在某些实施方案中，根据kabat的eu索引的编号，所述抗原结合蛋白或其片段包含所述第一位置处的n384c氨基酸取代和所述第二位置处的a339c氨基酸取代。
19.在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基选自半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。
20.在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基经由反应性部分与配体缀合。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其片段还包含将所述工程化反应性氨基酸残基与所述配体缀合的接头。在某些实施方案中，所述接头是可切割的。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。
21.在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其片段包含至少3.0的配体与抗体比(lar)。在某些实施方案中，所述lar是至少3.4。
22.在某些实施方案中，所述配体是检测探针。在某些实施方案中，所述检测探针选自：生物素、聚乙二醇(peg)、荧光标签、可视化肽及其组合。在某些实施方案中，所述检测探针是peg。
23.在某些实施方案中，所述配体是靶向部分。在某些实施方案中，所述靶向部分选自：蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物及其组合。
24.在某些实施方案中，所述配体是药物。
25.在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白或片段包含至少3.0的药物与抗体比(dar)。在某些实施方案中，所述dar是至少3.4。
26.在某些实施方案中，所述药物是选自以下的前药：含磷酸盐的前药、含氨基酸的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药、含苯氧乙酰胺的前药、含苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶前药、5-氟尿苷前药及其任何组合。
27.在某些实施方案中，所述药物选自：抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂、麻醉剂、细胞毒性剂、放射性核素、免疫调节剂、细胞信号肽、生长因子、酶、寡核苷酸、光敏剂及其任何组合。
28.在某些实施方案中，所述抗癌剂选自：细胞抑制剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂、酶抑制剂、基因调节剂、蛋白酶体抑制剂、蝶啶、烯二炔(diynene)、鬼臼毒素、澳瑞他汀(auristatin)、格尔德霉素、加利刹霉素(calicheamicin)、短杆菌肽d、类美登素(maytansanoids)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、拓扑替康、紫杉烷类、细胞松弛素b、溴化乙锭、吐根碱、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登素衍生物、蒽环类衍生物、双膦酸盐衍生物、来普霉素衍生物、链黑菌素衍生物、澳瑞他汀衍生物、倍癌霉素(duocarmycin)衍生物及其任何组合。
29.在某些实施方案中，所述细胞抑制剂选自：菌素、dna合成抑制剂、dna嵌入剂、dna-rna转录调节剂、安沙霉素苯醌、醌类衍生物、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、亚丝醌、卡巴醌、吲哚醌e09、二氮杂环丙烷基苯醌甲基dzq、三亚乙基磷酰胺、亚化合物及其任何组合。
30.在某些实施方案中，所述细胞毒性核苷选自：腺苷阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤及其任何组合。
31.在某些实施方案中，所述微管蛋白结合剂选自：紫杉烷、诺考达唑、根霉素、海兔毒
素、秋水仙碱、类秋水仙素(colchicinoid)、康普瑞汀、长春花生物碱及其任何组合。
32.在某些实施方案中，所述激素和激素拮抗剂选自：皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、芳香化酶抑制剂、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、芹菜素、布雷菲德菌素a、西咪替丁、二氯亚甲基-二膦酸、亮脯利特、促黄体激素释放激素、皮斐松-a(pifithrin-a)、雷帕霉素、性激素结合球蛋白、毒胡萝卜素及其任何组合。
33.在某些实施方案中，所述抗血管生成剂选自：血管抑制素kl-3、dl-a-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素、(+)-沙利度胺及其任何组合。
34.在某些实施方案中，所述酶抑制剂选自：s(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯并-咪唑ι-β-d-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美司坦、福司曲星、牛奶树碱(hispidin)、2-亚氨基-l-咪唑烷乙酸、洛伐他汀、曲古抑菌素a、酪氨酸磷酸化抑制剂(typhostin)ag 34、酪氨酸磷酸化抑制剂ag879及其任何组合。
35.在某些实施方案中，所述基因调节剂选自：5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化醇、4-羟基他莫昔芬、褪黑素、米非司酮、雷洛昔芬、反式-视黄醛、视黄酸、维生素a酸、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇、他莫昔芬、曲格列酮及其任何组合。
36.在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其片段还包含抗体重链可变(vh)结构域。
37.在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白或其片段还包含抗体轻链可变(v
l
)结构域。
38.在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白是嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白是人抗体。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白是单克隆抗体。
39.在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含一个或多个含有fc区的全长抗体重链。在某些实施方案中，所述fc区是人igg1 fc区。
40.在另一方面，本公开文本提供了一种产生包含第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗原结合蛋白或其片段的方法，所述方法包括：(a)产生工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的第一文库，其中每个亲本抗原结合蛋白或其片段包含第一工程化反应性氨基酸残基；(b)通过将配体与所述第一文库中每个工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的所述第一工程化反应性氨基酸残基缀合，产生配体缀合的工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的第二文库；(c)通过针对高于1.7的配体与抗体比(lar)筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库，其中lar高于1.7的所述工程化亲本抗原结合蛋白或其片段具有工程化反应性氨基酸残基的位置构成工程化位置的所述第三文库；(d)产生抗原结合蛋白或其片段的第四文库，其中每个抗原结合蛋白或其片段包含在选自工程化位置的所述第三文库的第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和在选自工程化位置的所述第三文库的第二位置处的工程化反应性氨基酸残基；(e)通过将配体与所述第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和所述第二位置处的工程化反应性氨基酸残基缀合，产生配体缀合的双工程化抗原结合蛋白或其片段的第五文库；以及(f)通过针对高于3.4的lar筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第六文库。
41.在某些实施方案中，产生抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况
筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库：60％或更高为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合一个配体、20％或更低为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且20％或更低为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。
42.在某些实施方案中，产生抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第六文库：80％或更高为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合一个或两个配体、10％或更低为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且5％或更低为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。
43.在某些实施方案中，产生抗原结合蛋白或其片段的方法还包括将配体与构成所述第六文库的双工程化抗原结合蛋白或其片段的工程化反应性氨基酸残基缀合。
44.在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基选自半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基经由反应性部分与配体缀合。
45.在某些实施方案中，所述产生抗原结合蛋白或其片段的方法还包含将所述工程化反应性氨基酸残基与所述配体缀合的接头。在某些实施方案中，所述接头是可切割的。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。
46.在某些实施方案中，所述lar是至少3.0。在某些实施方案中，所述lar是至少3.4。
47.在某些实施方案中，所述配体是检测探针。在某些实施方案中，所述检测探针选自：生物素、聚乙二醇(peg)、荧光标签、可视化肽及其组合。在某些实施方案中，所述检测证明是peg。
48.在某些实施方案中，所述配体是靶向部分。在某些实施方案中，所述靶向部分选自：蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物及其组合。
49.在某些实施方案中，所述配体是药物。
50.在某些实施方案中，产生抗原结合蛋白或其片段的方法包含至少3.0的药物与抗体比(dar)。在某些实施方案中，所述dar是至少3.4。
51.在某些实施方案中，所述药物是选自以下的前药：含磷酸盐的前药、含氨基酸的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药、含苯氧乙酰胺的前药、含苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶前药、5-氟尿苷前药及其组合。
52.在某些实施方案中，所述药物选自：抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂、麻醉剂、细胞毒性剂、放射性核素、免疫调节剂、细胞信号肽、生长因子、酶、寡核苷酸、光敏剂及其组合。
53.在某些实施方案中，所述抗癌剂选自：细胞抑制剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂、酶抑制剂、基因调节剂、蛋白酶体抑制剂、蝶啶、烯二炔、鬼臼毒素、澳瑞他汀、格尔德霉素、加利刹霉素、短杆菌肽d、类美登素、新制癌菌素、拓扑替康、紫杉烷类、细胞松弛素b、溴化乙锭、吐根碱、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登素衍生物、蒽环类衍生物、双膦酸盐衍生物、来普霉素衍生物、链黑霉素衍生物、澳瑞他汀衍生物、倍癌霉素衍生物及其任何组合。
54.在某些实施方案中，所述细胞抑制剂选自：菌素、dna合成抑制剂、dna嵌入剂、dna-rna转录调节剂、安沙霉素苯醌、醌类衍生物、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、亚丝醌、卡巴醌、吲哚醌e09、二氮杂环丙烷基苯醌甲基dzq、三亚乙基磷酰胺、亚化合物及其任何组合。
55.在某些实施方案中，所述细胞毒性核苷选自：腺苷阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤及其任何组合。
56.在某些实施方案中，所述微管蛋白结合剂选自：紫杉烷、诺考达唑、根霉素、海兔毒素、秋水仙碱、类秋水仙素、康普瑞汀、长春花生物碱及其任何组合。
57.在某些实施方案中，所述激素和激素拮抗剂选自：皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、芳香化酶抑制剂、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、芹菜素、布雷菲德菌素a、西咪替丁、二氯亚甲基-二膦酸、亮脯利特、促黄体激素释放激素、皮斐松-a、雷帕霉素、性激素结合球蛋白、毒胡萝卜素及其任何组合。
58.在某些实施方案中，所述抗血管生成剂选自：血管抑制素kl-3、dl-a-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素、(+)-沙利度胺及其任何组合。
59.在某些实施方案中，所述酶抑制剂选自：s(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯并-咪唑ι-β-d-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美司坦、福司曲星、牛奶树碱(hispidin)、2-亚氨基-l-咪唑烷乙酸、洛伐他汀、曲古抑菌素a、酪氨酸磷酸化抑制剂(typhostin)ag 34、酪氨酸磷酸化抑制剂ag879及其任何组合。
60.在某些实施方案中，所述基因调节剂选自：5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化醇、4-羟基他莫昔芬、褪黑素、米非司酮、雷洛昔芬、反式-视黄醛、视黄酸、维生素a酸、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇、他莫昔芬、曲格列酮及其任何组合。
61.在某些实施方案中，产生抗原结合蛋白或其片段的方法还包含抗体重链可变(vh)结构域。在某些实施方案中，产生抗原结合蛋白或其片段的方法还包含抗体轻链可变(v
l
)结构域。
62.在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白是嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白是人抗体。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白是单克隆抗体。
63.在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含一个或多个含有fc区的全长抗体重链。在某些实施方案中，所述fc区是人igg1 fc区。
64.在另一方面，本公开文本提供了一种药物组合物，其包含本文所公开的任何抗原结合蛋白或其片段，还包含药学上可接受的载体。
65.在另一方面，本公开文本提供了一种受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所公开的任何抗原结合蛋白或其片段或本文所公开的药物组合物。
66.在另一方面，本公开文本提供了一种分离的核酸分子，其编码本文所公开的任何抗原结合蛋白或其片段。
67.在另一方面，本公开文本提供了一种表达载体，其包含本文所公开的核酸分子。
68.在另一方面，本公开文本提供了一种宿主细胞，其包含本文所公开的表达载体。
附图说明
69.从以下示例性实施方案的详细描述结合附图将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点。所述专利或申请文件含有至少一张彩附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一张或多张彩附图的本专利或专利申请公开物的副本。
70.图1描绘了sds-page上纯化的单工程化亲本抗体。将具有第一位置半胱氨酸突变的单工程化亲本抗体(突变体)以4μg蛋白/泳道装载到4％-12％非还原性tris-甘氨酸sds-page凝胶上。
71.图2描绘了单工程化亲本抗体的纳米dsf测量。进行纳米dsf(差示扫描荧光分析法)测量，以测量具有第一位置半胱氨酸突变的单工程化亲本抗体(突变体)的稳定性。测量两个熔点(tm1和tm2)，对应于抗体的两个球状区域的50％展开时的熔化温度。以粗体文本显示这样的工程化抗体，其tm1比未工程化抗体对照低≥5摄氏度。与对照的tm2相比，所有工程化抗体均具有可比性或稍微更稳定。
72.图3描绘了用dtt筛选单工程化亲本抗体。使用dtt还原剂通过用64eq dtt装载到peg染的sds-page上进行解盖来筛选具有第一位置半胱氨酸突变的单工程化亲本抗体(突变体)。使用还原和非还原条件筛选所描绘的每种工程化抗体。
73.图4描绘了使用热图对单工程化亲本抗体的比较。基于四个标准分析具有第一位置半胱氨酸突变的单工程化亲本抗体(突变体)：单聚乙二醇化％、多聚乙二醇化％、par(peg与抗体比)和未聚乙二醇化％，如通过考马斯染所测量。每个标准(列)的阴影处理如下：单聚乙二醇化：》60％至《100％-浅灰，》30％至《59.9％-无阴影；》5％至《29.9％-深灰；多聚乙二醇化：》0％至《15％-浅灰，》15.1％至《20％-无阴影，》20.1％至《100％-深灰；par：》1.7至《2.5-浅灰，》1至《1.69-无阴影，》0至《0.99-深灰；未聚乙二醇化：》0％至《15％-浅灰，》15.1％至《20％-无阴影，》20.1％至《100％-深灰。
74.图5描绘了所选的最佳单工程化亲本抗体。具有第一位置半胱氨酸突变的单工程化亲本抗体(突变体)的选择基于四个标准：≥60％单聚乙二醇化、≤20％多聚乙二醇化、par(peg与抗体比)≥1.7，和≤20％未聚乙二醇化，如通过考马斯染所测量。
75.图6描绘了所选的前十种单工程化亲本抗体。以粗体描绘了第一位置k274c、k290c、a339c、k360c，并且以斜体描绘了第一位置n384c、g385c、q418c、v422c、s440c、s442c。
76.图7描绘了sds-page上纯化的双工程化抗体。在还原和非还原条件下，将具有第一位置半胱氨酸突变和第二位置半胱氨酸突变的双工程化抗体(突变体)装载到sds-page凝胶上。
77.图8描绘了双工程化抗体的纳米dsf测量。进行纳米dsf(差示扫描荧光分析法)测量，以测量具有第一位置半胱氨酸突变和第二位置半胱氨酸突变的双工程化抗体(突变体)的稳定性。测量两个熔点(tm1和tm2)，对应于抗体的两个球状区域的50％展开时的熔化温度。指示了这样的工程化抗体，其tm1和tm2比未工程化抗体对照低》2摄氏度(粗体文本)或高《2摄氏度(带下划线，斜体文本)。
78.图9描绘了双工程化抗体的聚乙二醇化筛选。将具有第一位置半胱氨酸突变和第二位置半胱氨酸突变的双工程化抗体(突变体)与peg缀合，然后使用dtt还原剂通过用64eq dtt装载到peg染的sds-page上进行解盖来筛选。使用还原和非还原条件筛选显示的每种突变抗体，以确定其peg与抗体比(par)。
79.图10描绘了双工程化抗体之间的聚乙二醇化效率/选择性。具有第一位置半胱氨酸突变和第二位置半胱氨酸突变的双工程化抗体(突变体)按四个标准进行评估：par、单聚乙二醇化和二聚乙二醇化％、多聚乙二醇化％和未聚乙二醇化％，如通过考马斯染所测量。
80.图11描绘了所选的前19种双工程化抗体。具有第一位置半胱氨酸突变和第二位置半胱氨酸突变的双工程化抗体(突变体)的选择基于四个标准：≥80％单聚乙二醇化和二聚乙二醇化、≤10％多聚乙二醇化、par≥3.4和≤5％未聚乙二醇化，如通过考马斯染所测量。
81.图12描绘了选择的第一位置为k274c的最佳双工程化抗体。
82.图13描绘了选择的第一位置为a339c的最佳双工程化抗体。
83.图14描绘了选择的第一位置为a118c的最佳双工程化抗体。
84.图15描绘了用还原剂三(2-羧乙基)膦(tcep)筛选单工程化亲本抗体。使用tcep通过装载到peg染的sds-page上来筛选具有第一位置半胱氨酸突变的单工程化亲本抗体(突变体)。使用还原和非还原条件筛选所描绘的每种工程化抗体。
85.图16描绘了tcep处理和dtt处理的单工程化亲本抗体之间的比较。根据四个标准进行了比较：单聚乙二醇化、多聚乙二醇化、par(peg与抗体比)和非聚乙二醇化，如通过考马斯染所测量。
86.图17描绘了使用tcep处理的抗体的热图对单工程化亲本抗体的比较。基于四个标准分析具有第一位置半胱氨酸突变的单工程化亲本抗体(突变体)：单聚乙二醇化％、多聚乙二醇化％、par(peg与抗体比)和未聚乙二醇化％，如通过考马斯染所测量。每个标准(列)的阴影处理如下：单聚乙二醇化：》60％至《100％-浅灰，》30％至《59.9％-无阴影；》5％至《29.9％-深灰；多聚乙二醇化：》0％至《15％-浅灰，》15.1％至《20％-无阴影，》20.1％至《100％-深灰；par：》1.7至《2.5-浅灰，》1至《1.69-无阴影，》0至《0.99-深灰；未聚乙二醇化：》0％至《15％-浅灰，》15.1％至《20％-无阴影，》20.1％至《100％-深灰。
87.图18描绘了用于缀合和测试对fcγriiia结合的影响的三个单工程化亲本抗体位点。所测试的位点是k290、q295和s442。
88.图19描绘了证明fcγriiia与用于缀合的每个单工程化亲本抗体位点结合的动力学传感图。所测试的位点是k290、q295和s442。每个位点均与2kda马来酰亚胺peg或生物素缀合。
89.图20描绘了已经与peg缀合的单半胱氨酸工程化亲本抗体的sds-page和peg染。在还原条件下，使用4％-12％ bis-tris nupage分析被聚乙二醇化的27种单半胱氨酸工程化亲本抗体(每种13μg)。使用peg染对凝胶进行染。将也被聚乙二醇化的野生型抗体
(wt)用作对照。将pageruler预染的蛋白质阶梯用作蛋白质分子量标准(mw std)。
90.图21描绘了用抗peg抗体与小鼠血浆孵育的针对聚乙二醇化抗体样品(0.1μg)的蛋白质印迹。如箭头所示，使用alphaview软件分析单聚乙二醇化抗体带，以确定在血浆中孵育96小时后残留的peg量。单聚乙二醇化抗体带上方的扩散带是多聚乙二醇化种类，由于存在更多的peg，因此其对抗peg抗体反应强烈。
91.图22描绘了用针对聚乙二醇化单半胱氨酸突变体的抗peg抗体的蛋白质印迹的定量。将聚乙二醇化抗体与小鼠血浆孵育0和96小时，然后使用具有抗peg抗体的蛋白质印迹进行分析。0小时处的量百分比代表96小时处来自样品的单聚乙二醇化抗体带的带面积除以0小时处的带面积x100。
92.图23描绘了聚乙二醇化后两个单半胱氨酸突变体n297c和s298c的sds-page和peg染。将2个单半胱氨酸突变体n297c和s298c聚乙二醇化，并在非还原和还原条件下使用4％-12％ bis-tris nupage进行分析。使用peg染对凝胶进行染。在非还原条件下，在凝胶中检测到大量的半抗体缀合物。将pageruler预染的蛋白质阶梯用作蛋白质分子量标准(mw std)。
93.图24描绘了双工程化抗体的聚乙二醇化筛选。将具有第一位置半胱氨酸突变和第二位置半胱氨酸突变的双工程化抗体(突变体)与peg缀合，然后使用dtt还原剂通过用64eq dtt装载到peg染的sds-page上进行解盖来筛选。使用还原和非还原条件筛选显示的每种突变抗体，以确定其peg与抗体比(par)。所述突变体之一的a118c+a339c(以粗体、带下划线的文本突出显示)的表达较差，并且在聚乙二醇化后显示出扩散带。对其重新测序，并且发现序列不匹配。重新表达具有正确序列的原始突变克隆并按所示进行聚乙二醇化。
94.图25描绘了聚乙二醇化双半胱氨酸突变体的热图。不同的颜代表par、单聚乙二醇化和二聚乙二醇化、多聚乙二醇化和非聚乙二醇化种类的范围。par：》3.4绿《4；》2.5黄《3.3；》0红《2.4。单聚乙二醇化和二聚乙二醇化：》85％绿《100％；》30％黄《84.9％；》5％红《29.9％。多聚乙二醇化：《10％绿》0％；》10.1％黄《20％；》20.1％红《100％。未聚乙二醇化：《6％绿》0％；》6.1％黄《10％；》10.1％红《100％。选择性：》0.7绿《1.0，》051黄《0.69，》0红《0.5。
具体实施方式
95.我们公开了工程化抗体，其是稳定的并且可以以高于3的配体/药物与抗体比与配体或药物缀合，从而使得这些缀合物适用于多种适应症。还提供了产生这些工程化抗体的方法。
96.通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法是本领域中熟知并且一般使用的那些。除非另有指示，否则本文提供的方法和技术通常是根据本领域中熟知并且如本说明书通篇引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中所述的常规方法来进行。酶反应和纯化方法是根据制造商说明书来进行，如本领域中一般所完成的或如本文所述。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域中熟知并且一般使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的。
97.除非本文中另有定义，否则本文中所用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员一般理解的含义。在任何潜在歧义的事件中，本文所提供的定义优先于任何字典或非固有定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括”以及其他形式如“包括”(“includes”和“included”)的使用不是限制性的。
98.为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。
99.如本文所用，术语“抗原结合蛋白”或“抗体”是指与抗原或表位特异性结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆和单克隆抗体两者以及功能性抗体片段，包括但不限于片段抗原结合(fab)片段、f(ab')2片段、fab'片段、fv片段、重组igg(rigg)片段、单链可变片段(scfv)和单结构域抗体(例如，sdab、sdfv、纳米体)片段。所述术语“抗体”包括免疫球蛋白的基因工程化或以其他方式修饰的形式，如细胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体、中间位使能性抗体、异源缀合抗体(例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、串联二scfv、串联三scfv)等。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。
100.如本文所用，短语“亲本抗原结合蛋白”或“未工程化抗原结合蛋白”是指可以通过改变其氨基酸残基中的一个或多个来工程化以产生衍生物“工程化抗原结合蛋白”或“工程化抗体”的抗体。这种源自亲本抗原结合蛋白/抗体的工程化抗原结合蛋白/抗体可以是“单工程化抗原结合蛋白”，其中仅一个氨基酸残基被不同的工程化氨基酸残基取代。源自亲本抗原结合蛋白/抗体的工程化抗原结合蛋白/抗体也可以是“双工程化抗原结合蛋白”，其中第一位置的氨基酸残基被不同的工程化氨基酸残基取代，并且第二位置的氨基酸残基被不同的工程化氨基酸残基取代。
101.如本文所用，短语“单工程化亲本抗原结合蛋白”是指已在第一位置用工程化氨基酸残基修饰的亲本抗原结合蛋白，从而产生单工程化抗原结合蛋白，其可以通过改变第二位置的氨基酸残基还工程化以产生衍生物“双工程化抗原结合蛋白”。
102.如本文所用，短语“反应性氨基酸残基”是指具有反应性侧链的氨基酸。反应性氨基酸残基包括半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。
103.如本文所用，短语“工程化氨基酸残基”是指抗原结合蛋白中已被不同氨基酸残基取代的氨基酸残基。如本文所用，短语“工程化反应性氨基酸残基”是指抗原结合蛋白中已被作为反应性氨基酸残基的不同氨基酸残基取代的氨基酸残基。
104.如本文所用，术语“配体”是直接或通过接头或通过一些其他反应性部分与抗原结合蛋白的反应性氨基酸残基共价连接的分子或原子。配体包括但不限于多肽、碳水化合物、放射性核素、脂质、核酸、合成化合物和小分子。
105.如本文所用，术语“缀合物”、“缀合的”和“缀合”是指两种或更多种化合物的共价连接。
106.如本文所用，短语“反应性部分”或“反应性基团”是指分子内负责所述分子的特征性化学反应的特定取代基或部分。相同的反应性部分将发生相同或相似的化学反应，而不管其所属的分子的大小。
107.如本文所用，术语“接头”是指包含共价键或原子链的化学部分，其将多肽共价附
接至配体、药物、经由配体的配体或经由配体的药物。所述接头可以是“可切割接头”，其促进细胞中细胞毒性剂或生长抑制剂的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、酯酶不稳定的接头、光不稳定的接头或含二硫键的接头(参见例如，美国专利号5,208,020)。所述接头也可以是“不可切割的接头”(例如smcc接头)，其在一些情况下可能导致更好的耐受性。
108.如本文所用，短语“配体与抗体比”或“lar”是指与一种抗体结合的配体分子数量的化学计量比。类似地，短语“药物与抗体比”或“dar”是指与一种抗体结合的药物分子数量的化学计量比。短语“peg与抗体比”或“par”是指与一种抗体结合的peg分子数量的化学计量比。
109.如本文所用，短语“检测探针”是指配体，其包括但不限于生物素、聚乙二醇(peg)、荧光标签、可视化肽及其组合。
110.如本文所用，术语“peg”或“聚乙二醇”是指具有通常表示为h-(o-ch
2-ch2)
n-oh的结构的聚醚化合物。peg也称为聚环氧乙烷(peo)或聚氧乙烯(poe)，这取决于其分子量。
111.如本文所用，短语“靶向部分”是指可以用于将配体与其缀合的抗体引导至特定靶标的配体。此类靶标的例子包括但不限于细胞膜和癌细胞。
112.如本文所用，术语“药物”是指施用至生物体时引起生物体生理或心理变化的分子。药物包括但不限于：抗炎剂、抗癌剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂等)和麻醉剂。药物也可以是抗癌剂或细胞毒性剂或前药。
113.如本文所用，术语“前药”是指药物活性剂的前体或衍生物形式，与母体药物相比，其活性、反应性或副作用倾向较低，并且能够在体内被酶活化或以其他方式转化为更具活性的形式。
114.如本文所用，短语“抗癌剂”或“抗癌剂”是指对瘤或肿瘤或癌细胞的生长和/或增殖有害并且可以起到减少、抑制或破坏恶性肿瘤作用的分子。
115.如本文所用，术语“细胞抑制剂”是指抑制细胞生长和增殖的分子。
116.如本文所用，短语“细胞毒性核苷”是指通过模拟内源性核苷发挥细胞毒性作用的核碱基或核苷类似物。
117.如本文所用，短语“微管蛋白结合剂”是指与微管蛋白系统直接缔合的分子。
118.如本文所用，术语“激素”是指一类信号分子中的任何成员，所述信号分子由多细胞生物体中的腺体产生并由循环系统运输至靶远器官以调节生理和/或行为。“激素拮抗剂”是作用于激素受体的一种特定类型的受体拮抗剂。
119.如本文所用，短语“抗血管生成剂”是指抑制血管生成的生理过程的分子，通过所述分子，新血管从预先存在的血管形成。
120.如本文所用，短语“酶抑制剂”是指抑制特定酶功能的分子。
121.如本文所用，短语“基因调节剂”是指可以积极或消极影响基因转录的分子。
122.如本文所用，短语“单克隆抗体”是指由相同的免疫细胞制备的抗体，所述免疫细胞都是独特的亲本细胞的克隆。单克隆抗体可以具有单价亲和力，因为它们与相同的表位结合。
123.如本文所用，术语“文库”是指一组定义的成员。如果文库涉及抗原结合蛋白，则所述文库是指一组定义的抗原结合蛋白。如果文库涉及氨基酸位置，则所述文库是指抗原结
合蛋白中一组定义的氨基酸位置。
124.如本文所用，短语“表达载体”是指这样的媒介物，通过它可以将dna或rna序列(例如外来基因)引入宿主细胞中，从而转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如转录和翻译)。此类载体可以包含调节元件(如启动子、增强子、终止子等)以在施用至受试者时引起或指导所述多肽的表达。在用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的例子包括sv40的早期启动子和增强子(mizukami t.等人1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的ltr启动子和增强子(kuwana y等人1987)、免疫球蛋白h链的启动子(mason j o等人1985)和增强子(gillies s d等人1983)等。
125.如本文所用，术语“结构域”是指蛋白质的任何区域，通常基于序列同源性来定义并且常常与特定的结构或功能实体相关。
126.如本文所用，短语“嵌合抗体”是指工程化抗体，在其最广泛的意义上，其含有来自一种抗体的一个或多个区域以及来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域。在一个实施方案中，嵌合抗体包含与另一种抗体(在一个实施方案中，是人抗体)的ch结构域和c
l
结构域缔合的源自非人动物的抗体的vh结构域和vl结构域。作为非人动物，可以使用任何动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等。嵌合抗体也可以表示对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。
127.如本文所用，短语“人源化抗体”是指完全或部分非人来源的抗体，并且其已被修饰以替代某些氨基酸，例如在vh和v
l
结构域的框架区中，以避免或最小化人体中的免疫应答。人源化抗体的恒定结构域在很多时候是人ch和c
l
结构域。
128.如本文所用，术语“片段”是指完整抗体的一部分或结构域，特别是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括fv、fab、f(ab')2、fab
′
、dsfv、(dsfv)2、scfv、sc(fv)2、双抗体、由抗体片段形成的双特异性和多特异性抗体。常规抗体的片段也可以是单结构域抗体，如重链抗体或vhh。
129.如本文所用，短语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。术语“细胞毒性剂”旨在包括化学剂、酶、抗生素和毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素)，包括其片段和/或变体，以及下文所公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是紫杉烷、长春花、美登素或美登素类似物(如dm1或dm4)、小药物、来普霉素衍生物、澳瑞他汀或海兔毒素类似物、前药、拓扑异构酶ii抑制剂、dna烷基化剂、抗微管蛋白剂、cc-1065或cc-1065类似物。
130.如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括以下中的一种或多种：水、氨基酸、盐水、磷酸盐缓冲盐水、缓冲液磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐；氨基酸和衍生物如组氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甘氨酰甘氨酸；无机盐nacl、氯化钙；糖或多元醇，如葡萄糖、甘油、乙醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆188；等，及其组合。在许多情况下，将优选的是在组合物中包括等渗剂，如糖、多元醇或氯化钠，并且配制品还可以含有抗氧化剂(如胺)和稳定剂(如吐温20)。
131.如本文所用，术语“”是指逆转、缓解、抑制疾病、障碍或病症的进展或者预防疾病、障碍或病症，或此类疾病、障碍或病症的一种或多种症状。例如，癌症意指抑制肿
瘤的恶性细胞的生长和/或从所述肿瘤转移的进展。这种还可以导致肿瘤生长的消退，即可测量肿瘤的大小减小。特别地，这种导致肿瘤或转移的完全消退。a.抗原结合蛋白或抗体
132.如下面将更详细讨论的，通用短语“抗原结合蛋白”或“抗体”包括可以在生物化学上区分的五种不同类的抗体。尽管所有五类抗体显然都在本公开文本的范围内，但以下讨论通常将针对免疫球蛋白分子的igg类。关于igg，免疫球蛋白包含分子量为约23,000道尔顿的两条相同的轻链和分子量为53,000-70,000的两条相同的重链。这四条链以“y”构型通过二硫键连接，其中轻链范围是在重链旁从“y”的口处开始并且继续直达可变区末。
133.免疫球蛋白的轻链分类为κ或λ。
134.每种重链类可以与κ或λ轻链结合。通常，当免疫球蛋白由杂交瘤、b细胞或基因工程化宿主细胞生成时，轻链和重链彼此共价键合，并且两条重链的“尾”部分通过共价二硫连接或非共价连接彼此键合。在重链中，氨基酸序列从y构型的分叉末端的n-末端延伸至每条链底部的c-末端。本领域技术人员将理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中具有一些亚类(例如，γ1-γ4)。该链的性质分别将抗体的“类”确定为igg、igm、iga、igg或ige。将免疫球蛋白同种型亚类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1等)充分表征并且已知它们赋予功能特化。由于及时披露，这些类和同种型的每一种的修饰形式对于技术人员都是容易辨别的，因此，它们在本公开文本的范围内。
135.轻链和重链二者都被分成结构和功能同源性的区域。术语“区域”是指免疫球蛋白或抗体链的一部分(“part”或“portion”)，并且包括恒定区或可变区，以及所述区域的更离散的片段或部分。例如，轻链可变区包括如本文所定义的散布在“框架区”或“fr”之间的“互补决定区”或“cdr”。
136.免疫球蛋白重链或轻链的区域可以被定义为“恒定”(c)区或“可变”(v)区，在“恒定区”的情况下是基于多个类成员的区域内序列变化的相对缺乏，或在“可变区”的情况下是基于多个类成员的区域内的显著变化。术语“恒定区”和“可变区”也可以关于功能使用。在这一方面，应当理解，免疫球蛋白或抗体的可变区确定抗原识别和特异性。相反，免疫球蛋白或抗体的恒定区赋予重要的效应子功能，如分泌、经胎盘的移动、fc受体结合、补体结合等。各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维构型是熟知的。
137.免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和可变区被折叠成结构域。术语“结构域”是指重链或轻链的球状区，所述球状区包含例如通过β折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3至4个肽环)。免疫球蛋白轻链上的恒定区可互换地称为“轻链恒定区结构域”、“c
l
区”或“c
l
结构域”。重链上的恒定结构域(例如铰链、ch1、ch2或ch3结构域)可互换地称为“重链恒定区结构域”、“c
h”区结构域或“ch结构域”。轻链上的可变结构域可互换地称为“轻链可变区结构域”、“v
l
区结构域”或“v
l
结构域”。
138.重链上的可变结构域可互换地称为“重链可变区结构域”、“vh区结构域”或“vh结构域”。
139.按照惯例，可变恒定区结构域的编号随着它们离免疫球蛋白或抗体的抗原结合位点或氨基末端越来越远而增加。每个重和轻免疫球蛋白链的n-末端是可变区，并且在c-末端处是恒定区；ch3和c
l
结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。因此，轻链免疫球蛋白的结构域以v
l-c
l
取向排列，而重链的结构域以vh-chl-铰链-ch2-ch3取向排列。
140.重链恒定区中的氨基酸位置(包括ch1、铰链、ch2、ch3和c
l
结构域中的氨基酸位置)可以根据kabat索引编号系统进行编号(参见kabat等人,in“sequences of proteins of immunological interest”,u.s.dept.health and human services,第5版,1991)。可替代地，抗体氨基酸位置可以根据eu索引编号系统进行编号(参见kabat等人，同上)。如本文所用，术语“vh结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，并且术语“v
l
结构域”包括免疫球蛋白轻链的氨基末端可变结构域。
141.如本文所用，术语“ch1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大多数氨基末端)恒定区结构域，其例如从kabat编号系统中的大约位置114-223(eu位置118-215)延伸。ch1结构域与vh结构域和免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端相邻，并且不构成免疫球蛋白重链的fc区的一部分。
142.如本文所用，术语“铰链区”包括将ch1结构域与ch2结构域连接的重链分子的部分。此铰链区包含大约25个残基并且是柔性的，因此允许两个n-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可以细分为三个不同的结构域：上部、中部和下部铰链结构域(roux等人j.immunol.1998,161:4083)。
143.如本文所用，术语“ch2结构域”包括重链免疫球蛋白分子的部分，其例如从kabat编号系统中的大约位置244-360(eu位置231-340)延伸。ch2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密配对。而是将两个n-连接的支链碳水化合物链插入完整天然igg分子的两个ch2结构域之间。在一个实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白包含源自igg1分子(例如人igg1分子)的ch2结构域。
144.如本文所用，术语“ch3结构域”包括重链免疫球蛋白分子的部分，其从ch2结构域的n-末端例如从kabat编号系统的大约位置361-476(eu位置341-445)延伸约110个残基。ch3结构域通常形成抗体的c-末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，另外的结构域可以从c
h3
结构域延伸以形成分子的c-末端部分(例如，igm的μ链和ige的e链中的ch4结构域)。在一个实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白包含源自igg1分子(例如人igg1分子)的ch3结构域。如本文所用，术语“c
l
结构域”包括免疫球蛋白轻链的恒定区结构域，其例如从约kabat位置107a延伸至216。c
l
结构域与v
l
结构域相邻。在一个实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白包含源自κ轻链(例如，人κ轻链)的c
l
结构域。
145.如本文所用，术语“fc区”定义为重链恒定区的部分，其始于木瓜蛋白酶切割位点(即igg中的残基216，将重链恒定区的第一个残基取为114)上游的铰链区并在该抗体的c-末端结束。因此，完整的fc区至少包含铰链结构域、ch2结构域和ch3结构域。
146.如本文所用的术语“天然fc”是指包含得自抗体消化或通过其他手段产生的非抗原结合片段的序列的分子，所述分子呈单体或多聚体形式，并且所述“fc”可以含有铰链区。天然fc的原始免疫球蛋白可以是人起源的，并且可以是任何免疫球蛋白，如igg1或igg2。
147.天然fc分子由单体多肽组成，所述单体多肽可通过共价(即二硫键)和非共价缔合而连接成二聚体或多聚体形式。天然fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目范围为1至4，这取决于类(例如，igg、iga和ige)或亚类(例如，igg1、igg2、igg3、iga1和igga2)。天然fc的一个例子是由木瓜蛋白酶消化igg产生的二硫键键合的二聚体。如本文所用术语“天然fc”是单体、二聚体和多聚体形式通用的。
148.如本文所用术语“fc变体”是指从天然fc修饰但仍包含补救受体fcrn(新生儿fc受
体)的结合位点的分子或序列。示例性fc变体及其与补救受体的相互作用是本领域中已知的。因此，术语“fc变体”可以包含从非人天然fc人源化的分子或序列。此外，天然fc包含可以去除的区域，因为它们提供了抗体样抗原结合蛋白不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“fc变体”包含缺少一个或多个天然fc位点或残基或其中一个或多个fc位点或残基已经被修饰的分子或序列，所述位点或残基影响或涉及：(1)二硫键形成，(2)与所选宿主细胞的不相容性，(3)在所选宿主细胞中表达后的n末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)与除了补救受体以外的fc受体的结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(adcc)。如本文所用的术语“fc结构域”包括如上定义的天然fc以及fc变体和序列。与fc变体和天然fc分子一样，术语“fc结构域”包括单体或多聚体形式的分子，无论是从完整抗体消化而来还是通过其他方式产生。
149.如上所述，抗体的可变区允许其选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的v
l
结构域和vh结构域组合以形成限定三维抗原结合位点的可变区(fv)。该四聚体抗体结构在y的每条臂的末端形成抗原结合位点。更具体地，该抗原结合位点由每个重链和轻链可变区上的三个互补决定区(cdr)限定。如本文所用，术语“抗原结合位点”包括特异性地结合(与
……
免疫反应)抗原(例如细胞表面或可溶性抗原)的位点。抗原结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，并且由这些可变区形成的结合位点决定了抗体的特异性。抗原结合位点由可变区形成，所述可变区在抗体之间有所不同。本公开文本的改变的抗体包含至少一个抗原结合位点。
150.在某些实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白包含提供该抗原结合蛋白与选择的抗原缔合的至少两个抗原结合结构域。所述抗原结合结构域不必源自相同的免疫球蛋白分子。在这一方面，可变区可能源自或源自任何类型的动物，这种动物可以被诱导产生体液反应并产生针对所需抗原的免疫球蛋白。因此，抗原结合蛋白的可变区可以是例如哺乳动物起源的，例如可以是人、鼠、大鼠、山羊、绵羊、非人灵长类动物(如食蟹猴，猕猴等)、羽扇豆或骆驼科动物(例如，来自骆驼、美洲驼和相关物种)。在天然存在的抗体中，存在于每个单体抗体上的六个cdr是短的、非连续的氨基酸序列，所述氨基酸序列特异性地定位以形成抗原结合位点，因为假定该抗体在水性环境中呈现其三维构型。其余的重和轻可变结构域在氨基酸序列中显示出较小的分子间变异性，并且被称为框架区。框架区主要采用β-折叠构象，并且cdr形成环，所述环连接β-折叠结构，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，这些框架区起到形成支架的作用，所述支架提供六个cdr通过链间非共价相互作用在正确方向上的定位。由定位的cdr形成的抗原结合结构域定义了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。
151.示例性抗原结合蛋白包括抗体变体。如本文所用，术语“抗体变体”包括抗体的合成和工程化形式，所述抗体被改变使得它们不是天然存在的，例如包含至少两个重链部分但不是两个完整重链的抗体(如结构域缺失的抗体或微型抗体)；多特异性形式的抗体(例如，双特异性、三特异性等)，其被改变以结合两种或更多种不同抗原或结合单一抗原上的不同表位；与scfv分子连接的重链分子等。此外，术语“抗体变体”包括多价形式的抗体(例如，三价、四价等)，结合相同抗原的三个、四个或更多个拷贝的抗体。
152.如本文所用，术语“价态”是指多肽中潜在的靶结合位点的数目。每个靶结合位点特异性地结合靶分子上的一个靶分子或特异性位点。当多肽包含多于一个靶结合位点时，
每个靶结合位点可以特异性地结合相同或不同的分子(例如，可以结合不同的配体或不同的抗原，或结合相同抗原上的不同表位)。主题抗原结合蛋白通常具有对于人抗原分子特异性的至少一个结合位点。
153.术语“特异性”是指与给定靶抗原(例如人靶抗原)特异性地结合(例如，与
……
免疫反应)的能力。抗原结合蛋白可以是单特异性的并且含有特异性地结合靶标的一个或多个结合位点，或者多肽可以是多特异性的并且含有特异性地结合相同或不同靶标的两个或更多个结合位点。在某些实施方案中，抗原结合蛋白对于相同靶标的两个不同(例如，非重叠)部分是特异性的。在某些实施方案中，抗原结合蛋白对于多于一种靶标是特异性的。示例性抗原结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，所述多肽包含结合肿瘤细胞上表达的抗原的抗原结合位点，并且来自此类抗体的一个或多个cdr可以包括在如本文所述的抗体中。
154.偶尔，来自非高变区或框架区(fr)的残基会影响整体结构域结构，从而影响结合位点。因此，互补决定区或cdr是指氨基酸序列，它们共同定义了天然免疫球蛋白结合位点的天然fv区的结合亲和力和特异性。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个cdr，分别命名为cdr1-l、cdr2-l、cdr3-l和cdr1-h、cdr2-h、cdr3-h。因此，常规的抗体抗原结合位点包括六个cdr，其包含来自重链和轻链v区中的每个的cdr集。a.1.产生抗体的方法
155.本发明的抗体可以通过本领域中已知的任何技术来产生，如但不限于单独的或组合的任何化学、生物学、遗传或酶促技术。
156.在已知所需序列的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以通过用于产生多肽的标准技术容易地产生所述抗体或免疫球蛋白链。例如，它们可以使用熟知的固相方法，使用可商购获得的肽合成装置(如由加利福尼亚州福斯特市的applied biosystems公司制造的装置)并遵循制造商的说明来合成。可替代地，本发明的抗体和免疫球蛋白链可以通过本领域熟知的重组dna技术来合成。例如，在将编码所需(多)肽的dna序列掺入到表达载体中并将此类载体引入到将表达所需多肽的合适的真核或原核宿主中之后，这些片段可以作为dna表达产物获得，随后可以使用熟知的技术从中分离它们。
157.本发明还涉及一种产生本发明抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养根据本发明的经转化的宿主细胞；(ii)表达所述抗体或多肽；和(iii)回收表达的抗体或多肽。本发明的抗体通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如像蛋白a-琼脂糖、羟基磷灰石谱法、凝胶电泳、透析或亲和谱法)从培养基中适当地分离。
158.本发明的人源化嵌合抗体可以通过以下方法来产生：获得如先前所述的编码人源化v
l
和vh结构域的核酸序列，通过将其插入具有编码人抗体ch和人抗体c
l
的基因的动物细胞的表达载体中来构建人嵌合抗体表达载体，并通过将表达载体引入动物细胞中来表达编码序列。作为人嵌合抗体的ch结构域，它可以是属于人免疫球蛋白重链的任何区域，但igg类的那些区域是合适的，并且也可以使用属于igg类的任何一个亚类，如igg1、igg2、igg3和igg4。另外，作为人嵌合抗体的c
l
，它可以是属于人免疫球蛋白轻链的任何区域，并且可以使用κ类或λ类的区域。
159.用于产生人源化或嵌合抗体的方法涉及本领域熟知的常规重组dna和基因转染技术(参见morrison s l.等人(1984)和专利文件美国专利号5,202,238；以及5,204,244)。基于常规重组dna和基因转染技术产生人源化抗体的方法是本领域熟知的(参见例如，
riechmann l.等人1988；neuberger m s.等人1985)。抗体可以使用本领域已知的多种技术来人源化，包括例如，申请wo 2009/032661中公开的技术、cdr-植入(ep 239,400；pct公开wo91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、镶面或表面重修(ep 592,106；ep 519,596；padlan e a(1991)；studnicka g m等人(1994)；roguska m a.等人(1994))，以及链改组(美国专利号5,565,332)。用于制备此类抗体的一般重组dna技术也是已知的(参见欧洲专利申请ep 125023和国际专利申请wo 96/02576)。
160.人源化抗体序列的许多方法在本领域中是已知的；参见例如，almagro和fransson(2008)front biosci.13:1619-1633的综述。一种常用的方法是cdr植入或抗体重塑，其涉及将供体抗体(通常是小鼠抗体)的cdr序列植入到具有不同特异性的人抗体的框架支架中。由于cdr植入可能降低cdr植入的非人抗体的结合特异性和亲和力，从而降低其生物学活性，因此可以在cdr植入的抗体的选定位置处引入回复突变，以便保留亲本抗体的结合特异性和亲和力。可以使用文献和抗体数据库中可用的信息来进行可能的回复突变的位置鉴定。作为回复突变的候选者的氨基酸残基通常是位于抗体分子表面的那些残基，而被掩埋或具有低程度的表面暴露的残基通常不会被改变。cdr植入和回复突变的替代性人源化技术是表面重塑，其中保留了非人起源的非表面暴露残基，而表面残基则改变为人残基。另一种替代技术被称为“引导选择”(jespers等人(1994)biotechnology 12,899)，并且可以用于从鼠抗体衍生保存亲本抗体的表位和结合特性的完全人抗体。
161.对于嵌合抗体，人源化通常涉及对可变区序列的框架区的修饰。作为cdr的一部分的氨基酸残基通常将不会关于人源化进行改变，但是在某些情况下可能期望改变单独cdr氨基酸残基，例如以去除糖基化位点、脱酰胺位点或不需要的半胱氨酸残基。n-连接的糖基化通过将寡糖链附接至三肽序列asn-x-ser或asn-x-thr中的天冬酰胺残基而发生，其中x可以是pro以外的任何氨基酸。n-糖基化位点的去除可以通过以下方式来实现：将asn或ser/thr残基突变为不同的残基，例如通过保守取代的方式。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺可以根据如ph和表面暴露的因素而发生。天冬酰胺残基特别易发生脱酰胺，主要是当存在于asn-gly序列中时发生，而在其他二肽序列如asn-ala中在较小程度上发生。当在cdr序列中存在这种脱酰胺位点、例如是asn-gly时，因此可能希望去除所述位点，通常通过保守取代以去除所涉及残基中的一个。cdr序列中的取代以去除所涉及的残基之一也旨在被本发明所涵盖。
162.常见的表达系统包括大肠杆菌(e.coli)宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他例子包括但不限于原核细胞(如细菌)和真核细胞(如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体例子包括大肠杆菌、克鲁维酵母(kluyveromyces)或酵母属(saccharomyces)酵母、哺乳动物细胞系(例如，vero细胞、cho细胞、3t3细胞、cos细胞等)以及原代或建立的哺乳动物细胞培养物(例如，由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。例子还包括小鼠sp2/0-ag14细胞(atcc crl1581)、小鼠p3x63-ag8.653细胞(atcc crl1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(以下称为“dhfr基因”)有缺陷的cho细胞(urlaub g等人；1980)、大鼠yb2/3hl.p2.g11.16ag.20细胞(atcc crl1662，以下称为“yb2/0细胞”)等。在一个实施方案中，使用yb2/0细胞，因为当在此细胞中表达时，嵌合或人源化抗体的adcc活性增强。a.2.经修饰的抗体
163.可以在本发明的抗体的结构以及编码它们的dna序列中进行修饰和改变，并且仍导致具有所需特征的功能性抗体或多肽。在改变多肽的氨基序列时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物功能方面的重要性在本领域中通常被理解。公认的是，氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白质的二级结构，继而定义了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等)的相互作用。根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征，为其分配了亲水性指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
164.本发明的另一个目的还包括本发明的多肽的功能保守变体。例如，某些氨基酸可以被蛋白质结构中的其他氨基酸取代，而不会明显丧失活性。由于蛋白质的相互作用能力和性质限定了其生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中，当然也可以在其dna编码序列中进行某些氨基酸取代，同时仍获得具有相似特性的蛋白质。因此，可以预期，可以在本发明的抗体序列或编码所述多肽的相应dna序列中进行各种变化，而不会明显丧失其生物活性。
165.本领域已知的是，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸取代，并且仍导致具有相似生物活性的蛋白质，即仍获得生物学功能上等同的蛋白质。还可以使用成熟的技术，如丙氨酸扫描方法，以在本发明的抗体或多肽中鉴定所有可以被取代而不会显著丧失与抗原的结合的氨基酸。此类残基可以被定性为中性，因为它们不参与抗原结合或维持抗体的结构。这些中性位置中的一个或多个可以被丙氨酸或另一个氨基酸取代，而不改变本发明的抗体或多肽的主要特征。
166.如上所述，氨基酸取代通常因此基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑任何前述特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。a.2.a.fc修饰
167.在某些实施方案中，抗原结合蛋白可以包括介导一种或多种效应子功能的抗体恒定区(例如igg恒定区，例如人igg恒定区，例如人igg1或igg4恒定区)。例如，cl复合物与抗体恒定区的结合可以激活补体系统。补体系统的激活在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体系统的激活还刺激炎性反应，并且还可能参与自身免疫性超敏反应。此外，抗体经由fc区与多种细胞上的受体结合(抗体fc区上的fc受体结合位点与细胞上的fc受体(fcr)结合)。存在许多fc受体，所述fc受体对不同类的抗体具有特异性，包括igg(γ受体)、ige(ε受体)、iga(α受体)和igm(mu受体)。抗体与细胞表面上的fc受体的结合引发了许多重要和多样的生物反应，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或adcc)、炎性介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。在一些实施方案中，本发明特征的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)与fc-γ受体结合。在可替代实施方案中，抗原结合蛋白可以包括恒定区，所述恒定区缺乏一种或多种效应子功能(例如，adcc活性)和/或不能结合igg的fcγ受体。
168.某些实施方案包括这样的抗体，其中一个或多个恒定区结构域中的至少一个氨基酸(除了本发明所述的修饰之外)已缺失或以其他方式改变，以便提供另外的所需生物化学特征，如当与具有大致相同的免疫原性的完整的未改变的抗体相比时，或当与仅含有本发明所述的修饰的抗体相比时，降低或增强的效应子功能、非共价二聚的能力、增加的定位在肿瘤部位处的能力、降低的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和方法中的某些抗体是结构域缺失的抗体，其包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但其缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，经修饰的抗体的恒定区的一个整个结构域将被删除，例如，ch2结构域的全部或部分将被删除。
169.在某些其他实施方案中，抗原结合蛋白包含源自不同抗体同种型的恒定区(例如，来自人igg1、igg2、igg3或igg4中的两种或更多种的恒定区)。在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含嵌合铰链(即，包含源自不同抗体同种型的铰链结构域的铰链部分的铰链，所述铰链结构域例如来自igg4分子的上部铰链结构域和igg1中间铰链结构域)。在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含来自人igg4分子的fc区或其部分以及在所述分子的核心铰链区中的ser228pro突变(eu编号)。
170.在某些实施方案中，可以使用本领域已知的技术使fc部分突变以增加或减少效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可以减少循环修饰抗体的fc受体结合，从而增加肿瘤定位。在其他情况下，可能是与本发明一致的恒定区修饰减弱了补体结合，从而降低了血清半衰期和缀合的细胞毒素的非特异性缔合。恒定区的其他修饰可以用于修饰二硫键或寡糖部分，其由于增加的抗原特异性或灵活性而允许增强的定位。所得的生理特征、生物利用度和修饰的其他生物化学效应(如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期)，可以使用熟知的免疫学技术在无需过多的实验的情况下容易地测量和量化。
171.在本发明特征的抗体中采用的fc结构域是fc变体。如本文所用，术语“fc变体”是指相对于衍生所述fc结构域的野生型fc结构域具有至少一个氨基酸取代的fc结构域。例如，其中所述fc结构域源自人igg1抗体，所述人igg1 fc结构域的fc变体包含相对于所述fc结构域的至少一个氨基酸取代。
172.除了本发明特征的变体之外，fc变体的一个或多个氨基酸取代可以位于fc结构域内的任何位置(即，任何eu惯例氨基酸位置)处。在一个实施方案中，所述fc变体在位于铰链结构域或其部分中的氨基酸位置处包含另外的取代。在另一个实施方案中，所述fc变体在位于ch2结构域或其部分中的氨基酸位置处包含另外的取代。在另一个实施方案中，所述fc变体在位于ch3结构域或其部分中的氨基酸位置处包含另外的取代。在另一个实施方案中，所述fc变体在位于ch4结构域或其部分中的氨基酸位置处包含另外的取代。
173.抗原结合蛋白可以采用已知赋予效应子功能和/或fcr结合改善(例如，减少或增强)的任何本领域公认的fc变体。所述fc变体可以包括例如，国际pct出版物wo 88/07089a1、w0 96/14339a1、wo 98/05787a1、w0 98/23289a1、w0 99/51642a1、w0 99/58572a1、wo 00/09560a2、wo 00/32767a1、wo 00/42072a2、wo 02/44215a2、wo 02/060919a2、wo 03/074569a2、wo 04/016750a2、wo 04/029207a2、wo 04/035752a2、wo 04/063351a2、wo 04/074455a2、wo 04/099249a2、wo 05/040217a2、wo05/070963a1、wo 05/077981a2、wo 05/092925a2、wo 05/123780a2、wo 06/019447a1、wo 06/047350a2和wo 06/085967a2或美国专利号5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,
022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；和7,083,784中公开的任何一个氨基酸取代，其各自通过引用以其全文并入本文。在一个示例性实施方案中，抗原结合蛋白可以包含含有在eu位置268处的氨基酸取代的fc变体(例如，h268d或h268e)。在另一个示例性实施方案中，抗原结合蛋白可以包含在eu位置239(例如，s239d或s239e)和/或eu位置332(例如，i332d或i332q)处的氨基酸取代。
174.在某些实施方案中，抗原结合蛋白可以包括包含氨基酸取代的fc变体，所述氨基酸取代改变抗体的抗原非依赖性效应子功能，具体而言，改变所述抗原结合蛋白的循环半衰期。当与缺乏这些取代的抗原结合蛋白相比时，此类抗原结合蛋白展现出与fcrn的增加或减少的结合，因此分别具有增加或减少的血清半衰期。具有改善的fcrn亲和力的fc变体预期具有较长的血清半衰期，并且此类分子在哺乳动物的方法中具有有用的应用，在所述哺乳动物中需要所施用的抗体具有长半衰期例如以慢性疾病或障碍。相反，具有减小的fcrn结合亲和力的fc变体预期具有较短的半衰期，并且此类分子也可用于例如施用至哺乳动物，在所述哺乳动物中缩短的循环时间可能是有利的，例如，对于体内诊断成像或者在当起始抗体长期存在于循环中时具有毒副作用的情况下。具有降低的fcrn结合亲和力的fc变体也不太可能穿过胎盘，因此也可用于孕妇的疾病或障碍。此外，可能需要降低fcrn结合亲和力的其他应用包括局限于脑、肾和/或肝的应用。在一个示例性实施方案中，经改变的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)展现出从脉管系统跨肾小球上皮的运输减少。在另一个实施方案中，经改变的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)展现出从大脑到血管空间中的穿过血脑屏障(bbb)的运输减少。在一个实施方案中，具有经改变的fcrn结合的抗体包含在fc结构域的“fcrn结合环”内具有一个或多个氨基酸取代的fc结构域。fcrn结合环由氨基酸残基280-299(根据eu编号)构成。
175.在国际pct公开号wo05/047327中披露了改变fcrn结合活性的示例性氨基酸取代，将其通过引用以其全文并入本文。在某些示例性实施方案中，所述抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包括具有以下取代中的一个或多个的fc结构域：v284e、h285e、n286d、k290e和s304d(eu编号)。在又其他示例性实施方案中，所述结合分子包括具有双突变h433k/n434f的人fc结构域(参见例如，美国专利号8,163,881)。在其他实施方案中，用于本文所述的诊断和方法的抗原结合蛋白具有恒定区，例如igg1或igg4重链恒定区，所述恒定区被改变以减少或消除糖基化。例如，抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)还可以包括fc变体，其包含改变抗体fc的糖基化的氨基酸取代。例如，所述fc变体可以具有降低的糖基化(例如，n-或o-连接的糖基化)。在示例性实施方案中，fc变体包含通常在氨基酸位置297(eu编号)处发现的n-连接聚糖的降低的糖基化。在另一个实施方案中，所述抗体在糖基化基序(例如，含有氨基酸序列nxt或nxs的n-连接的糖基化基序)内或附近具有氨基酸取代。在特定实施方案中，所述抗体包含在氨基酸位置228或299(eu编号)处具有氨基酸取代的fc变体。在更特定实施方案中，所述抗体包含含有s228p和t299a突变(eu编号)的igg1或igg4恒定区。含双半胱氨酸工程化fc的结合多肽
176.在一方面，本公开文本提供了一种分离的fc结构域变体，其包含至少一个结合结构域(例如，至少一个结合多肽)或与其复合(例如，与其融合)。
177.在某些实施方案中，所述fc结构域变体包含含有第一位置处的工程化反应性氨基
酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置选自：339、360、384、385、422、440及其任何组合。
178.在某些实施方案中，所述fc结构域变体包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置选自：290、360、384、385、422、440及其任何组合。
179.在某些实施方案中，所述fc结构域变体包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置384，并且所述第二位置选自：274、290、339及其任何组合。
180.在某些实施方案中，所述fc结构域变体还包含ch1结构域，其包含根据kabat的eu索引的编号在ch1结构域的第二位置118处的工程化反应性氨基酸残基。
181.在某些实施方案中，所述fc结构域变体还包含ch1结构域，其包含根据kabat的eu索引的编号在所述ch1结构域的第一位置118处的工程化反应性氨基酸残基，以及根据kabat的eu索引的编号在选自274、339、384、385、422、440及其任何组合的第二位置处的工程化反应性氨基酸残基。
182.在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基选自半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。
183.在某些实施方案中，所述结合结构域包含一个或多个抗原结合结构域。所述抗原结合结构域不必与亲本fc结构域(即，不包含第一和第二工程化反应性氨基酸残基的fc结构域)源自相同的分子。在某些实施方案中，所述fc结构域变体存在于抗体中。
184.在一个实施方案中，fc结构域变体存在于抗体中或与抗体复合。来自任何来源或物种的任何抗体均可以与本文所公开的fc结构域变体一起使用。合适的抗体包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。合适的抗体包括但不限于全长抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或单结构域抗体，如vhh抗体。
185.在某些示例性实施方案中，fc结构域变体可以与抗体的抗原结合片段结合或复合。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原或与完整抗体(即，与所述免疫球蛋白或抗体的多肽片段所来源的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)。抗原结合片段可以通过本领域熟知的重组或生物化学方法产生。示例性的抗原结合片段包括fv、fab、fab'和(fab')2。在某些示例性实施方案中，本公开文本的结合多肽包含抗原结合片段和fc结构域变体。
186.在一些实施方案中，所述结合多肽包含单链可变区序列(scfv)。单链可变区序列包含具有一个或多个抗原结合位点的单个多肽，例如通过柔性接头与vh结构域连接的vl结构域。scfv分子可以以vh-接头-vl取向或vl-接头-vh取向构建。连接构成抗原结合位点的vl和vh结构域的柔性铰链包含约10至约50个氨基酸残基。连接肽是本领域已知的。结合多肽可以包含至少一个scfv和/或至少一个恒定区。在一个实施方案中，本公开文本的结合多肽可以包含与fc结构域变体连接或融合的至少一个scfv。
187.在一些实施方案中，本公开文本的结合多肽是多价(例如，四价)抗体，所述多价抗体通过将编码抗体的dna序列与scfv分子(例如，改变的scfv分子)融合而产生。例如，在一个实施方案中，组合这些序列使得scfv分子(例如，改变的scfv分子)在其n-末端或c-末端经由柔性接头(例如，gly/ser接头)与fc结构域变体连接。在另一个实施方案中，本公开文本的四价抗体可以通过如下方法来制备：将scfv分子与连接肽融合，所述连接肽与fc结构域变体融合以构建scfv-fab四价分子。
188.在另一个实施方案中，本公开文本的结合多肽是改变的微型抗体。本公开文本的改变的微型抗体是由两条多肽链组成的二聚体分子，每条多肽链包含经由连接肽与fc结构域变体融合的scfv分子。可以通过使用本领域描述的方法(参见例如美国专利5,837,821或wo 94/09817al)构建scfv组分和连接肽组分来制备微型抗体。在另一个实施方案中，可以构建四价微型抗体。可以用与微型抗体相同的方式构建四价微型抗体，不同的是使用柔性接头连接两个scfv分子。然后将连接的scfv-scfv构建体与fc结构域变体连接。
189.在另一个实施方案中，本公开文本的结合多肽包含双抗体。双抗体是二聚体四价分子，其各自具有与scfv分子类似的多肽，但通常具有连接两个可变结构域的短(小于10个，例如约1至约5个)氨基酸残基接头，使得在相同的多肽链上的vl和vh结构域不能相互作用。相反，一条多肽链的vl和vh结构域(分别)与第二多肽链上的vh和vl结构域相互作用(参见例如，wo 02/02781)。本公开文本的双抗体包含与fc结构域变体融合的scfv样分子。
190.在其他实施方案中，结合多肽包含多特异性或多价抗体，所述多特异性或多价抗体在同一多肽链上串联地包含一个或多个可变结构域，例如串联的可变结构域(tvd)多肽。示例性tvd多肽包括美国专利号5,989,830中描述的“双头”或“双fv”构型。在双fv构型中，两种不同抗体的可变结构域在两条单独的链(一条重链和一条轻链)上以串联方向表示，其中一条多肽链具有被肽接头隔开的两个串联的vh结构域(vh1-接头-vh2)，并且另一条多肽链由通过肽接头串联连接的互补vl结构域组成(vl1-接头-vl2)。在交叉双头构型中，两种不同抗体的可变结构域在两条单独的多肽链(一条重链和一条轻链)上以串联方向表示，其中一条多肽链具有被肽接头隔开的两个串联的vh结构域(vh1-接头-vh2)，并且另一条多肽链由通过肽接头以相反方向串联连接的互补vl结构域组成(vl2-接头-vl1)。基于“双fv”形式的另外的抗体变体包括双可变结构域igg(dvd-igg)双特异性抗体(参见美国专利号7,612,181)和tbti形式(参见us 2010/0226923a1)。在一些实施方案中，结合多肽包括多特异性或多价抗体，所述多特异性或多价抗体包含在与fc结构域变体融合的同一多肽链上串联的一个或多个可变结构域。
191.在另一个实施方案中，结合多肽包含基于“双头”构型的交叉双可变结构域igg(codv-igg)双特异性抗体(参见us20120251541 a1，其通过引用以其全文并入本文)。
192.在其他实施方案中，结合多肽包含crossmab或crossmab-fab多特异性形式(参见wo 2009080253和schaefer等人,pnas(2011),108:11187-1191)。基于crossmab形式的抗体变体在双特异性igg抗体的一个臂内具有抗体结构域的交叉，从而能够实现正确的链关联。
193.在其他实施方案中，所述糖基化效应子-感受态多肽包含呈t细胞衔接器(engager)形式的多特异性抗体。“t细胞衔接器”是指针对宿主的免疫系统(更具体地针对t细胞的细胞毒活性)以及针对肿瘤靶蛋白的结合蛋白。在一些实施方案中，所述经分离的效应子-感受态多肽包含呈nk细胞衔接器形式的多特异性抗体。“nk细胞衔接器”是指包含靶
向激活nk细胞受体的单克隆抗体片段、抗原特异性靶向区和fc区的结合蛋白(gauthier等人cell(2019),177:1701-13)。
194.包含本文所述的fc结构域变体的本公开文本的结合多肽可以包括已知“亲本”抗体的cdr序列或可变结构域序列。在一些实施方案中，除了对本文公开的对fc结构域的修饰之外，亲本抗体和本公开文本的抗体可以共有类似或相同的序列。b.抗体-配体缀合物
195.抗体-配体缀合物可以用于广泛的应用，包括用于靶向。在靶特异性中，抗体的抗原结合部分可以被引导至靶位点，然后将与所述抗体缀合的配体递送至所述位点。此配体可以是药物，如生物活性细胞毒性有效载荷。使用抗体-配体缀合分子的优点是，它们可以被设计成区分健康组织和患病组织。实际上，在临床环境中，与未靶向抗体相比，此类分子已显示出改善的指数，即更高的功效和/或更低的毒性特征。
196.将配体附接至抗体的常规方法利用将配体共价连接至抗体上已经存在的反应性氨基酸，如赖氨酸。作为结果，产生了抗体的异质混合物，其中配体附接在所述抗体上的多个位点处。根据反应条件，所述异质混合物可以含有具有0至10个或更多个附接配体的抗体分布。分析和制备方法不足以分离这些不同的抗体-配体缀合物，从而导致混合物不均匀或不明确，并且因此在方案中不可预测。
197.抗体是大型、复杂且结构多样的生物分子，常常具有许多反应性基团。它们与接头试剂和配体-接头中间体的反应性取决于如配体浓度、ph、盐浓度和共溶剂的身份等因素。此外，由于难以控制反应条件和表征反应物和中间体，与抗体上现有反应性基团的多步骤缀合过程可能是不可重现的。b.1.具有与工程化反应性氨基酸残基缀合的配体的抗体
198.在抗体表面上引入工程化反应性氨基酸残基(其中所述残基可用于与配体缀合但不干扰抗体折叠和组装或改变抗原结合和效应子功能)产生工程化抗原结合蛋白或工程化抗体，其可以用于制备定义的抗体-配体缀合物体。
199.在本文所公开的本发明的某些实施方案中，工程化氨基酸残基是抗原结合蛋白中已被不同氨基酸残基取代的氨基酸残基。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是抗原结合蛋白中已被作为反应性氨基酸残基的不同氨基酸残基取代的氨基酸残基。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。
200.在本文所公开的本发明的某些实施方案中，亲本抗原结合蛋白通过改变其一个或多个氨基酸残基来工程化，以产生衍生物工程化抗原结合蛋白或工程化抗体。这种源自亲本抗原结合蛋白/抗体的工程化抗原结合蛋白/抗体可以是单工程化抗原结合蛋白，其中仅一个氨基酸残基被不同的工程化氨基酸残基取代。源自亲本抗原结合蛋白/抗体的工程化抗原结合蛋白/抗体也可以是双工程化抗原结合蛋白，其中第一位置的氨基酸残基被不同的工程化氨基酸残基取代，并且第二位置的氨基酸残基被不同的工程化氨基酸残基取代。
201.在某些实施方案中，单工程化亲本抗原结合蛋白是在第一位置具有工程化氨基酸残基的抗原结合蛋白，并且可以通过改变第二位置的氨基酸残基来进一步工程化以产生衍生物双工程化抗原结合蛋白。
202.在某些实施方案中，产生了一种工程化抗原结合蛋白，其中将工程化反应性氨基酸残基引入抗原结合蛋白中的1至5个位置之间。在某些实施方案中，产生了一种工程化抗原结合蛋白，其中将工程化反应性氨基酸残基引入抗原结合蛋白中的第一位置，从而产生单工程化抗原结合蛋白。在某些实施方案中，产生了一种工程化抗原结合蛋白，其中将工程化反应性氨基酸残基引入抗原结合蛋白中的第一位置并且将工程化反应性氨基酸残基引入抗原结合蛋白中的第二位置，从而产生双工程化抗原结合蛋白。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸是赖氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸是半胱氨酸。
203.在本文所公开的双工程化抗原结合蛋白或其片段的一个方面，所述双工程化抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置选自：339、360、384、385、422、440及其任何组合。在某些实施方案中，工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。
204.在本文所公开的双工程化抗原结合蛋白或其片段的另一方面，所述双工程化抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置选自：290、360、384、385、422、440及其任何组合。在某些实施方案中，工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。
205.在本文所公开的双工程化抗原结合蛋白或其片段的另一方面，所述双工程化抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置选自：274、339、384、385、422、440及其任何组合。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。
206.在本文所公开的双工程化抗原结合蛋白或其片段的另一方面，所述双工程化抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置384，并且所述第二位置选自：118、274、290、339及其任何组合。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。
207.在某些实施方案中，本文所公开的双工程化抗原结合蛋白或其片段包含工程化反应性氨基酸残基，其经由反应性部分与配体缀合。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基通过接头与所述配体缀合。在某些实施方案中，所述接头是可切割的。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，所述配体与抗体比(lar)是至少3.0。
在某些实施方案中，所述lar是至少3.1。在某些实施方案中，所述lar是至少3.2。在某些实施方案中，所述lar是至少3.3。在某些实施方案中，所述lar是至少3.4。在某些实施方案中，所述配体是peg并且peg与抗体比(par)是至少3.0。在某些实施方案中，所述par是至少3.1。在某些实施方案中，所述par是至少3.2。在某些实施方案中，所述par是至少3.3。在某些实施方案中，所述par是至少3.4。在某些实施方案中，所述配体是药物并且药物与抗体比(dar)是至少3.0。在某些实施方案中，所述dar是至少3.1。在某些实施方案中，所述dar是至少3.2。在某些实施方案中，所述dar是至少3.3。在某些实施方案中，所述dar是至少3.4。
208.在某些实施方案中，本文所公开的单工程化抗原结合蛋白或其片段包含工程化反应性氨基酸残基，其经由反应性部分与配体缀合。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基通过接头与所述配体缀合。在某些实施方案中，所述接头是可切割的。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，所述配体与抗体比(lar)是至少1.5。在某些实施方案中，所述lar是至少1.6。在某些实施方案中，所述lar是至少1.7。在某些实施方案中，所述lar是至少1.8。在某些实施方案中，所述lar是至少1.9。在某些实施方案中，所述配体是peg并且peg与抗体比(par)是至少1.5。在某些实施方案中，所述par是至少1.6。在某些实施方案中，所述par是至少1.7。在某些实施方案中，所述par是至少1.8。在某些实施方案中，所述par是至少1.9。在某些实施方案中，所述配体是药物并且药物与抗体比(dar)是至少1.5。在某些实施方案中，所述dar是至少1.6。在某些实施方案中，所述dar是至少1.7。在某些实施方案中，所述dar是至少1.8。在某些实施方案中，所述dar是至少1.9。
209.在本文所公开的工程化抗原结合蛋白或其片段的某些实施方案中，工程化抗原结合蛋白或其片段包含含有工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域，并且还包含抗体重链可变(vh)结构域。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段还包含抗体轻链可变(v
l
)结构域。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段是嵌合抗体。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段是人源化抗体。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段是人抗体。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段包含一个或多个包含fc区的全长抗体重链。在某些实施方案中，所述fc区是人igg1 fc区。
210.在本文公开的方法的一个方面，产生包含第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法，所述方法包括：(a)产生单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的第一文库，其中每个亲本抗原结合蛋白或其片段包含单工程化反应性氨基酸残基；(b)通过将配体与构成所述第一文库的每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的所述单工程化反应性氨基酸残基缀合，产生配体缀合的工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的第二文库；(c)通过针对高于1.7的配体与抗体比(lar)筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库，其中lar高于1.7的所述单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段具有工程化反应性氨基酸残基的位置构成工程化位置的所述第三文库；(d)产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第四文库，其中每个抗原结合蛋白或其片段包含在选自工程化位置的所述第三文库的第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和在选自工程化位置的所述第三文库的第二位置处的工程化反应性氨基酸残基；以及(e)通过将配体与所述第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和所述第二位置处的工程化反应性氨基酸残基缀合，产生配体缀合的双工程化抗原结合蛋白或其片段的第五文库；以
及(f)通过针对高于3.4的lar筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第六文库。
211.在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库：60％或更高为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合一个配体、20％或更低为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且20％或更低为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库：60％至95％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合一个配体、5％至20％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且5％至20％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库：60％至90％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合一个配体、10％至20％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且10％至20％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库：60％至85％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合一个配体、15％至20％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且15％至20％为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。
212.在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第六文库：80％或更高为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合一个或两个配体、10％或更低为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且5％或更低为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第六文库：80％至99％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合一个或两个配体、1％至10％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且1％至5％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第六文库：80％至95％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合一个或两个配体、2％至10％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且2％至5％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括通过针对如下情况筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第六文库：80％至90％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合一个或两个配体、5％至10％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且3％至5％为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。
213.在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括将配体与构成所述第六文库的双工程化抗原结合蛋白或其片段的工程化反应性氨基酸残基缀合。在某些实施方案中，工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、
氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基经由反应性部分与配体缀合。在某些实施方案中，所述工程化反应性氨基酸残基通过接头与所述配体缀合。在某些实施方案中，所述接头是可切割的。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，所述lar是至少3.0。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，所述lar是至少3.1。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，所述lar是至少3.2。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，所述lar是至少3.3。在某些实施方案中，所述接头是不可切割的。在某些实施方案中，所述lar是至少3.4。
214.在某些实施方案中，产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的方法还包括针对与未工程化抗原结合蛋白或其片段的热稳定性相当的热稳定性来筛选单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的所述第一文库。
215.在产生工程化抗原结合蛋白或其片段的方法的某些实施方案中，工程化抗原结合蛋白或其片段包含含有工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(ch)结构域，并且还包含抗体重链可变(vh)结构域。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段还包含抗体轻链可变(v
l
)结构域。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段是嵌合抗体。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段是人源化抗体。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段是人抗体。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述工程化抗原结合蛋白或其片段包含一个或多个包含fc区的全长抗体重链。在某些实施方案中，所述fc区是人igg1 fc区。b.1.a.配体
216.在某些实施方案中，配体是具有生物或其他功能活性的试剂(例如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、糖肽或其片段)。在某些实施方案中，与未缀合的抗体相比，包含与抗原结合蛋白缀合的配体的经修饰的抗原结合蛋白具有至少一种另外的功能或特性。
217.在某些实施方案中，配体与抗原结合蛋白或抗体缀合以用于多种目的和/或功能，包括但不限于充当靶向部分、充当诊断剂、充当药物的替代物和/或充当药物。在某些实施方案中，所述配体是靶向部分，其可以是蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物和/或其组合。
218.在某些实施方案中，所述配体包含特异性结合至一种或多种靶分子的靶向部分。可以采用任何类型的靶向部分，包括但不限于蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物(例如，聚糖)及其组合(例如，糖蛋白、糖肽和糖脂)。在某些实施方案中，所述靶向部分是碳水化合物或糖肽。在一个实施方案中，所述靶向部分是三价糖肽(例如含有三价galnac聚糖的糖肽或含有三价半乳糖的糖肽)。在具体的实施方案中，含有三价半乳糖的多肽是乳糖
3-cys3gly4。在某些实施方案中，所述靶向部分是聚糖。靶向部分可以是天然或非天然存在的分子。适用于缀合的靶向部分可以包括含有氨基氧基接头的那些部分。
219.本发明所述的靶向部分可以在体外或体内与任何类型的细胞结合，包括动物(例如，哺乳动物)、植物或昆虫细胞，而不受限制。所述细胞可以是内胚层、中胚层或外胚层来源的，并且可以包括任何细胞类型。在某些实施方案中，所述靶向部分结合至细胞(例如哺乳动物细胞)，促进抗原结合蛋白递送至所述靶向细胞，例如以改善细胞靶向和/或摄取。示
例性靶细胞包括但不限于免疫细胞(例如，淋巴细胞，如b细胞、t细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞或树突细胞)、肝脏细胞(例如，肝细胞或非实质细胞如肝窦内皮细胞、枯氏细胞或肝星状细胞)、肿瘤细胞(例如，任何恶性或良性细胞，包括肝癌细胞、肺癌细胞、肉瘤细胞、白血病细胞或淋巴瘤细胞)、血管细胞(例如，主动脉内皮细胞或肺动脉内皮细胞)、上皮细胞(例如，单纯性鳞状上皮细胞、单纯性柱状上皮细胞、假复层柱状上皮细胞或复层鳞状上皮细胞)或间充质细胞(例如，淋巴和循环系统的细胞、骨细胞和软骨细胞)。
220.在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白被细胞内化。在另一个实施方案中，被细胞内化的抗原结合蛋白的量大于缺乏被细胞内化的靶向部分的参考抗原结合蛋白的量。
221.在一个实施方案中，所述靶向部分与靶细胞上的受体结合。例如，所述靶向部分可以包含与细胞上的甘露糖6磷酸受体结合的甘露糖6磷酸部分。在其他示例性实施方案中，所述靶向部分与靶细胞上的siglec结合。示例性siglec包括唾液酸粘附素(siglec-1)、cd22(siglec-2)、cd33(siglec-3)、mag(siglec-4)、siglec-5、siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、siglec-12、siglec-14或siglec-15。在又一些实施方案中，所述靶向部分包含α2,3-、α2,6-或α2,8-连接的唾液酸残基。在另一个实施方案中，所述靶向部分包含α2,3-唾液酸基乳糖部分或α2,6-唾液酸基乳糖部分。其他示例性受体包括凝集素受体，包括但不限于c型凝集素受体、半乳糖凝集素和l型凝集素受体。示例性凝集素受体包括：tdec-205、巨噬细胞甘露糖受体(mmr)、dectin-1、dectin-2、巨噬细胞诱导的c型凝集素(mincle)、树突细胞特异性icam3-结合非整合素(dc-sign、cd209)、dc nk凝集素组受体-1(dngr-1)、langerin(cd207)、cd 169、lectican、去唾液酸糖蛋白受体、dcir、mgl、dc受体、胶原凝集素、选择素、nk细胞受体、多ctld内吞受体、reg组(vii型)凝集素、软骨凝集素、四连蛋白、多囊蛋白、吸引素(attractin)(atrn)、嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白(embp)、dgcr2、血栓调节蛋白、bimlec、seec和cb cp/frem 1/qbrick。
222.在某些实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白与包含诊断剂的配体缀合。在一个实施方案中，所述诊断剂是可检测的小分子标记，例如荧光团、发团、自旋共振探针、成像剂或放射性标记。示例性荧光团包括荧光染料(例如荧光素、罗丹明等)和其他发光分子(例如鲁米那)。荧光团可以是环境敏感的，使得如果它位于经修饰的抗原结合蛋白中的一个或多个残基附近，则其荧光会发生变化，所述经修饰的抗原结合蛋白在结合底物(例如丹磺酰探针)时经历结构变化。示例性放射性标记包括含有具有一个或多个低灵敏度核的原子的小分子。放射性核素可以是例如γ、光子或发射正电子的放射性核素，其半衰期适合于在施用到定位到成像部位之间经过的时间之后允许活动或检测。
223.在一个实施方案中，所述诊断剂是多肽。示例性诊断多肽包括具有荧光或显活性，例如能够切割形成荧光团或发团作为产物的底物的酶(即报告蛋白如萤光素酶)。其他诊断蛋白可以具有内在的荧光或显活性(例如，来自生物发光海洋生物的绿、红和黄荧光生物发光水母发光蛋白)，或者它们可以包含含有一个或多个低能量放射性核(
13
c、
15
n、2h、
125
i、
124
i、
123
i、
99
tc、
43
k、
52
fe、
64
cu、
68
ga、
111
in等)的蛋白质。
224.关于结合本公开文本使用放射性标记的缀合物，本公开文本的抗原结合蛋白可以直被接标记(如通过碘化)或者可以通过使用螯合剂间接被标记。如本文所用，短语“间接标记”和“间接标记方法”两者均意指螯合剂共价附接至抗原结合蛋白，并且至少一种放射性核素与螯合剂缔合。此类螯合剂通常被称为双功能螯合剂，因为它们结合多肽和放射性同
位素两者。示例性螯合剂包括1-异硫氰酸苄酯-3-甲基二烯三胺五乙酸(“mx-dtpa”)和环己基二亚乙基三胺五乙酸(“chx-dtpa”)衍生物。其他螯合剂包括p-dota和edta衍生物。特别是用于间接标记的放射性核素包括
111
in和
90
y。大多数成像研究使用5mci
111
in标记的抗体，因为与较低剂量相比，此剂量既安全又具有提高的成像效率，其中最佳成像发生在抗体施用后的三至六天。参见例如，murray,(1985),j.nuc.med.26:3328和carraguillo等人,(1985),j.nuc.med.26:67。用于直接标记的放射性核素可以是例如
13l
i。本领域技术人员将理解，非放射性缀合物也可以根据所选择的待缀合的试剂来组装。
225.在某些实施方案中，所述诊断剂是fret(荧光共振能量转移)探针。fret已用于多种诊断应用，包括癌症诊断。fret探针可以包括连接fret探针的供体和受体部分的可切割接头(酶敏感或ph接头)，其中切割导致增强的荧光(包括近红外)(参见例如，a.cobos-correa等人membrane-bound fret probe visualizes mmp12 activity in pulmonary inflammation,nature chemical biology(2009),5(9),628-63；s.gehrig等人spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters(2012)angew.chem.int.ed.,51,6258
ꢀ‑
6261)。
226.在某些实施方案中，配体可以被官能化以含有另外的基团。例如，所述配体可以含有可切割接头，所述接头在特定条件下从抗原结合蛋白释放配体。在示例性实施方案中，所述配体可以包括可被细胞酶切割和/或对ph敏感的接头。另外，或可替代地，所述配体可以含有二硫键，在摄取到细胞内时所述二硫键被细胞内谷胱甘肽切割。
227.在又其他实施方案中，所述配体可以包括亲水性和生物相容性部分，如聚(甘氨酸)、聚(噁唑啉)或peg部分。
228.在其他方面，所述配体是包含聚(乙二醇)(peg、peo或poe)的部分。peg是环氧乙烷的低聚物或聚合物，并且具有化学结构η-(o-ch2-ch2)n-oh，其中括号中的元素是重复的。聚乙二醇化(“pegylation”或“pegylation”)是将peg聚合物链附接至另一分子(例如，抗原结合蛋白)的过程，然后将其描述为聚乙二醇化的(“pegylated”或“pegylated”)。聚乙二醇化可以用于降低免疫原性和抗原性，以及增加其所附接分子的流体动力学大小(溶液中的大小)，从而减少肾脏清除率并延长循环时间。聚乙二醇化还可以使分子更具水溶性。在本发明的一个实施方案中，所述peg部分可以包含单peg、双peg或三peg。在另一个实施方案中，所述peg部分包含3至3.5个peg。
229.在某些实施方案中，所述配体含有氨基氧基，所述氨基氧基经由稳定的肟连接促进与抗原结合蛋白的缀合。
230.在其他实施方案中，所述配体含有酰肼和/或n-烷基化肼基团，以促进经由稳定的腙连接与抗原结合蛋白的缀合。
231.本发明的抗原结合蛋白可以用于通过靶向碳水化合物受体(例如，甘露糖6-磷酸受体、甘露糖受体和去唾液酸糖蛋白受体)而在多种疾病中去除有毒化合物和有害物质进入肝脏。请参见：ganesan,l.p.等人：rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium.plos pathogens 2011,9:1；和monnier,v.m.等人：glucosepane:a poorly understood advanced glycation end product of growing importance for diabetes and its complications.clin chem lab med 2014；52:21。
232.本发明的抗原结合蛋白也可以用于通过靶向不同的细胞受体来靶向肿瘤细胞，所述不同的细胞受体包括但不限于：碳水化合物受体、去唾液酸糖蛋白受体和siglec。请参见：chen,w.c.等人：in vivo targeting of b-cell lymphoma with glycan ligands of cd22.blood 2010,115:4778；chen,w.c.等人：targeting b lymphoma with nanoparticles bearing glycan ligands of cd22.leuk lymphoma 2012,53:208；hatakeyama,s.等人：targeted drug delivery to tumor vasculature by a carbohydrate mimetic peptide.pnas,2011,108:19587；hong,f.等人：β-glucan functions as an adjuvant for monoclonal antibody immunotherapy by recruiting tumoricidal granulocytes as killer cells.cancer res.2003,23:9023；kawasakia,n.等人：targeted delivery of lipid antigen to macrophages via the cd169/sialoadhesin endocytic pathway induces robust invariant natural killer t cell activation.pnas 2013,110:7826；和medina,s.h.等人：n-acetylgalactosamine-functionalized dendrimers as hepatic cancer cell-targeted carriers.biomaterials 2011,32:4118。
233.本发明的结合肽也可以用于通过各种受体来调节免疫应答，所述受体包括但不限于碳水化合物受体、dc-sign或siglec。b.1.b.药物替代物
234.在某些实施方案中，所述配体是检测探针，其可以是生物素、聚乙二醇(peg)、荧光标签、可视化肽和/或其组合。在某些实施方案中，与抗原结合蛋白或抗体缀合的检测探针用作药物的替代物，部分原因是所述配体的大小与所述药物的大小相当。在某些实施方案中，所述检测探针是生物素。在某些实施方案中，所述检测探针是peg。在某些实施方案中，所述peg具有15,000-20,000g/mol或15-20kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有10,000-15,000g/mol或10-15kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有5,000-10,000g/mol或5-10kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有4,000-5,000g/mol或4-5kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有3,000-4,000g/mol或3-4kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有2,000-3,000g/mol或2-3kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有1,000-2,000g/mol或1-2kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有900-1,000g/mol或0.9-1kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有800-900g/mol或0.8-0.9kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有700-800g/mol或0.7-0.8kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有600-700g/mol或0.6-0.7kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有500-600g/mol或0.5-0.6kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有400-500g/mol或0.4-0.5kda的分子量。在某些实施方案中，所述peg具有300-400g/mol或0.3-0.4kda的分子量。
235.使用配体或检测探针作为药物的替代物可以使得能够针对所需特性来筛选抗体-配体缀合物，所述所需特性包括但不限于热稳定性、结构完整性、抗原结合能力和/或缀合效率。缀合效率的一种量度是配体与抗体比(lar)、peg与抗体比(par)和/或药物与抗体比(dar)。b.1.c.药物
236.在某些实施方案中，所述配体是药物。
237.在某些实施方案中，作为细胞毒物的配体与抗体的缀合导致形成具有药物细胞毒性作为第二功能(即除了抗原结合之外)的抗体。在某些实施方案中，第二抗体与所述抗体的缀合可以赋予另外的结合特性。在某些实施方案中，当所述配体是遗传编码的或诊断蛋白或核酸时，所述配体可以通过本领域熟知的肽合成或重组dna方法合成或表达。在某些实施方案中，当所述配体是非遗传编码的肽或药物时，所述配体可以人工合成或从天然来源纯化。
238.在某些实施方案中，所述药物是前药。前药包括但不限于含磷酸盐的前药、含氨基酸的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药、任选取代的含苯氧乙酰胺的前药或任选取代的含苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和可以转化为更具活性的无细胞毒物的其他5-氟尿苷前药。本领域技术人员可以对所需药物或其前药进行化学修饰，以使所述化合物的反应更方便地用于制备本公开文本的经修饰的抗原结合蛋白。所述药物还包括本文所述药物的衍生物、药学上可接受的盐、酯、酰胺和醚。衍生物包含对本文所鉴定的药物的修饰，其可以改善或不显著地降低特定药物的所需活性。
239.在某些实施方案中，所述药物可以是抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂、麻醉剂、细胞毒性剂、放射性核素、免疫调节剂、细胞信号肽、生长因子、酶、寡核苷酸、光敏剂和/或其组合。
240.在某些实施方案中，所述药物是抗癌剂或抗癌剂。这种试剂的例子包括但不限于细胞抑制剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂、酶抑制剂、基因调节剂、蛋白酶体抑制剂、蝶啶、烯二炔、鬼臼毒素、澳瑞他汀、格尔德霉素、加利刹霉素、短杆菌肽d、类美登素、新制癌菌素、拓扑替康、紫杉烷类、细胞松弛素b、溴化乙锭、吐根碱、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登素衍生物、蒽环类衍生物、双膦酸盐衍生物、来普霉素衍生物、链黑霉素衍生物、澳瑞他汀衍生物、倍癌霉素衍生物和/或其任何组合。
241.在某些实施方案中，所述药物是细胞抑制剂，所述细胞抑制剂可以是菌素、dna合成抑制剂、dna嵌入剂、dna-rna转录调节剂、安沙霉素苯醌、醌类衍生物、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、亚丝醌、卡巴醌、吲哚醌e09、二氮杂环丙烷基苯醌甲基dzq、三亚乙基磷酰胺、亚化合物和/或其任何组合。
242.示例性细胞抑制抗癌剂包括烷基化剂，如蒽环类药物家族(例如阿霉素、洋红霉素、环孢菌素-a、氯喹、甲氨喋呤、光神霉素、泊非霉素、链霉黑素、泊非霉素、菌素二酮和氮丙啶)。其他细胞抑制抗癌剂包括dna合成抑制剂(例如，甲氨蝶呤和二氯甲氨蝶呤、3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、氨基蝶呤、胞嘧啶β-d-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦、羟基脲、放线菌素-d和丝裂霉素c)、dna嵌入剂或交联剂(例如，博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺式-二氯二氨合铂(ii)(顺铂)、美法仑、米托蒽醌和奥沙利铂)和dna-rna转录调节剂(例如，放线菌素d、柔红霉素、阿霉素、高三尖杉酯碱和伊达比星)。与本公开文本相容的其他示例性细胞抑制剂包括安沙霉素苯醌、醌类衍生物(例如喹诺酮类、染料木素、细菌素(bactacyclin))、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、亚丝醌、卡巴醌、吲哚醌e09、二氮杂环丙烷基苯醌甲基dzq、三亚乙基磷酰胺和亚化合物(例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀)。
243.在某些实施方案中，所述药物是细胞毒性核苷，所述细胞毒性核苷可以是腺苷阿
拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤和/或其任何组合。
244.在某些实施方案中，所述药物是微管蛋白结合剂。示例性微管蛋白结合剂包括但不限于：紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他赛、紫杉烷)、诺考达唑、根霉素、海兔毒素(例如海兔毒素-10、-11或-15)、秋水仙碱和类秋水仙素(例如zd6126)、康普瑞汀(例如康普瑞汀a-4、ave-6032)和长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨(诺维本))。
245.在某些实施方案中，所述药物是激素和激素拮抗剂。示例性抗癌激素和激素拮抗剂包括但不限于：皮质类固醇(例如泼尼松)、孕激素(例如羟孕酮或甲羟孕酮)、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、雄激素(例如睾酮)、芳香酶抑制剂(例如氨基葡萄糖酰亚胺)、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-l,8-萘酰亚胺、芹菜素、布雷菲德菌素a、西咪替丁、二氯亚甲基二膦酸、亮脯利特(亮丙瑞林)、促黄体激素释放激素、皮斐松-a、雷帕霉素、性激素结合球蛋白和毒胡萝卜素。示例性抗癌、抗血管生成化合物包括但不限于：血管抑制素kl-3、dl-a-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素和(+)-沙利度胺。
246.在某些实施方案中，所述药物是抗血管生成剂，所述抗血管生成剂可以是血管抑制素kl-3、dl-a-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素、(+)-沙利度胺及其任何组合。
247.在某些实施方案中，所述药物是酶抑制剂。示例性的抗癌酶抑制剂包括但不限于：s(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯并-咪唑ι-β-d-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美司坦、福司曲星、牛奶树碱、2-亚氨基-l-咪唑烷乙酸(环肌氨酸)、洛伐他汀、曲古抑菌素a、酪氨酸磷酸化抑制剂ag34和酪氨酸磷酸化抑制剂ag 879。
248.在某些实施方案中，所述药物是基因调节剂。示例性抗癌基因调节剂包括但不限于：5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化醇(维生素d3)、4-羟基他莫昔芬、褪黑素、米非司酮、雷洛昔芬、反式-视黄醛(维生素a醛)、视黄酸、维生素a酸、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇(维生素a)、他莫昔芬和曲格列酮。
249.其他类别的抗癌剂包括但不限于：蝶啶家族药物、烯二炔和鬼臼毒素。这些类别的特别有用的成员包括，例如，甲氨喋呤、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷或磷酸依托泊苷、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。与本文的传授内容相容的仍其他抗癌剂包括澳瑞他汀类(例如澳瑞他汀e和一甲基澳瑞他汀e)、格尔德霉素、加利刹霉素、短杆菌肽d、类美登素(例如美登素)、新制癌菌素、拓扑替康、紫杉烷类、细胞松弛素b、溴化乙锭、吐根碱、替诺泊苷、秋水仙素、二羟基菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同系物。与本文的传授内容相容的仍其他抗癌剂包括美登素衍生物、蒽环类衍生物、双膦酸盐衍生物、来普霉素衍生物、链黑霉素衍生物、澳瑞他汀衍生物和倍癌霉素衍生物。
250.可以用作药物的另一类相容的抗癌剂是放射增敏药物，其可以有效地导向肿瘤或免疫反应性细胞。此类药物部分增强了对电离辐射的敏感性，从而提高了放射疗法的疗效。不受理论限制，但用放射增敏药物修饰并被肿瘤细胞内化的抗体将在核附近放射增敏最大的地方递送放射增敏剂。失去放射增敏剂部分的抗体将从血液中迅速清除，从而将剩余的放射增敏剂定位在靶肿瘤中，并在正常组织中提供最小的摄取。在从血液中清除后，可以通
过特异性针对肿瘤的外部束辐射、直接植入肿瘤的放射性或使用相同经修饰抗体的全身放射免疫疗法施用辅助放射疗法。在一个实施方案中，所述剂包含具有高能电离辐射的放射性核素或放射性标记，所述放射性核素或放射性标记能够引起细胞核dna中的多链断裂，从而导致细胞死亡。示例性高能放射性核素包括：
90
y、
125
i、
131
i、
123
i、min、
105
rh、
153
sm、
67
cu、
67
ga、
166
ho、
177
lu、
186
re和
188
re。这些同位素通常产生路径长度短的高能α或β粒子。此类放射性核素杀死它们紧密接近的细胞，例如缀合物已附接或已进入的肿瘤细胞。它们对非定位细胞影响不大或没有影响，并且基本上是非免疫原性的。可替代地，高能同位素可以通过热辐照其他稳定同位素来产生，例如与在硼中子俘获疗法中一样(guan等人,pnas,95:13206-10,1998)。
251.在某些实施方案中，所述药物是放射性同位素。放射性同位素的例子包括但不限于适用于癌症的放射性同位素，如at
211
、bi
212
、er
169
、i
131
、i
125
、y
90
、in
111
、r
32
、re
186
、re
188
、sm
153
、sr
89
和lu的放射性同位素。此类放射性同位素通常主要发射β-辐射。在一个实施方案中，所述放射性同位素是α-发射体同位素，更确切地说是发射α-辐射的钍227。b.1.d.蛋白水解靶向嵌合体(protac)配体
252.如本文所定义，短语“蛋白水解靶向嵌合体”或“protac”是指包含通过接头连接的目的蛋白(poi)配体(即，结合目标蛋白的配体)和e3泛素连接酶(e3)募集配体的双功能分子。protac通过与poi和e3形成三元复合物来启动降解级联，使泛素化机制紧密接近，用于随后的poi泛素化。然后，多泛素化的poi被26s蛋白酶体识别并降解。26s蛋白酶体是泛素-蛋白酶体系统(ups)的一部分，ups是真核细胞调节蛋白质水平的主要机制。因此，protac是用于靶向和降解细胞内蛋白质的有用配体。pettersson等人(drug discov today technol.2019.31:15-27)和maneiro等人(acs chem biol.2020.15(6):1306-1312)描述了另外的protac公开和示例性protac，将其中每个通过引用并入本文。
253.在某些实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白或其片段包含工程化反应性氨基酸残基，其经由反应性部分与protac缀合。在其他实施方案中，接头将工程化反应性氨基酸残基与protac缀合。b.1.e.溶酶体靶向嵌合体(lytac)配体
254.如本文所定义，短语“溶酶体靶向嵌合体”或“lytac”是指双功能分子，其包含能够结合细胞表面溶酶体靶向受体的区域和能够结合靶蛋白的细胞外结构域的区域，包括但不限于，分泌的细胞外蛋白和膜结合蛋白的细胞外结构域。因此，当目的靶蛋白不在细胞内时，lytac是上述protac的有用替代物。banik等人(chemrxiv.2019)、banik等人(nature.2020.584:291-297)、wo 2015/143091和wo 2020/132100描述了另外的lytac公开和示例性lytac，将其中每个通过引用并入本文。如本文所用，lytac能够结合靶蛋白的细胞外结构域的部分对应于本公开文本的抗原结合蛋白或其片段。
255.在某些实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白或其片段包含工程化反应性氨基酸残基，其经由反应性部分与lytac缀合。在其他实施方案中，接头将工程化反应性氨基酸残基与lytac缀合。
256.在某些实施方案中，lytac能够结合细胞表面溶酶体靶向受体的区域包含甘露糖-6-磷酸(m6p)或其衍生物、galnac(例如，三价galnac)和糖肽。在某些实施方案中，所述细胞表面溶酶体靶向受体包含去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)、甘露糖-6-磷酸受体(m6pr)(包括
但不限于非阳离子依赖性m6pr)和唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(siglec)。b.1.f.配体与抗体比(lar)
257.如本文所定义，短语“配体与抗体比”或“lar”是指与一种抗体结合的配体分子数量的化学计量比。如果所述配体是可以充当药物替代物的peg分子，则短语“peg与抗体比”或“par”是指与一种抗体结合的peg分子数量的化学计量比。如果所述配体是药物，则短语“药物与抗体比”或“dar”是指与一种抗体结合的药物分子数量的化学计量比。
258.根据一个实施方案，根据本发明的缀合物的特征在于lar/par/dar的范围为1至10，例如2至5，特别是3至4。这通常是包括美登素分子的缀合物的情况。此lar/par/dar数值可以随所使用抗体和药物(即生长抑制剂)的性质以及用于缀合的实验条件(如生长抑制剂/抗体的比率、反应时间、溶剂和助溶剂(如果有的话)的性质)而改变。因此，抗体与生长抑制剂之间的接触产生包含几种缀合物的混合物，所述缀合物由于不同的配体/peg/药物与抗体比而彼此不同；任选地，裸抗体；任选地，聚集体。因此，所确定的lar/par/dar是平均值。
259.可以用于测定lar/par/dar的方法包括用分光光度法测量在λd和280nm下基本纯化的缀合物溶液的吸光度比率。280nm是通常用于测量蛋白质浓度(如抗体浓度)的波长。选择波长λd以允许区分药物和抗体，即如本领域技术人员容易知道的，λd是药物具有高吸光度的波长，并且λd充分远离280nm以避免药物和抗体的吸收峰的实质重叠。在美登素分子的情况下，可以选择λd为252nm。lar/par/dar计算的方法可以源自antony s.dimitrov(编辑),llc,2009,therapeutic antibodies and protocols,第525、445卷,springer science。
260.lar/par/dar计算如下：缀合物通常包含1至10个与抗体(lar或dar)共价附接的美登素分子。此数值可以随所使用抗体和美登素的性质以及用于缀合的实验条件(如美登素/抗体比、反应时间、溶剂和助溶剂(如果有的话)的性质)而改变。因此，抗体与美登素之间的接触产生包含几种缀合物的混合物，所述缀合物由于不同的配体/peg/药物与抗体比而彼此不同；任选地，裸抗体；任选地，聚集体。因此，所确定的lar/par/dar是平均值。
261.本文用于测定lar的方法包括用分光光度法测量基本上纯化的缀合物溶液在252nm和280nm处的吸光度比率。特别地，所述lar可以使用分别在280和252nm处对于抗体和美登素(ε
d250
＝5,180m-1
cm-1
和ε
d252
＝26,159m-1
cm-1
)测量的消光系数，用分光光度法测定。计算方法源自antony s.dimitrov(编辑),llc,2009,therapeutic antibodies and protocols,第525、445卷,springer science并在下面详细描述：
262.在尺寸排阻谱法(sec)分析的单体峰上(允许计算“lar(sec)”参数)或使用经典分光光度计设备(允许计算“lar(uv)”参数)测量缀合物在λd(a
λd
)和280nm(a
280
)处的吸光度。吸光度可以表示如下：a
λd
＝(cd×
ε
dλd
)+(ca×
ε
aλd
)a
280
＝(cd×
ε
d280
)+(ca×
ε
a280
)其中：
·cd
和ca分别是配体/药物和抗体在溶液中的浓度
·
ε
dλd
和ε
d280
分别是配体/药物在λd和280nm处的摩尔消光系数
·
ε
aλd
和ε
a280
分别是抗体在λd和280nm处的摩尔消光系数。具有两个未知数的这两个方程的解析得出以下方程：cd
＝[(ε
a280
×
(ε
aλd
×a280
)]/[(ε
dλd
×
ε
a280
)-(ε
aλd
×
ε
d280
)]ca＝[a
280-(cd×
ε
d280
)]/ε
a280
[0263]
然后根据药物浓度与抗体浓度的比计算平均lar：lar＝cd/ca。b.2.用于产生抗体-配体缀合物的方法
[0264]
如本文所用，术语“反应性部分”是指包含一部分或整个官能团的部分，所述官能团包含负责特征性化学反应的一个或多个原子和一个或多个键。在示例性实施方案中，反应性部分包括但不限于醛部分、炔烃、氨基氧基部分、叠氮化物、肼、酮部分和硫醇。在一些实施方案中，所述反应性部分是末端反应性部分。在反应步骤中，第一反应性部分与第二反应性部分反应，以形成配体缀合的抗原结合蛋白。如本文所用，“醛”部分是指甲酰基官能团，并由以下结构式表示：
[0265]
例如，包含末端醛部分的cmp-唾液酸衍生物包括但不限于以下结构式：
[0266]
如本文所用，“炔”部分是指碳-碳三键。
[0267]
如本文所用，“氨基氧基”部分是指氮-氧单键，并由以下结构式表示：
[0268]
如本文所用，“叠氮化物”部分是指rn3部分，并且可以由以下结构式表示：
[0269]
如本文所用，“肼”部分是指至少一个氮-氮单键，并由以下结构式表示：
[0270]
如本文所用，“亚胺”部分是指碳-氮双键，并由以下结构式表示：
[0271]
在一些实施方案中，靶向或配体缀合的抗原结合蛋白包含亚胺。例如，一种类型的亚胺包括但不限于醛亚胺、羟胺、腙、或肟。如本文所用，“腙”部分是指亚胺的类型，并由以下结构式表示：
[0272]
在一些实施方案中，所述腙可以是末端腙。在一些实施方案中，腙连接包含腙部分连同另外的官能团，例如，接头或连接部分的一部分。
[0273]
如本文所用，“酮(keto或ketone)”部分包含羰基官能团，并由以下结构式表示：
[0274]
如本文所用，“马来酰亚胺”部分包含不饱和酰亚胺，并由以下结构式表示：
[0275]“肟”部分是一种类型的亚胺，并由以下结构式表示：
[0276]“硫醇”是指包含-sh官能团的部分，其也称为巯基。在一些实施方案中，硫醇含有碳键合的巯基。
[0277]
如本文所用，当涉及反应性部分时，术语“末端”描述与直链或支链部分的末端键合的基团。在一些实施方案中，所述末端反应性部分是官能团的取代基。
[0278]
术语“氧化剂”是指在氧化另一化合物或试剂的同时，从所述另一化合物或试剂接受或获得电子从而经历还原的化合物或试剂。例如，氧化剂包括但不限于高碘酸钠、高碘酸氧化酶、半乳糖氧化酶、过氧化氢和铜化合物(例如，硫酸铜(ii))。
[0279]
如本文所用的术语“环境温度”等同于术语“室温”，并且表示在20℃至26℃(等同于68
°
f至79
°
f)之间的温度范围，其中平均温度为大约23℃(73
°
f)。
[0280]
抗体-配体缀合物可以通过本领域已知的体外方法制备。为了将配体(如药物或前药)与抗体连接，使用了接头或连接基团。合适的连接基团是本领域熟知的，并且包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。本发明抗体与细胞毒性剂或生长抑制剂的缀合可以使用多种双功能蛋白偶联剂进行，包括但不限于n-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丁酸酯(spdb)、丁酸4-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫基]-2,5-二氧代-1-吡咯烷基酯(硝基-spdb)、4-(吡啶-2-基二巯基)-2-磺基-丁酸(磺基-spdb)、n-琥珀酰亚胺基(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)、(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚胺酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如vitetta等人(1987)中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳标记的1-异硫氰酸基苄基甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂(wo 94/11026)。
[0281]
通过将多肽与将前药(例如肽基化学剂，参见wo 81/01145)转化为活性抗癌
药物的前药激活酶缀合，本发明的抗体也可以用于依赖酶介导的前药疗法(参见例如，wo 88/07378和美国专利号4,975,278)。可用于adept的免疫缀合物的酶组分包括能够以这样的方式作用于前药以便将其转化成其更具活性的细胞毒性形式的任何酶。可用于本发明方法的酶包括但不限于可用于将含磷酸酯前药转化成游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸酯前药转化成游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可用于将含肽前药转化成游离药物的蛋白酶，如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧基肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶b和l)；可用于转化含有d-氨基酸取代基的前药的d-丙氨酰基羧基肽酶；可用于将糖基化前药转化成游离药物的碳水化合物裂解酶，如o-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将经p-内酰胺衍生化的药物转化成游离药物的p-内酰胺酶；和可用于将在胺氮处分别经苯氧乙酰基或苯基乙酰基衍生化的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素v酰胺酶或青霉素g酰胺酶。通过本领域熟知的技术，如使用上述的异双功能交联试剂，可以将酶与本发明的多肽共价结合。
[0282]
通常，所述缀合物可以通过包括以下步骤的方法获得：(i)使细胞结合剂(例如，根据本发明的抗体)的任选缓冲的水性溶液与接头和细胞毒性化合物的溶液接触；(ii)然后任选地将(i)中形成的缀合物与未反应的细胞结合剂分离。
[0283]
细胞结合剂的水性溶液可以用缓冲液(例如像磷酸钾、乙酸盐、柠檬酸盐或n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes缓冲液))缓冲。缓冲液取决于细胞结合剂的性质。细胞毒性化合物在有机极性溶剂(例如二甲基亚砜(dmso)或二甲基乙酰胺(dma))中。反应温度通常在20℃至40℃之间。反应时间可以从1至24小时变化。细胞结合剂与细胞毒性剂之间的反应可以通过具有折射计和/或uv检测器的尺寸排阻谱法(sec)来监测。如果缀合物产量太低，则可以延长反应时间。
[0284]
本领域技术人员可以使用多种不同的谱方法以进行步骤(ii)的分离：可以例如通过sec、吸附谱法(如离子交换谱法、iec)、疏水相互作用谱法(hic)、亲和谱法、混合支持谱法如羟基磷灰石谱法或高效液相谱法(hplc)来纯化缀合物。也可以使用通过透析或渗滤进行的纯化。
[0285]
在步骤(i)或(ii)之后，可以使含缀合物的溶液进行谱法、超滤和/或渗滤的另外的步骤(iii)。在这些步骤结束时，在水性溶液中回收缀合物。c.抗原结合蛋白的表达
[0286]
在一方面，提供了编码本文所公开的抗原结合蛋白的核酸分子。还提供了制备抗原结合蛋白的方法，所述方法包括表达这些核酸分子或多核苷酸。
[0287]
通常将编码本文所公开的抗原结合蛋白的核酸分子或多核苷酸插入表达载体中以引入宿主细胞中，所述宿主细胞可以用于产生所需量的要求保护的抗体或其片段。因此，在某些方面，本公开文本提供了包含本文公开的多核苷酸的表达载体以及包含这些载体和多核苷酸的宿主细胞。
[0288]
表达载体是用于在细胞中引入和表达所需基因的媒介物。如本领域技术人员所知，此类载体可以容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。一般而言，与本发明相容的载体将包含选择标记、促进所需基因的克隆的适当的限制性位点，以及进入真核或原核细胞和/或在所述细胞中复制的能力。
[0289]
出于本发明的目的，可以使用许多表达载体系统。例如，一类载体纲利用源自动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(rsv、mmtv或momlv)或sv40病毒的dna元件。其他载体类涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，可以通过引入一种或多种标记来选择已将dna整合至其染体中的细胞，所述一种或多种标记允许选择经转染的宿主细胞。所述标记可以提供对营养缺陷型宿主的原营养、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的抗性。可选择标记基因可以直接与待表达的dna序列连接，或通过共转化引入同一细胞中。还可能需要另外的元件来最佳地合成mrna。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一些实施方案中，将克隆的可变区基因与如上所述合成的重链和轻链恒定区基因(例如，人恒定区基因)一起插入表达载体中。
[0290]
在其他实施方案中，所述抗原结合蛋白可以使用多顺反子构建体表达。在此类表达系统中，可以从单个多顺反子构建体产生多种目的基因产物，如抗体的重链和轻链。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(ires)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的多肽。相容的ires序列在美国专利号6,193,980中公开，出于所有目的，将其通过引用以其全文并入本文。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用于有效产生本技术中公开的全系列多肽。
[0291]
更一般地，一旦制备了编码抗体或其片段的载体或dna序列，就可以将表达载体引入适当的宿主细胞中。也就是说，所述宿主细胞可以被转化。可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来实现将质粒引入宿主细胞中。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包膜dna的细胞融合、显微注射和完整病毒感染。参见ridgway,a.a.g.“mammalian expression vectors”第24.2章,第470-472页vectors,rodriguez和denhardt编辑(butterworths,boston,mass.1988)。可以通过电穿孔将质粒引入宿主中。使转化的细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)或荧光激活细胞分选仪分析(facs)、免疫组织化学等。
[0292]
如本文所用，术语“转化”应在广义上使用，是指将dna引入受体宿主细胞中，这改变了基因型并因此导致受体细胞的变化。
[0293]
沿着相同的思路，“宿主细胞”是指已经采用使用重组dna技术构建的并且编码至少一种异源基因的载体转化的细胞。在描述用于从重组宿主分离多肽的过程时，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示抗体来源，除非另有明确说明。换言之，从“细胞”中回收多肽可以意指从离心沉淀的全细胞，或从含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物中回收。
[0294]
在一个实施方案中，用于抗体表达的宿主细胞系是哺乳动物来源的。本领域技术人员可以确定最适合在其中表达所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于dg44和duxb11(中国仓鼠卵巢系，dhfr-)、hela(人宫颈癌)、cv-1(猴肾系)、cos(具有sv40 t抗原的cv-1的衍生物)、r1610(中国仓鼠成纤维细胞)、balbc/3t3(小鼠成纤维细胞)、hak(仓鼠肾系)、sp2/o(小鼠骨髓瘤)、bfa-1c1bpt(牛内皮细胞)、raji(人淋巴细胞)、293(人肾)。在一个实施方案中，细胞系提供由其表达的抗体的改变的糖基化，例如无岩藻糖基化(例如，(crucell)或fut8敲除cho细胞系(细胞)(biowa，普
林斯顿，新泽西州))。在一个实施方案中，可以使用ns0细胞。cho细胞是特别有用的。宿主细胞系通常可从商业服务，例如美国组织培养物保藏中心(american tissue culture collection)或公开的文献中获得。
[0295]
体外生产允许按比例放大以得到大量的所需多肽。在组织培养条件下用于哺乳动物细胞培育的技术是本领域已知的并且包括同质悬浮培养(例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或在琼脂糖上微珠或陶瓷盒上的固定化或包埋的细胞培养(例如在中空纤维、微胶囊中)。如果必要和/或需要的话，可以通过常规谱方法，例如凝胶过滤、离子交换谱法、在deae-纤维素上的谱法和/或(免疫)亲和谱法纯化多肽的溶液。
[0296]
编码本发明所述的抗原结合蛋白的基因也可以在非哺乳动物细胞(如细菌或酵母或植物细胞)中表达。在这一方面，应当理解，也可以转化多种单细胞非哺乳动物微生物如细菌，即那些能够在培养或发酵中生长的那些微生物。易于转化的细菌包括肠杆菌科成员，如大肠杆菌(escherichia coli)或沙门氏菌属的菌株；芽孢杆菌科，如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；肺炎球菌；链球菌属和流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)。还应理解，当在细菌中表达时，所述多肽可以成为内含体的一部分。必须分离、纯化多肽，然后将其组装成功能性分子。
[0297]
除原核生物外，还可以使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，尽管许多其他菌株是通常可获得的。对于在酵母属中的表达，通常使用例如质粒yrp7(stinchcomb等人,nature,282:39(1979)；kingsman等人,gene,7:141(1979)；tschemper等人,gene,10:157(1980))。此质粒已经含有trp1基因，所述基因提供缺乏在氨酸中生长的能力的酵母突变菌株的选择标记，例如atcc号44076或pep4-1(jones,genetics,85:12(1977))。然后，trpl损伤的存在作为酵母宿主细胞基因组特征提供在没有氨酸的情况下通过生长检测转化的有效环境。d.施用抗原结合蛋白的方法
[0298]
制备并向受试者施用抗原结合蛋白(例如，本文所公开的抗原结合蛋白)的方法是本领域技术人员熟知或容易确定的。本公开文本的抗原结合蛋白的施用途径可以是口服、肠胃外、吸入或局部。如本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。虽然所有这些形式的施用明显被认为是在本公开文本的范围内，但施用的形式将是用于注射，具体地是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适于注射的药物组合物可以包含缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如人白蛋白)等。然而，在与本文的传授内容相容的其他方法中，可以将经修饰的抗体直接递送至不良细胞的位点，由此增加患病组织对剂的暴露。
[0299]
用于肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本公开文本的组合物和方法中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1m或0.05m磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常见的肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更具体地，适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液，以及用
于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在此类情况下，所述组合物必须是无菌的并且流动性应达到存在可注射性的程度。它应在制造和储存条件下稳定，并且还应防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
[0300]
防止微生物的作用可以通过各种抗细菌以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。也可以在所述组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠)。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
[0301]
在任何情况下，可以通过将活性化合物(例如，经修饰的抗原结合蛋白自身或与其他活性剂组合)以所需的量掺入适当的溶剂中，接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液，所述溶剂根据需要具有本文列举的一种成分或多种成分的组合。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中制备分散体，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法通常包括真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。将用于注射的制剂加工，填充至容器如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，所述制剂可以以试剂盒的形式包装和销售，如共同未决的u.s.s.n.09/259,337和u.s.s.n.09/259,338中描述的那些，将其中每个通过引用并入本文。此类制品可以包括标签或包装说明书，其表明相关组合物可用于患有或易患自身免疫或肿瘤障碍的受试者。
[0302]
用于上述病症的本公开文本组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物以及是预防性的还是性的。通常，所述患者是人，但也可以非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法逐步增加，以优化安全性和功效。
[0303]
对于用抗原结合蛋白进行被动免疫，所述剂量的范围可以例如是约0.0001至100mg/kg，更通常0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、l mg/kg、2mg/kg等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内，例如至少1mg/kg。在上述范围中间的剂量也意图落入本公开文本的范围内。可以每日、隔日、每周或按根据经验分析确定的任何其他时间表向受试者施用这样的剂量。示例性使得需要在例如至少六个月的延长时期内施用多个剂量。另外的示例性方案使得需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。示例性剂量时间表包括连续日1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种抗原结合蛋白，在这种情况下，所施用的每种抗体的剂量都在所示范围内。
[0304]
可以多次施用本文所述的抗原结合蛋白。单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量所述患者中经修饰的抗原结合蛋白或抗原的血液水平所指示，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调节剂量以实现血浆经修饰的抗原结合蛋白浓度为1-1000μ
g/ml，并且在一些方法中所述浓度为25-300μg/ml。可替代地，抗原结合蛋白可以作为持续释放配制品施用，在这种情况下需要较不频繁的施用。对于抗体，剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期而改变。通常，人源化抗体显示出最长的半衰期，其次是嵌合抗体和非人抗体。
[0305]
施用的剂量和频率可以根据是预防性的还是性的而变化。在预防性应用中，将含有本发明抗体或其混合物的组合物施用至尚未处于疾病状态的患者，以增强患者的抵抗力。将这样的量定义为“预防有效剂量”。在此用途中，精确量还取决于患者的健康状态和总体免疫性，但通常在每剂量0.1至25mg，尤其是每剂量0.5至2.5mg的范围内。以相对不频繁的间隔长时间施用相对低的剂量。一些患者在余生持续接受。在性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量(例如，每剂量约1至400mg/kg抗体，其中5至25mg的剂量更常用于放射免疫缀合物，并且更高剂量用于经细胞毒素-药物修饰的抗体)，直到疾病进展减少或终止，或直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。
[0306]
本文所述的抗原结合蛋白可以任选地与有效需要的障碍或病症(例如，预防性或性)的其他药剂一起组合施用。本公开文本的
90
y标记的经修饰抗体的有效单次剂量(即有效量)范围在约5与约75mci之间，如在约10与约40mci之间。
131
i经修饰抗体的有效单次非骨髓消融剂量范围在约5与约70mci之间，如在约5与约40mci之间。
131
i标记的抗体的有效单次消融剂量(即，可能需要自体骨髓移植)的范围在约30与约600mci之间，如在约50与小于约500mci之间。与嵌合抗体一起，由于关于鼠抗体的较长循环半衰期，
131
i标记的嵌合抗体的有效单次非骨髓消融剂量的范围在约5与约40mci之间，例如小于约30mci。例如，
111
in标记的成像标准通常小于约5mci。
[0307]
尽管可以如上所述施用抗原结合蛋白，但必须强调的是，在其他实施方案中，抗原结合蛋白可以作为一线疗法施用至其他健康患者。在此类实施方案中，可以将抗原结合蛋白施用至具有正常或平均红骨髓储备的患者和/或施用至尚未进行一种或多种其他疗法且未进行一种或多种其他疗法的患者。如本文所用，经修饰的抗体或其片段的施用与辅助疗法一起或组合意指依序、同时、同延、并行、伴随或同期施用或施加所述疗法和所公开的抗体。本领域技术人员将理解，可以定时施用或施加组合的性方案的各种组分以增强的总体有效性。基于所选辅助疗法和本说明书的传授内容，技术人员(例如，有经验的肿瘤学家)在不进行过度实验的情况下便能够容易地辨别有效的组合方案。
[0308]
如前所述，本公开文本的抗原结合蛋白、免疫反应性片段或其重组体可以以药学有效量施用，以用于哺乳动物障碍的体内。在这一方面，应当理解，所公开的抗原结合蛋白将被配制成促进施用且促进活性剂的稳定性。
[0309]
根据本公开文本的药物组合物通常包括药学上可接受的无毒无菌载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。出于本技术的目的，与剂缀合或未缀合的经修饰的抗原结合蛋白、其免疫反应性片段或重组体的药学有效量应保持意指足以实现与抗原的有效结合且足以获得益处(例如，足以改善疾病或障碍的症状或检测物质或细胞)的量。在肿瘤细胞的情况下，经修饰的抗原结合蛋白通常将能够与肿瘤细胞或免疫反应细胞上选择的免疫反应性抗原相互作用，并提供这些细胞死亡的增加。当然，本公开文本的药物组合物可以以单剂量或多剂量施用，以提供药学有效量的经修饰的抗原结合蛋白。
[0310]
为了与本公开文本的范围保持一致，本公开文本的抗原结合蛋白可以按照上述方法以足以产生或预防效果的量施用至人或其他动物。本公开文本的抗原结合蛋白可以以通过根据已知技术将本公开文本的抗体与常规药学上可接受的载体或稀释剂组合制备的常规剂型施用至这种人或其他动物。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量，施用的途径和其他公知的变量。本领域技术人员将还理解，包含本公开文本所述的一种或多种抗原结合蛋白的混合物可以证明是特别有效的。药物组合物
[0311]
本发明的抗体或免疫缀合物可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质(如可生物降解的聚合物)组合，以形成组合物。
[0312]
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然地取决于待的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。本发明的药物组合物可以被配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等。
[0313]
在一个实施方案中，所述药物组合物含有对于能够被注射的配制品是药学上可接受的媒介物。这些可以是等渗的、无菌的、盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)，或干燥的、尤其是冻干的组合物，其根据具体情况添加无菌水或生理盐水，允许可注射溶液的构成。
[0314]
可以通过药物组合装置施用所述药物组合物。
[0315]
用于施用的剂量可以根据各种参数来调整，并且例如根据所使用的施用方式、相关病理或可替代地所需持续时间来调整。
[0316]
为了制备药物组合物，可以将有效量的本发明的抗体或免疫缀合物溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。
[0317]
适合注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体；制剂，包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且可以用适当的装置或系统注射以便在不降解的情况下递送。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。
[0318]
可以在与表面活性剂适当混合的水中制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物制备分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
[0319]
可以将本发明的多肽、抗体或免疫缀合物配制成呈中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，并且其与无机酸例如像盐酸或磷酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的此类有机酸形成。由游离羧基形成的盐也可以源自无机碱(例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)、以及有机碱(例如异丙胺、三甲胺、甘氨酸、组氨酸、普鲁卡因等)。
[0320]
载体也可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过
在所述组合物中使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可以延长可注射组合物的吸收。
[0321]
通过以下制备无菌可注射溶液：将活性化合物以所需量掺入视需要具有任何上文所列举的其他成分的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，分散液是通过以下方式来制备：将各种无菌活性成分并入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
[0322]
还考虑了用于直接注射的更浓缩或高度浓缩的溶液的制备，其中预期使用dmso作为溶剂以导致极快的渗透，从而将高浓度的活性剂递送至小肿瘤区域。
[0323]
在配制时，将以与剂量配制品相容的方式且以有效的量施用溶液。所述制剂容易地以多种剂型施用，如上述可注射溶液的类型，但也可以采用药物释放胶囊等。
[0324]
例如，对于在水性溶液中的肠胃外施用，如有必要，应适当缓冲所述溶液，并首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水性溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，根据本公开文本，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗nacl溶液中，并添加至1000ml皮下灌注液中或注射到拟定的输注部位处(参见例如，“remington's pharmaceutical sciences”第15版,第1035-1038和1570-1580页)。根据被受试者的状况，剂量必然将发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将为单独受试者确定适当的剂量。
[0325]
可以将本发明的抗体或免疫缀合物配制在混合物中，以大约每剂量包含约0.01至100毫克。
[0326]
除了配制用于肠胃外施用(如静脉内或肌内注射)的抗体或免疫缀合物之外，其他药学上可接受的形式还包括，例如用于口服施用的片剂或其他固体；延时释放胶囊；以及当前使用的任何其他形式。
[0327]
在某些实施方案中，预期使用脂质体和/或纳米颗粒将多肽引入宿主细胞中。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用是本领域技术人员已知的。
[0328]
纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式捕获化合物。为了避免由于细胞内聚合物超载引起的副作用，通常使用能够在体内被降解的聚合物来设计此类超细颗粒(尺寸为大约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒，或可生物降解的聚丙交酯或聚丙交酯共乙交酯纳米颗粒被考虑用于本发明，并且此类颗粒可以容易地制备。
[0329]
脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成，并自发地形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(mlv))。mlv通常具有25nm至4μm的直径。mlv的超声处理导致形成直径在200至范围内的小单层囊泡(suv)，在核心中含有水性溶液。脂质体的物理特征取决于ph、离子强度和二价阳离子的存在。
[0330]
本领域技术人员将易于明了，本文所述方法的其他适宜修饰和适应可在不背离本文所公开实施方案的范围的情况下使用适宜等效方式来进行。虽然现已详细描述某些实施方案，但参照以下实施例将更清楚地理解所述实施方案，所述实施例仅出于说明目的而被包括，并且不打算具有限制性。
实施例实施例1-单工程化亲本半胱氨酸抗体的制备
[0331]
按照推荐的方案，使用quickchange lightning诱变或q5 site directed mutagenesis试剂盒产生29种重链抗体突变体。在产生编码特定单工程化亲本半胱氨酸突变抗体的序列后，所述抗体在人胚肾(hek)细胞衍生的expi293细胞中表达。以96孔板形式进行蛋白质表达，其中在96孔板中每孔0.5ml培养基和每个样品3或5ml。在转染后第4天收获培养基。与已建立的expi293细胞方案一致地进行抗体表达。
[0332]
经由基于蛋白a的纯化方法纯化抗体。将3或5ml样品应用于hamilton microlab star液体处理系统上的20或80μl phynexus尖端。捕获、洗涤蛋白质，并用专有的phynexus缓冲液洗脱(图1和表1)。表1.纯化的抗体突变体。
[0333]
测量单工程化亲本半胱氨酸突变体的热稳定性，并将其与使用纳米dsf的未工程化抗体进行比较(图2)。
[0334]
纳米dsf是一种改进的差示扫描荧光分析法，其用于采用内在氨酸或酪氨酸荧光来确定蛋白质稳定性。蛋白质稳定性通常通过热或化学展开实验来解决。在热展开实验中，将线性温度斜坡应用于展开蛋白质，而化学展开实验则使用渐增浓度的化学变性剂。蛋白质的热稳定性通常由“熔解温度”或“tm”来描述，在所述温度下蛋白质体的50％被展开，对应于从折叠到展开的转变的中点。与常规的dsf方法形成对照，纳米dsf使用氨酸或酪氨酸荧光来监测蛋白质展开。荧光强度和荧光最大值两者都强烈取决于氨酸的周围环境。因此，350nm与330nm处的荧光强度的比适于检测蛋白质结构的任何变化，例如由于蛋白质展开所致的变化。其应用包括抗体工程化、膜蛋白研究、质量控制和配制品开发。实施例2-缀合的单工程化亲本半胱氨酸抗体的制备
[0335]
使用具有马来酰亚胺peg(5kda)的thiomab方法，研究了各种抗体半胱氨酸突变体的可缀合性。thiomab方法是指将半胱氨酸残基特定地工程化到抗体的恒定区中。通过引用并入本文的sochaj等人(biotechnology advances.2015.33(6):775-784)还详细介绍了这种方法。用于获得图6中的粗体残基(k274c、k290c、a339c、k360c)的缀合方案是在最初比较不同方法(如用tcep和半胱氨酸进行部分还原)之后选择的。将sds-page凝胶的考马斯和peg染两者均用于检测聚乙二醇化。然而，仅将考马斯染用于缀合排序。在非还原和还原条件下筛选突变体。用64eq的dtt进行解盖(图3、图4、图5、图6)。
[0336]
表达了27种含有未配对半胱氨酸残基的抗体突变体。通过聚乙二醇化的程度和选择性对突变体进行排序，由于peg分子的大小，其充当基于药物的缀合的替代物。选择标准表述如下：
·
≥60％单聚乙二醇化
·
≤20％多聚乙二醇化
·
peg：抗体比(par)≥1.7
·
≤20％未聚乙二醇化
[0337]
基于上述选择标准，鉴定了14种单工程化半胱氨酸突变体。在所选的14种中，以下10种突变体被认为是优选的：a339c、s440c、k290c、s442c、k274c、v422c、n384c、g385c、q418c、k360c。
[0338]
用于鉴定优选突变的方法基于以下公式：
·fmono
–fmulti
–fun
·fmono
＝单聚乙二醇化的分数，f
multi
＝多聚乙二醇化的分数，f
un
＝未聚乙二醇化的分数
·
被排除的突变体不符合上述标准，或含有显著的游离hl(游离重链，如sds-page所示)
[0339]
peg染证实较高分子量条带是聚乙二醇化，而非聚集。换句话说，这些较高分子量条带对应于较高的聚乙二醇化，而不是较高分子量种类的聚乙二醇化。实施例3-双工程化半胱氨酸抗体的制备
[0340]
基于上述单工程化半胱氨酸突变体筛选的结果，以与实施例1中所述相同的方式产生双突变体，不同之处在于在50ml生物反应器管中以5或10ml规模进行表达，并且使用蛋白质标记(protein biosolutions)，将hitrap蛋白质a柱用于抗体纯化。如以上实施例2所述进行peg缀合和聚乙二醇化筛选。
[0341]
提议的双半胱氨酸突变体列于下表2中。表2.提议的双半胱氨酸突变体
[0342]
如下制备双半胱氨酸突变体。使用q5或quickchange lightning sdm试剂盒进行诱变。在10ml生物反应器管中使用expi293表达进行表达。使用基于蛋白质a的纯化在蛋白质标记上的1ml mabselect sure上进行纯化。随后用amicon-15(10kd剪切)进行缓冲液交换。图7示出了在非还原和还原条件下的代表性纯化，而表3示出了所有双半胱氨酸突变体的纯化数据。图8示出了使用纳米dsf进行的热稳定性分析。表3.抗体纯化
实施例4-双工程化半胱氨酸抗体的聚乙二醇化筛选
[0343]
如实施例2中所述，使用具有马来酰亚胺peg(5kda)的thiomab方法，研究了具有双工程化半胱氨酸突变体的抗体的可缀合性。
[0344]
通过聚乙二醇化的程度和选择性对双半胱氨酸突变体进行排序，由于peg分子的大小，其充当基于药物的缀合的替代物(图9和图10)。选择标准表述如下：
·
≥80％单和二聚乙二醇化
·
≤10％多聚乙二醇化
·
peg：抗体比(par)≥3.4
·
≤5％未聚乙二醇化
[0345]
基于上述选择标准，鉴定了19种双工程化半胱氨酸突变体(图11、图12、图13、图14)。实施例5-用替代还原剂tcep制备缀合的单工程化亲本半胱氨酸抗体
[0346]
除了先前描述的用于解盖工程化单个半胱氨酸残基的dtt还原之外，还研究了tcep还原。使用具有马来酰亚胺peg(5kda)和tcep的thiomab方法，研究了27种不同抗体半胱氨酸突变体的可缀合性。将sds-page凝胶的考马斯和peg染两者均用于检测聚乙二醇化。然而，仅将考马斯染用于缀合排序。在非还原和还原条件下筛选突变体(图15)。
[0347]
通过包括缀合效率(par)和选择性(单聚乙二醇化重链％、未聚乙二醇化重链％和多聚乙二醇化重链％)的不同指标对突变体进行排序，如使用dtt的先前筛选那样进行排序(图16和图17)。
[0348]
使用tcep筛选，将突变k326c、t299c、a339c、k274c、g385c、q386c、y300c、k414c、s440c、s415c鉴定为前10种突变体。与原始dtt筛选相比，四种突变体(a339c、k274c、s440c、g385c)在使用tcep或dtt解盖的缀合中排名前10。
[0349]
数据显示，对于使用tcep的缀合，多聚乙二醇化和par减少。dtt与tcep解盖之间的缀合效率的差异可能是由于局部疏水性。实施例6-在单半胱氨酸突变体中观察到的缀合效率
[0350]
使用聚乙二醇化还研究了这些突变体的可缀合性。在用dtt部分还原抗体突变体后，将它们用脱氢抗坏血酸(dhaa)重新氧化。然后将抗体聚乙二醇化，并在非还原和还原两种条件下，使用sds-page进行分析，其中凝胶使用考马斯蓝染(图3)。使用用peg染法染的还原性sds-page凝胶证实了相同样品的聚乙二醇化(图20)。在考马斯蓝染的还原凝胶上检测到单聚乙二醇化、未聚乙二醇化和多聚乙二醇化的蛋白质条带，并使用proteinsimple进行扫描。用alphaview软件确定每个种类的百分比。
[0351]
以不同的效率(par或peg与抗体比)和不同的选择性将不同的单半胱氨酸突变体聚乙二醇化，其计算方法是用未聚乙二醇化和多聚乙二醇化条带(每个抗体重链上缀合多于两个peg，非所需种类)减去单聚乙二醇化条带(所需种类)(图3)。有趣的是，如非还原sds-page所示，在大多数缀合物中发现了低蛋白质聚集体，尽管如先前所示，其中一些在缀合之前显示出一定水平的聚集(图1)。在非还原sds-page下，用突变体n297c和n298c检测到大量的半抗体缀合物种类。这通过peg染得到证实(图23)。
[0352]
基于它们的高缀合效率(par》1.7)和选择性(》60％单聚乙二醇化、《20％多聚乙二醇化和《20％未聚乙二醇化)，从这27种突变体中选择了10种最佳单半胱氨酸突变体：a339c、s440c、k290c、s442c、k274c、v422c、n384c、g385c、q418c和k360c。尽管其他一些突变体显示出高的par，但由于其低选择性或存在大量的半抗体缀合物，它们被排除在最佳列表之外。
实施例7-缀合对fcγriiia结合的影响
[0353]
用2kda马来酰亚胺peg将三种半胱氨酸突变体聚乙二醇化，或使用未配对半胱氨酸的dtt解盖将其与peg 2-生物素接头缀合。选择了特定的突变k290c、q295c和s442c(图18)。在缀合后，使用biacore分析抗体的fcγriiia结合。下表4示出了每一抗体在每个位置处的缀合物数量。表4.每一抗体在每个单个突变位置处的peg缀合物和生物素缀合物的数量表4.每一抗体在每个单个突变位置处的peg缀合物和生物素缀合物的数量
[0354]
为了测试fcγriiia结合，将抗hpc4标签抗体固定在cm5传感器芯片上。然后通过固定的抗hpc4抗体(在ca
2+
的存在下)捕获hpc4标记的fcγriiia。然后以恒定浓度进行每种缀合的单个突变抗体的一式三份注射。用180秒缔合和180秒解离期进行动力学。为了便于分析，计算了每种变体的稳态结合反应的平均值。
[0355]
如图19所示，所有三种变体均显示出与wt抗体相似的fcγriiia结合反应。聚乙二醇化降低了所有三种变体的结合，并且生物素缀合没有显著影响k290c或s442c的结合。实施例8-聚乙二醇化单半胱氨酸突变体的血浆稳定性
[0356]
将七种单半胱氨酸突变体(a339c、s440c、s442c、k274c、422c、n384c和g385c)与小鼠血浆(0.02mg/ml，接近在体内注射1mg/kg的小鼠中的初始血浆浓度)一起孵育。在将样品在co2培养箱中于37℃下孵育0和96小时后，使用蛋白质印迹分析样品。用重组兔抗peg抗体进行蛋白质印迹。分析了单聚乙二醇化条带。在蛋白质印迹中，顶部扩散条带是多聚乙二醇化种类，由于存在更多的peg，因此它们与抗peg抗体强烈反应。蛋白质印迹在图21中示出。分析并绘制来自蛋白质印迹的单聚乙二醇化条带，如图22所示。结果显示，与未孵育的样品相比，在血浆中孵育96小时后，聚乙二醇化突变体展示出稳定性，其中在蛋白质中保留至少75％的聚乙二醇化。实施例9-另外的双工程化半胱氨酸抗体的制备
[0357]
基于先前对单半胱氨酸突变体进行聚乙二醇化筛选的结果，设计了38种双半胱氨酸突变体。除了来自如上所述用dtt还原的聚乙二醇化的q418c之外，将前10种单半胱氨酸突变彼此组合或与先前报道的a118c组合(美国专利号7,521,541)。它们是使用定点诱变产生的，并由expi293细胞表达。大多数工程化双半胱氨酸突变体显示出相当的表达滴度，除了双半胱氨酸突变体k360c+k290c显示出至少4倍降低的滴度(表5)。来自sds-page的结果显示突变体s440c+n384c的高聚集(图7)，而sec-hplc分析也检测到此双半胱氨酸突变体以及a339c+s440c的高聚集。还将这些突变体的热稳定性与野生型抗体和大多数含有a339c突
变(包括a339c+n384c、a339c+g385c、a339c+v422c、a339c+s442c、a118c+a339c和k274c+a339c)的双半胱氨酸突变体进行了比较，展示出比野生型抗体低至少2度的热转化温度(tm1)(表5)。表5.双半胱氨酸抗体突变的dar值
注：*滴度低于130μg/ml的双半胱氨酸突变体以粗体加下划线本文突出显示；**tm1比野生型抗体低≥2度的突变体以粗体加下划线本文显示；***单体种类低于85％的突变体以粗体加下划线本文显示。
[0358]
使用聚乙二醇化筛选上述双半胱氨酸突变体的缀合效率和选择性。在应用聚乙二醇化程序进行筛选之前，最初研究了不同量的dtt、dhaa和peg的最佳条件(数据未显示)。使用dtt部分还原突变体，以解盖工程化双半胱氨酸残基。再氧化后，使抗体突变体与peg缀合。使用sds-page分析聚乙二醇化突变体，并用考马斯蓝染(图9和图24)。当在非还原条件下分析时，大多数突变体在聚乙二醇化后显示出低聚集。此外，存在双半胱氨酸突变体s442c+v422c，其未显示出与野生型抗体相当的缀合。重复了此突变体的聚乙二醇化，结果相似。如图10所示，双半胱氨酸突变体显示出可变的缀合效率(par)。通过用未聚乙二醇化和多聚乙二醇化条带(每个抗体重链缀合超过3个peg)(非所需种类)减去单和二聚乙二醇化条带(所需种类)来计算缀合选择性，并在突变体中发现其是可变的。在38种突变体中，有17种突变体在缀合后展示出高于3.4的par。它们还显示出对高于85％的单和二聚乙二醇化蛋白质、低于10％的多聚乙二醇化种类和低于6％的未聚乙二醇化种类的良好选择性(》
0.7)(图11和图25，热图)。此选择标准与实施例4的选择标准不同。最佳双半胱氨酸突变体包括a118c与a339c、g385c、k274c、n384c、s440c或v422c配对；a339c与g385c、k290c、n384c、s440c或v422c配对；k274c与a339c、g385c、n384c、s440c或v422c配对；以及k290c与n384c配对。实施例10-双半胱氨酸突变体与protac接头的缀合
[0359]
如对于聚乙二醇化所述，用dtt(120eq)还原三种最佳双半胱氨酸突变体，并用dhaa(30eq)重新氧化。然后，如manerio等人(acs chem biol.2020.15(6):1306-1312)所述，首先以20eq将部分还原和重新氧化的抗体突变体与bcn-peg3-马来酰亚胺接头缀合，然后以20eq与protac接头protac brd4 degrader-5-co-peg3-n3缀合。使用maldi-tof ms分析缀合物以进行完整的蛋白质分析(线性阳性模式)。通过将缀合物与非缀合突变体之间的平均质量差异除以两个接头的质量来计算dar。结果在下表6中示出。对于上述相同的双半胱氨酸突变，dar值低于par值。本研究中使用的protac接头质量低，导致dar值较低。用聚乙二醇化对这些双半胱氨酸突变的重复分析证实，较低的dar值不是工程化半胱氨酸位点活性丧失的结果。表6.双半胱氨酸抗体突变的dar值样品dara118c+a339c protac缀合物2.9
±
0.1a118c+v422c protac缀合物2.4
±
0.3k274c+s440c protac缀合物2.6
±
0.1

技术特征：

1.一种抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(c
h
)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置274，并且所述第二位置选自：339、360、384、385、422、440及其任何组合。2.一种抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(c
h
)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置339，并且所述第二位置选自：290、360、384、385、422、440及其任何组合。3.一种抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(c
h
)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置118，并且所述第二位置选自：274、339、384、385、422、440及其任何组合。4.一种抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含含有第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗体重链恒定(c
h
)结构域；其中，根据kabat的eu索引的编号，所述第一位置是位置384，并且所述第二位置选自：118、274、290、339及其任何组合。5.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述工程化反应性氨基酸残基选自半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。6.根据权利要求5所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。7.根据权利要求5所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。8.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述工程化反应性氨基酸残基经由反应性部分与配体缀合。9.根据权利要求8所述的抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段还包含将所述工程化反应性氨基酸残基与所述配体缀合的接头。10.根据权利要求9所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述接头是可切割的。11.根据权利要求9所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述接头是不可切割的。12.根据权利要求8-11中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含至少3.0的配体与抗体比(lar)。13.根据权利要求8-11中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含至少3.4的lar。14.根据权利要求8-13中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述配体是检测探针。15.根据权利要求14所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述检测探针选自：生物素、聚乙二醇(peg)、荧光标签、可视化肽及其组合。16.根据权利要求15所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述检测探针是peg。17.根据权利要求8-13中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述配体是靶向
部分。18.根据权利要求17所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述靶向部分选自：蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物及其组合。19.根据权利要求8-13中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述配体是药物。20.根据权利要求19所述的抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含至少3.0的药物与抗体比(dar)。21.根据权利要求19所述的抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段包含至少3.4的dar。22.根据权利要求19-21中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述药物是选自以下的前药：含磷酸盐的前药、含氨基酸的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药、含苯氧乙酰胺的前药、含苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶前药、5-氟尿苷前药及其任何组合。23.根据权利要求19-21中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述药物选自：抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂、麻醉剂、细胞毒性剂、放射性核素、免疫调节剂、细胞信号肽、生长因子、酶、寡核苷酸、光敏剂及其任何组合。24.根据权利要求23所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述抗癌剂选自：细胞抑制剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂、酶抑制剂、基因调节剂、蛋白酶体抑制剂、蝶啶、烯二炔、鬼臼毒素、澳瑞他汀、格尔德霉素、加利刹霉素、短杆菌肽d、类美登素、新制癌菌素、拓扑替康、紫杉烷类、细胞松弛素b、溴化乙锭、吐根碱、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登素衍生物、蒽环类衍生物、双膦酸盐衍生物、来普霉素衍生物、链黑霉素衍生物、澳瑞他汀衍生物、倍癌霉素衍生物及其任何组合。25.根据权利要求24所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述细胞抑制剂选自：菌素、dna合成抑制剂、dna嵌入剂、dna-rna转录调节剂、安沙霉素苯醌、醌类衍生物、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、亚丝醌、卡巴醌、吲哚醌e09、二氮杂环丙烷基苯醌甲基dzq、三亚乙基磷酰胺、亚化合物及其任何组合。26.根据权利要求24所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述细胞毒性核苷选自：腺苷阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤及其任何组合。27.根据权利要求24所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述微管蛋白结合剂选自：紫杉烷、诺考达唑、根霉素、海兔毒素、秋水仙碱、类秋水仙素、康普瑞汀、长春花生物碱及其任何组合。28.根据权利要求24所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述激素和激素拮抗剂选自：皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、芳香化酶抑制剂、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、芹菜素、布雷菲德菌素a、西咪替丁、二氯亚甲基-二膦酸、亮脯利特、促黄体激素释放激素、皮斐松-a、雷帕霉素、性激素结合球蛋白、毒胡萝卜素及其任何组合。29.根据权利要求24所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述抗血管生成剂选自：血管抑制素kl-3、dl-a-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢
菌素、(+)-沙利度胺及其任何组合。30.根据权利要求24所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述酶抑制剂选自：s(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯并-咪唑ι-β-d-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美司坦、福司曲星、牛奶树碱、2-亚氨基-l-咪唑烷乙酸、洛伐他汀、曲古抑菌素a、酪氨酸磷酸化抑制剂ag 34、酪氨酸磷酸化抑制剂ag 879及其任何组合。31.根据权利要求24所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述基因调节剂选自：5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化醇、4-羟基他莫昔芬、褪黑素、米非司酮、雷洛昔芬、反式-视黄醛、视黄酸、维生素a酸、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇、他莫昔芬、曲格列酮及其任何组合。32.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段还包含抗体重链可变(v
h
)结构域。33.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，所述抗原结合蛋白或其片段还包含抗体轻链可变(v
l
)结构域。34.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述抗原结合蛋白是嵌合或人源化抗体。35.根据权利要求1-33中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述抗原结合蛋白是人抗体。36.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体。37.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述抗原结合蛋白包含一个或多个含有fc区的全长抗体重链。38.根据权利要求37所述的抗原结合蛋白或其片段，其中所述fc区是人igg1 fc区。39.一种产生包含第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和第二位置处的工程化反应性氨基酸残基的抗原结合蛋白或其片段的方法，所述方法包括：(a)产生工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的第一文库，其中每个亲本抗原结合蛋白或其片段包含第一工程化反应性氨基酸残基；(b)通过将配体与所述第一文库中每个工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的所述第一工程化反应性氨基酸残基缀合，产生配体缀合的工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的第二文库；(c)通过针对高于1.7的配体与抗体比(lar)筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库，其中lar高于1.7的所述工程化亲本抗原结合蛋白或其片段具有工程化反应性氨基酸残基的位置构成工程化位置的所述第三文库；(d)产生抗原结合蛋白或其片段的第四文库，其中每个抗原结合蛋白或其片段包含在选自工程化位置的所述第三文库的第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和在选自工程化位置的所述第三文库的第二位置处的工程化反应性氨基酸残基；(e)通过将配体与所述第一位置处的工程化反应性氨基酸残基和所述第二位置处的工程化反应性氨基酸残基缀合，产生配体缀合的双工程化抗原结合蛋白或其片段的第五文库；以及(f)通过针对高于3.4的lar筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段
的第六文库。40.根据权利要求39所述的方法，所述方法还包括通过针对如下情况筛选所述第二文库来产生工程化位置的第三文库：60％或更高为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合一个配体、20％或更低为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且20％或更低为每个单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。41.根据权利要求39或40所述的方法，所述方法还包括通过针对如下情况筛选所述第五文库来产生双工程化抗原结合蛋白或其片段的第六文库：80％或更高为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合一个或两个配体、10％或更低为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段缀合多个配体，并且5％或更低为每个双工程化抗原结合蛋白或其片段未缀合配体。42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，所述方法还包括将配体与构成所述第六文库的所述双工程化抗原结合蛋白或其片段的工程化反应性氨基酸残基缀合。43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述工程化反应性氨基酸残基选自半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述工程化反应性氨基酸残基是半胱氨酸。45.根据权利要求43所述的方法，其中所述工程化反应性氨基酸残基是赖氨酸。46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述工程化反应性氨基酸残基经由反应性部分与配体缀合。47.根据权利要求46所述的方法，所述方法还包括将所述工程化反应性氨基酸残基与所述配体缀合的接头。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述接头是可切割的。49.根据权利要求47所述的方法，其中所述接头是不可切割的。50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，所述方法包含至少3.0的lar。51.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，所述方法包含至少3.4的lar。52.根据权利要求46-51中任一项所述的方法，其中所述配体是检测探针。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述检测探针选自：生物素、聚乙二醇(peg)、荧光标签、可视化肽及其组合。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述检测探针是peg。55.根据权利要求46-51中任一项所述的方法，其中所述配体是靶向部分。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述靶向部分选自：蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物及其组合。57.根据权利要求46-51中任一项所述的方法，其中所述配体是药物。58.根据权利要求57所述的方法，所述方法包含至少3.0的药物与抗体比(dar)。59.根据权利要求57所述的方法，所述方法包含至少3.4的dar。60.根据权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述药物是选自以下的前药：含磷酸盐的前药、含氨基酸的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药、含苯氧乙酰胺的前药、含苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶前药、5-氟尿苷前药及其组合。61.根据权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述药物选自：抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂、麻醉剂、细胞毒性剂、放射性核素、免疫调节剂、细胞信号肽、
生长因子、酶、寡核苷酸、光敏剂及其组合。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述抗癌剂选自：细胞抑制剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂、酶抑制剂、基因调节剂、蛋白酶体抑制剂、蝶啶、烯二炔、鬼臼毒素、澳瑞他汀、格尔德霉素、加利刹霉素、短杆菌肽d、类美登素、新制癌菌素、拓扑替康、紫杉烷类、细胞松弛素b、溴化乙锭、吐根碱、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基菌素二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、美登素衍生物、蒽环类衍生物、双膦酸盐衍生物、来普霉素衍生物、链黑霉素衍生物、澳瑞他汀衍生物、倍癌霉素衍生物及其任何组合。63.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞抑制剂选自：菌素、dna合成抑制剂、dna嵌入剂、dna-rna转录调节剂、安沙霉素苯醌、醌类衍生物、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、亚丝醌、卡巴醌、吲哚醌e09、二氮杂环丙烷基苯醌甲基dzq、三亚乙基磷酰胺、亚化合物及其任何组合。64.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞毒性核苷选自：腺苷阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤及其任何组合。65.根据权利要求62所述的方法，其中所述微管蛋白结合剂选自：紫杉烷、诺考达唑、根霉素、海兔毒素、秋水仙碱、类秋水仙素、康普瑞汀、长春花生物碱及其任何组合。66.根据权利要求62所述的方法，其中所述激素和激素拮抗剂选自：皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、芳香化酶抑制剂、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、芹菜素、布雷菲德菌素a、西咪替丁、二氯亚甲基-二膦酸、亮脯利特、促黄体激素释放激素、皮斐松-a、雷帕霉素、性激素结合球蛋白、毒胡萝卜素及其任何组合。67.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗血管生成剂选自：血管抑制素kl-3、dl-a-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素、(+)-沙利度胺及其任何组合。68.根据权利要求62所述的方法，其中所述酶抑制剂选自：s(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯并-咪唑ι-β-d-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美司坦、福司曲星、牛奶树碱、2-亚氨基-l-咪唑烷乙酸、洛伐他汀、曲古抑菌素a、酪氨酸磷酸化抑制剂ag 34、酪氨酸磷酸化抑制剂ag 879及其任何组合。69.根据权利要求62所述的方法，其中所述基因调节剂选自：5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化醇、4-羟基他莫昔芬、褪黑素、米非司酮、雷洛昔芬、反式-视黄醛、视黄酸、维生素a酸、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇、他莫昔芬、曲格列酮及其任何组合。70.根据权利要求39-69中任一项所述的方法，所述方法还包括抗体重链可变(v
h
)结构域。71.根据权利要求39-70中任一项所述的方法，所述方法还包括抗体轻链可变(v
l
)结构域。72.根据权利要求39-71中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是嵌合或人源化抗体。73.根据权利要求39-71中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是人抗体。
74.根据权利要求39-73中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体。75.根据权利要求39-74中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白包含一个或多个含有fc区的全长抗体重链。76.根据权利要求75所述的方法，其中所述fc区是人igg1 fc区。77.根据权利要求39-76中任一项所述的方法，其中针对与未工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的热稳定性相当的热稳定性来筛选单工程化亲本抗原结合蛋白或其片段的所述第一文库。78.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段的药物组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。79.一种受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-77中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段或根据权利要求78所述的药物组合物。80.一种分离的核酸分子，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其片段。81.一种表达载体，其包含根据权利要求80所述的核酸分子。82.一种宿主细胞，其包含根据权利要求81所述的表达载体。

技术总结

提供了工程化抗体，其是稳定的并且可以以高于3的配体/药物与抗体比与配体或药物缀合，从而使得这些缀合物适用于多种适应症。还提供了产生这些工程化抗体的方法。在第一实施方案中，所述抗体包括根据Kabat的EU索引编号位于274位置的第一工程反应氨基酸残基和位于339、360、384、385、422和/或440位置的第二工程反应氨基酸残基。在第二实施方案中，所述抗体包括根据Kabat的EU指数编号位于339位置的第一工程化反应性氨基酸残基和位于290、360、384、385,422和/或440位置的第二工程化反应性氨基酸残基。在第三实施方案中，所述抗体包括根据Kabat的EU指数编号位于118位的第一工程化反应性氨基酸残基，以及位于274、339、384、385、422和/或440位的第二工程化反应性氨基酸残基。在第四实施方案中，该抗体包括根据Kabat的EU索引编号位于384位的第一工程化反应性氨基酸残基，以及位于118、274、290和/或339位的第二工程化反应性氨基酸残基。在优选实施方案中，工程反应氨基酸残基为半胱氨酸。工程反应氨基酸残基为半胱氨酸。工程反应氨基酸残基为半胱氨酸。