(10)申请公布号 CN 101864413 A
(43)申请公布日 2010.10.20C N 101864413 A
*CN101864413A*
(21)申请号 201010184510.0
(22)申请日 2010.05.27
C12N 15/10(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
(71)申请人东北农业大学
地址150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材
街59号
(72)发明人朱延明 柏锡 李勇 王希 纪巍
才华
(74)专利代理机构哈尔滨市松花江专利商标事
务所 23109
代理人何强
(54)发明名称
(57)摘要
5’-RACE 接头序列添加方法及接头序列和5’
端未知基因完整编码序列的扩增方法，它涉及一
种接头序列添加方法及接头序列和基因完整编码
序列的扩增方法。它解决现有接头序列添加方法
存在的对mRNA 5’末端信息的完整性没有选择性
及模板复杂度高等缺陷。5’
-RACE 接头序列添加：一、根据目的基因与目的物种设计特异性逆转录 引物和接头序列；二、逆转录添加接头序列。接
头序列如SEQ ID NO ：10所示。5’端未知基因完
整编码序列扩增：一、设计引物；二、逆转录并添
加接头；三、巢式PCR 扩增；四、测序，分析。本发
明5’-RACE 接头序列添加方法具有对mRNA 5’末
端信息的完整性有选择性及基因克隆效率高等优
点。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 4 页附图 4 页
权 利 要 求 书
CN 101864413 A1/1页
1.5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于5’-RACE接头序列按以下步骤添加：
一、根据目的基因设计目的基因特异性逆转录引物，根据目的基因所在物种基因组特征设计接头序列，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；
二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移酶活性的逆转录酶进行
逆转录，实现了5’-RACE接头序列添加。
2.根据权利要求1所述的5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于步骤一所设计的目的基因特异性逆转录引物与mRNA的结合位点与该目的基因cDNA3’端接近。
3.根据权利要求1所述的5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于步骤一所设计的接头序列的3’末端设计有3个、4个、5个、6个、7个或8个连续的鸟嘌呤。
4.接头序列，适用于野生大豆(Glycine soja)的5’-RACE接头序列，其特征在于该5’-RACE 接头序列为5’-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACGGGCACATTACGGCTCGGGG-3’。
5.5’端未知基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于5’端未知基因完整编码序列按以下步骤进行扩增：
一、根据目的基因及目的物种设计目的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性巢式PCR引物以及接头序列，并根据接头序列设计巢式锚定引物，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；
二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移酶活性的逆转录酶进行逆转录，获得3’端添加了接头序列的单链cDNA片段；
三、以3’端添加了接头的单链cDNA片段为模板，用目的基因特异性巢式PCR引物和巢式锚定引物进行巢式PCR扩增；
四、对步骤三获得的巢式PCR扩增片段进行测序，再利用软件分析，获得目的基因3’末端至5’末端的序列，验证后即得到5’端未知目的基因的完整编码序列；其中步骤一所设计的巢式锚定引物在目的基因所在的物种基因组或cDNA中无可见非特异扩增产物。
6.根据权利要求5所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的目的基因特异性的巢式PCR引物与cDNA的结合位点与该目的基因cDNA3’端接近。
7.根据权利要求5所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的接头序列长度大于40bp。
8.根据权利要求5、6或7所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的巢式锚定引物为2～10条；步骤一所设计的目的基因特异性巢式PCR引物为2～4条。
9.根据权利要求8所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的目的基因特异性巢式PCR引物之间的Tm值相差小于1℃。
10.根据权利要求5、6、7或9所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤四中验证采用以下步骤：将步骤三巢式PCR扩增片段的测序结果与目的基因中已知序列进行拼接，然后将拼接得到的序列进行比对和完整性分析，再在拼接所得序列两端设计引物，通过PCR确认拼接结果。
5’-RACE接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完
整编码序列的扩增方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种接头序列添加方法及接头序列和基因完整编码序列的扩增方法。
背景技术
[0002] 若要克隆编码区仅3’端一侧的序列已知的基因，需要先获得5’端一侧的未知序列，进而获得完整的编码序列。如今，RACE技术是根据基因已知的部分序列扩增未知片段的最佳方法。RACE技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)概括地说就是通过逆转录和PCR的有机结合，扩增基因未知片段的技术。利用基因编码区3’端的已知序列，获得5’端未知序列的技术称为5’-RACE，是如今扩增5’端未知基因完整编码序列的最常用技术。
[0003] 5’-RACE基本原理：首先获得包含目的基因mRNA的RNA样品，并利用基因特异的引物进行逆转录，获得目的基因相应的cDNA；在cDNA的3’末端(对应mRNA序列5’末端)加上特定的序列，通常将这段添加在cDNA上的特定序列称为接头(adaptor)，同时合成与adaptor序列相匹配的引物，称为锚定引物；然后利用基因已知序列设计基因特异性引物，与锚定引物配对进行PCR扩增，得到未知部分的片段；再
将扩增得到的片段测序，即可获得目的基因未知部分的序列。
[0004] 目前按接头序列的添加方法可分为3大类：末端转移酶法(terminaldeoxynucleotidyl transferase method，TdT method)、接头连接法(adaptor ligation)和寡核苷酸帽法(oligo caping method)。近年出现了一些可同时扩增编码区3’一侧与5’一侧未知片段的技术，并推出了相应的试剂盒，如GeneRacer(Invitrogen公司)、SMART RACE(Takara-BD公司)等。这些技术的基本原理是用oligo(dT)起始逆转录，在完整mRNA逆转录所得的完整cDNA产物的3’端及5’端分别添加3’-adaptor及5’-adaptor，使所有完整的cDNA在两端都带有adaptor，成为包含所有基因信息的通用模板。再利用目的基因的特异引物与某一端的锚定引物搭配，则可利用同一份通用模板获得不同基因、不同末端的未知序列。
[0005] 采用末端转移酶法和接头连接法存在一个共同的问题，就是会在逆转录所得的所有cDNA的3’末端都加上adaptor，无法区分5’端完整与不完整的mRNA，也无法区分逆转录进行得完全与不完全的cDNA，因此不能保证mRNA5’末端信息的完整。这样，若要获得基因编码区完整5’末端的信息，往往需要进行不只一次的“逆转录-添加adaptor-PCR-测序”过程，每次需根据上一次测序所得的序列设计新的逆转录引物，也就是需要进行多轮RACE。此外，这两种方法都需要先将逆转录产物进行纯化，才能添加adaptor，而cDNA在纯化过程中会发生损失，因此需要制备较大量的cDNA。
[0006] 虽然寡核苷酸帽法可以选择性地对5’端完整的mRNA进行扩增，解决了末端转移酶法和接头连接
法对mRNA完整性无选择性的问题。但寡核苷酸帽法存在需要对RNA进行多步操作，在各步的酶反应之间又都需要对RNA进行纯化，而且RNA很容易被降解，因此很
容易损失掉大量的RNA，从而降低了此后RACE工作的效率，对于丰度较低的mRNA，甚至很难得到扩增产物。
[0007] 利用通用模板作为起始材料，虽然可高通量地进行基因克隆，但是若仅需要通过5’-RACE扩增少数5’端未知基因编码区的未知片段，通用模板并不适合。原因有如下2点：[0008] 首先，通用模板的复杂性很高。通用模板对基因没有选择性，所有基因的完整cDNA 均添加有adaptor，理论上包含所有基因对应的cDNA。在复杂的模板中，目的基因cDNA含量相对较低，对于表达丰度较低的基因，克隆难度则更大。而且，模板越复杂，PCR反应中越容易发生非特异扩增，影响目的片段在PCR反应中的扩增效率，非特异的扩增产物还会干扰目的条带的选择。
[0009] 其次，通用模板制备过程中，信息损失的可能性较大。这是因为，通用模板对RNA 以及逆转录反应的完整性要求都很高，不完整mRNA的逆转录产物以及逆转录反应中链延伸不完全的cDNA都不会被添加adaptor；而逆转录反应的链延伸过程又很容易发生未成熟终止，若待延伸的mRNA模板较长，或具有较复杂的二级结构，则未成熟终止的可能性较大。制备通用模板时逆转录反应需要从mRNA的3’末端一直延伸到5’末端，对于编码区较长的基因，很难得到基因的完整cDNA。这些都会增加5’-RACE的工作量，并可能影响5’-RACE 结果。
[0010] 此外，现有的所有5’-RACE方法中引物的设计和使用都受到强烈的限制。末端转移酶法只能添加一串相同的核苷酸，通用模板只能使用同一套adaptor，接头连接法和寡核苷酸帽法中的adaptor虽然可以自行设计，但由于链的长度影响连接反应的效率，因此也只能添加长度有限的adaptor(一般为15～30bp)。这样就无法使用最适合于目的物种、目的基因的adaptor和相应的锚定引物，甚至模板中的部分基因序列中很可能含有锚定引物的非特异性结合位点。在PCR扩增时需要将锚定引物与基因特异引物搭配，研究人员就必须根据锚定引物的特点设计基因特异引物，这样就会缩小基因特异引物的选择范围，最适合于目的基因的引物往往无法直接用于扩增。引物设计的灵活性有限，就使得研究人员需要花费较大工作量探讨PCR条件，影响基因克隆效率。
发明内容
[0011] 本发明的目的是为了解决现有接头序列添加方法存在的对mRNA 5’末端信息的完整性没有选择性；对目的基因针对性差；逆转录反应不充分；接头序列设计不灵活；成本高，操作不简便；以及现有5’端未知基因完整编码序列的扩增方法中接头序列及锚定引物的设计不灵活；成本高，操作不简便；未知片段的克隆效率低等缺陷；而提供了一种5’-RACE接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完整编码序列的扩增方法。[0012] 本发明5’-RACE接头序列按以下步骤添加：
[0013] 一、根据目的基因设计目的基因特异性逆转录引物，根据目的基因所在物种基因组特征设计接头序列，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；
[0014] 二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移酶活性的逆转录酶进行逆转录，实现了5’-RACE接头序列添加。
[0015] 5’-RACE接头序列添加方法原理如图1所示，当逆转录的链延伸反应进行到mRNA 的5’末端的帽子结构时会在所合成的cDNA末端连续加上若干个dC(一般为2～4个胞嘧
啶)；由于在逆转录体系中事先加入3’端带有oligo(dG)的接头序列作为模板转换引物，所以当逆转录即将完成时，接头序列3’端的oligo(dG)会与cDNA末端的dC配对，有末端转移酶活性的逆转录酶则发生模板转换，以接头序列为模板继续进行链延伸，从而得到3’端添加了接头的单链cDNA片段，实现了5’-RACE接头序列添加。
[0016] 本发明5’-RACE接头序列添加方法具有以下优点：
[0017] 1.对mRNA 5’末端信息的完整性有选择性。排除了信息不完整的片段对克隆过程的干扰。
[0018] 2、使用目的基因特异性逆转录引物起始逆转录，对目的基因有针对性。起始模板复杂度低，排除了无关基因的干扰。
[0019] 3、逆转录反应充分。有效地避免率逆转录反应链延伸时发生未成熟终止。[0020] 4、adaptor的设计灵活。能够设计较长的接头序列，可设计长度大于40bp的接头序列，以增强adaptor的特异性。
[0021] 5.成本低，操作简便。本发明方法操作步骤少，后续的PCR特异性和扩增效率高，且使用实验室常用试剂和设备即可完成。
[0022] 6、本发明方法由逆转录酶自动完成接头序列的添加。
[0023] 本发明接头序列为适用于野生大豆(Glycine soja)的5’-RACE接头序列，该5’-RACE接头序列为5’-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACGGGCACATTACGGCTCGGGG-3’。[0024] 本发明5’端未知基因完整编码序列按以下步骤进行扩增：
[0025] 一、根据目的基因及目的物种设计目的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性巢式PCR引物以及接头序列，并根据接头序列设计巢式锚定引物，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；
[0026] 二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移酶活性的逆转录酶进行逆转录，获得3’端添加了接头序列的单链cDNA片段；
[0027] 三、以3’端添加了接头的单链cDNA片段为模板，用目的基因特异性巢式PCR引物和巢式锚定引物进行巢式PCR扩增；
[0028] 四、对步骤三获得的巢式PCR扩增片段进行测序，再利用软件分析，获得目的基因3’末端至5’末端的序列，验证后即得到5’端未知目的基因的完整编码序列；其中步骤一所设计的巢式锚定引物在目的
基因所在的物种基因组或cDNA中无可见非特异扩增产物。[0029] 本发明5’端未知基因完整编码序列的扩增方法具有以下优点：
[0030] 1、对mRNA 5’末端信息的完整性有选择性。只有充分延伸到mRNA 5’端的cDNA 才能被添加接头序列并在PCR反应中得到扩增，排除了信息不完整的片段对克隆过程的干扰，只通过一轮RACE便可获得包含目的基因编码区5’末端完整信息的序列。
[0031] 2、使用目的基因特异性逆转录引物起始逆转录，对目的基因有针对性。其它基因的mRNA理论上不会发生逆转录反应，因此逆转录产物中以目的基因对应的cDNA为主，起始模板复杂度低，可排除无关基因的干扰，提高RACE中PCR反应的特异性和效率。
[0032] 3、逆转录反应充分。目的基因特异性逆转录引物靠近mRNA的5’端，使逆转录反应的链延伸长度缩短，降低了逆转录反应链延伸时发生未成熟终止的风险，有利于使逆转录反应充分延伸至mRNA 5’末端；而且在逆转录反应中，由于其它基因的mRNA不会发生逆转录反应，因此还可保证目的基因mRNA的逆转录效率，使目的基因的完整mRNA都能被完整
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