(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011147863.3
(22)申请日 2020.10.23
(71)申请人 杭州联科生物技术股份有限公司
地址 310000 浙江省杭州市拱墅区祥茂路
36号B楼3楼A、B、C区
(72)发明人 周志鹏
(74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限
公司 31253
代理人 周琼
(51)Int.Cl.
G01N 33/53(2006.01)
(54)发明名称
方法
(57)摘要
本发明公开了一种室温稳定的单组分TMB显
液，包括以下组分：聚乙烯醇0.001g/L ‑20g/L，
阿拉伯糖0.16g/L ‑30g/L，柠檬酸1mM ‑100mM，乙
二胺四乙酸二钠1mM ‑20mM，30％过氧化氢水溶液
1mM ‑10mM，TMB 1mM ‑3mM，DMSO 20ml/L ‑30ml/L，
Proclin300 0.04％，磷酸氢二钠1mM ‑25mM，超纯
水定容至1L。所述单组分TMB显液采用柠檬酸
和磷酸氢二钠缓冲液，且缓冲液的pH值为3.1‑
3.6。所述聚乙烯醇为1788低粘度型聚乙烯醇，且
聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88％。一种
室温稳定的单组分TMB显液的制备方法，包括
以下步骤：步骤一：试剂母液配制：1.1：50g/L低 粘度聚乙烯醇1788配制：准确称取5g 1788低粘
65℃恒温水浴锅中，通过玻璃棒持续搅拌使颗粒
分散均匀，溶解后继续保温2小时，超纯水定容至
45μm滤膜过滤。权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 112415185 A 2021.02.26
C N 112415185
A
1.一种室温稳定的单组分TMB显液，其特征在于，包括以下组分：聚乙烯醇0.001g/L -20g/L，阿拉伯糖0.16g/L -30g/L，柠檬酸1mM -100mM，乙二胺四乙酸二钠1mM -20mM，30％过氧化氢水溶液1mM -10mM，TMB 1mM -3mM，DMSO20ml/L -30ml/L，Proclin3000.04％，磷酸氢二钠1mM -25mM，超纯水定容至1L。
2.根据权利要求1所述一种室温稳定的单组分TMB显液，其特征在于，所述单组分TMB 显液采用柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液，且缓冲液的pH值为
3.1-3.6。
3.根据权利要求1所述一种室温稳定的单组分TMB显液，其特征在于，所述聚乙烯醇为1788低粘度型聚乙烯醇，且聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种室温稳定的单组分TMB显液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：试剂母液配制：
1.1：50g/L聚乙烯醇配制：准确称取5g 1788低粘度型聚乙烯醇于烧杯中，加入适量超纯水，置于65℃恒温水浴锅中，通过玻璃棒持续搅拌使颗粒分散均匀，溶解后继续保温2小时，超纯水定容至100ml，使用0.45μm滤膜过滤，以除去可能存在的极微小未溶解颗粒；
1.2：TMB母液配制：准确称取TMB粉末于离心管中，加入适量的DMSO，涡旋振荡使其充分溶解，并在避光条件下待用；
1.3：其他试剂分别按照配方所用浓度要求配制；
步骤二：TMB体系配制：
2.1：首先在烧杯中加入适量超纯水，加入1788低粘度型聚乙烯醇母液，接着在磁力搅拌器上搅拌均匀，再依次加入阿拉伯糖、柠檬酸以及乙二胺四乙酸二钠，搅拌混匀；
2.2：然后，加入30％过氧化氢水溶液并搅拌均匀；
2.3：随后，将烧杯用锡箔纸包裹住，加入TMB母液并搅拌均匀；
2.4：接着，加入Proclin300并搅拌混匀，用磷酸二氢钠溶液调整体系pH值为
3.1-3.6，超纯水定容至1L；
2.5：最后，使用0.22μm尼龙滤膜过滤，获得均一溶液，保存在棕塑料瓶中，密封避光2-8℃存储。
5.根据权利要求4所述一种室温稳定的单组分TMB显液及其配制方法，其特征在于，所述TMB显液配制过程采用配制母液的方式配制各个组分，且阿拉伯糖除外，再按次序混合。
6.根据权利要求1所述一种室温稳定的单组分TMB显液及其配制方法，其特征在于，所述TMB显液配制过程所使用的烧杯、玻璃棒以及超纯水均经过高温高压灭菌处理。
7.根据权利要求1所述一种室温稳定的单组分TMB显液及其配制方法，其特征在于，所述TMB体系配制的前一个组分混匀后再添加后一个。
8.根据权利要求1所述一种室温稳定的单组分TMB显液及其配制方法，其特征在于，所述尼龙滤膜为有机溶剂耐受型。
权 利 要 求 书1/1页CN 112415185 A
一种室温稳定的单组分TMB显液及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及TMB显液技术领域，尤其涉及一种室温稳定的单组分TMB显液及其制备方法。
背景技术
[0002]在酶联免疫吸附测定试验(ELISA)中，辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化物分解，释放出氧气，将显液底物氧化，溶液变蓝。加入强酸后终止反应，蓝溶液变黄，在450nm 处有最大吸收峰，通过测量该吸光度值，结合标准曲线显情况，便可定量计算出被检测物的含量。
[0003]常用的显液底物有邻苯二胺(OPD)，2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)及3,3',5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)，研究表明，OPD有潜在的致癌性，而ABTS在显灵敏度上表现不佳，而TMB作为一种新型安全的原试剂，以显高效、无毒、不致癌及稳定性好等特点，成为ELISA检测的主流显剂。
[0004]由于TMB易被空气环境中氧气及溶液中过氧化物氧化，所以TMB显液的生产受到一定限制；当前市售的EILSA试剂盒所采用的TMB显液大多数为双组分，分为A液和B液，这最大限度的减少了TMB与过氧化物的接触，保证了显液的稳定性，但该显液使用时需先预混合，给操作造成不便，同时混
合液使用后丢弃，造成一定程度的浪费；市售的ELISA试剂盒也有采用单组分TMB显液的，但现有单组分TMB显液存在存储时间短(冷藏于4℃)、显背景高等问题；在ELISA实际操作中，用户容易忘记将使用后的TMB重新放回4℃存储，导致TMB显液在室温存储过程中逐步失效。
[0005]综上所述，需要一种室温稳定的单组分TMB显液及其制备方法来解决现有技术中所存在的不足之处。
发明内容
[0006]针对现有技术的不足，本发明提供了一种室温稳定的单组分TMB显液及其制备方法，旨在解决上述问题。
[0007]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种室温稳定的单组分TMB显液，包括以下组分：聚乙烯醇0.001g/L-20g/L，阿拉伯糖0.16g/L-30g/L，柠檬酸1mM-100mM，乙二胺四乙酸二钠1mM-20mM，30％过氧化氢水溶液1mM-10mM，TMB 1mM-3mM，DMSO 20ml/L-30ml/L，Proclin3000.04％，磷酸氢二钠1mM-25mM，超纯水定容至1L。
[0008]进一步的，所述单组分TMB显液采用柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液，且缓冲液的pH 值为3.1-3.6。
[0009]进一步的，所述聚乙烯醇为1788低粘度型聚乙烯醇，且聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88％。
[0010]一种室温稳定的单组分TMB显液的配制方法，包括以下步骤：
[0011]步骤一：试剂母液配制：
[0012] 1.1：50g/L聚乙烯醇配制：准确称取5g聚乙烯醇于烧杯中，加入适量超纯水，置于65℃恒温水浴锅中，通过玻璃棒持续搅拌使颗粒分散均匀，溶解后继续保温2小时，超纯水定容至100ml，使用0.45μm滤膜过滤；
[0013] 1.2：TMB母液配制：准确称取TMB粉末于离心管中，加入适量的DMSO，涡旋振荡使其充分溶解，并在避光条件下待用；
[0014] 1.3：其他试剂分别按照配方所用浓度要求配制；
[0015]步骤二：TMB体系配制：
[0016] 2.1：首先在烧杯中加入适量超纯水，加入1788低粘度型聚乙烯醇母液，接着在磁力搅拌器上搅拌均匀，再依次加入阿拉伯糖、柠檬酸及乙二胺四乙酸二钠，搅拌混匀；[0017] 2.2：然后，加入30％过氧化氢水溶液并搅拌均匀；
[0018] 2.3：随后，将烧杯用锡箔纸包裹住，加入TMB母液并搅拌均匀；
[0019] 2.4：接着，加入Proclin300并搅拌混匀，用磷酸二氢钠溶液调整体系pH值为3.1-3.6，超纯水定容至1L；
[0020] 2.5：最后，使用0.22μm尼龙滤膜过滤，获得均一溶液，保存在棕塑料瓶中，密封避光2-8℃存储。
[0021]进一步的，所述TMB显液配制过程采用配制母液的方式配制各个组分，且阿拉伯糖除外，再按次序混合。
[0022]进一步的，所述TMB显液配制过程所使用的烧杯、玻璃棒以及超纯水均经过高温高压灭菌处理。
[0023]进一步的，所述TMB体系配制的前一个组分混匀后再添加后一个。
[0024]进一步的，所述尼龙滤膜为有机溶剂耐受型。
[0025]本发明的有益效果：
[0026]1、本发明中，通过单组分TMB显液，在室温下可稳定存储六个月，解决用户因存储失误造成显液失效的问题，并且，阿拉伯糖为一种五碳醛糖，具有还原性，可对体系中TMB进行保护，抑制氧化作用的发生，阿拉伯糖为白结晶性粉末，无气味，对热和酸有较高的稳定性，为本发明单组分TMB显液的室温存储稳定性提供了基础；
[0027]2、本发明中，通过采用的Proclin300为广谱液体防腐剂，可有效抑制细菌及真菌等微生物的生长，为显液的室温存储稳定性提供了基础，同时，也对TMB显液在反复使用过程中带入的微生物进行抑制，提高显液的开瓶稳定性；并且，采用配制母液的方式配制各个组分，再按次序混合，有效防止由于试剂加入过程中造成pH较大范围的波动，从而对体系配制造成的不利影响。
[0028]3、本发明中，通过制备的TMB显液为单组分液，不需要进行传统A液、B液的混合，为用户的操作提供了便利，不会再出现容易忘记将使用后的TMB重新放回4℃存储而导致TMB显液在室温存储过程中逐步失效的问题，使得本发明整体上具有突出性的进步。
附图说明
[0029]图1为TMB显液在室温避光存储6个月显活性趋势图。
具体实施方式
[0030]实施例1：
[0031]一种室温稳定的单组分TMB显液，包括以下组分：聚乙烯醇0.2g/L，阿拉伯糖1.6g/L，柠檬酸10mM，乙二胺四乙酸二钠2mM，30％过氧化氢水溶液4mM，TMB 2.4mM，DMSO 24ml/L，Proclin3000.04％，磷酸氢二钠2.5mM，超纯水定容至1L。
[0032]进一步的，单组分TMB显液采用柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液，且缓冲液的pH值为3.3。
[0033]进一步的，聚乙烯醇为1788低粘度型聚乙烯醇，且聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88％。
[0034]一种室温稳定的单组分TMB显液的制备方法，包括以下步骤：
[0035]步骤一：试剂母液配制：
[0036] 1.1：50g/L聚乙烯醇配制：准确称取5g 1788低粘度型聚乙烯醇于烧杯中，加入适量超纯水，置于65℃恒温水浴锅中，通过玻璃棒持续搅拌使颗粒分散均匀，溶解后继续保温2小时，超纯水定容至100ml，使用0.45μm滤膜过滤；
[0037] 1.2：TMB母液配制：准确称取TMB粉末于离心管中，加入适量的DMSO，涡旋振荡使其充分溶解，并在避光条件下待用；
[0038] 1.3：其他试剂分别按照配方所用浓度要求配制；
[0039]步骤二：TMB体系配制：
[0040] 2.1：首先在烧杯中加入适量超纯水，加入1788低粘度型聚乙烯醇母液，接着在磁力搅拌器上搅拌均匀，再依次加入阿拉伯糖、柠檬酸及乙二胺四乙酸二钠，搅拌混匀；[0041] 2.2：然后，加入30％过氧化氢水溶液并搅拌均匀；
[0042] 2.3：随后，将烧杯用锡箔纸包裹住，加入TMB母液并搅拌均匀；
[0043] 2.4：接着，加入Proclin300并搅拌混匀，用磷酸二氢钠溶液调整体系pH值为3.3，超纯水定容至1L；
[0044] 2.5：最后，使用0.22μm尼龙滤膜过滤，获得均一溶液，保存在棕塑料瓶中，密封避光2-8℃存储。
[0045]进一步的，TMB显液配制过程采用配制母液的方式配制各个组分，且阿拉伯糖除外，再按次序混合。
[0046]进一步的，TMB显液配制过程所使用的烧杯、玻璃棒以及超纯水均经过高温高压灭菌处理。
[0047]进一步的，TMB体系配制的前一个组分混匀后再添加后一个。
[0048]进一步的，尼龙滤膜为有机溶剂耐受型。
[0049]实施例2：
[0050]将实施例1中所述的单组分TMB显底物置于(18℃-25℃)进行显活性及本底实时测试，分别测试0个月、0.5个月、1个月、2个月、4个月和6个月，具体实施方法如下：[0051]以链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)(5μg/ml)稀释800倍作为最高浓度S1，使用超纯水按四倍比例稀释的方式进行稀释，得到S2浓度与S3浓度；按50μl/孔加入到96孔酶标板一列中，使用超纯水作为阴性对照，各孔分别加入50μl TMB显液，振荡孵育5-10分钟，加入100μl 0.2M硫酸进行终止；使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收
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