(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010687713.5
(22)申请日 2020.07.16
(71)申请人 君维安（武汉）生命科技有限公司
地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新大道666号生物创新园C4栋
505室
(72)发明人 王敏 石长萍
(74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限
公司 32224
代理人 徐瑛
(51)Int.Cl.
C12N 1/38(2006.01)
C12N 1/20(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法(57)摘要本发明公开了基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，即向BHI培养基中加入硝酸盐或TMAO溶液，将嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akk菌)接种于上述培养基中，并且在混合气体配比为80％～95％N 2、5％～20％H 2和0～3％O 2的培养条件下培养。本发明采用硝酸盐或TMAO溶液替代传统的气态CO 2作为Akk菌的电子受体，避免了CO 2浓度波动对Akk菌生长的影响；同时硝酸盐或TMAO溶液还可增强Akk菌对氧气的耐受性，不仅避免了氧气对Akk菌的抑制作用，而且在一定氧气浓度范围内还可促进Akk菌的生长，从而得到了一种成本更低、可控度更高，培养条件更为宽松，利于大规模培养的Akk菌培养方法，为Akk 菌的培养提供了新思路。权利要求书1页 说明书7页CN 111763653 A 2020.10.13
C N 111763653
A
1.基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，向培养基中加入硝酸盐或TMAO溶液，且在混合气体配比为80～95％N 2、5～20％H 2和0～3％O 2的培养条件下培养。
2.根据权利要求1所述的基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，培养基中所述硝酸盐或TMAO溶液的浓度为1～10mM。
3.根据权利要求2所述的基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，培养基中所述硝酸盐或TMAO溶液的浓度为3～8mM。
4.根据权利要求2所述的基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，培养基中所述硝酸盐溶液的浓度为5mM，或培养基中所述TMAO溶液的浓度为8mM。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，所述混合气体的配比为90％N 2和10％H 2。
7.根据权利要求1所述的基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，所述混合气体的配比为87～90％N 2、8～12％H 2和1～2％O 2。
8.根据权利要求7所述的基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，所述混合气体的配比为88.5％N 2、10％H 2和1.5％O 2。
9.根据权利要求1所述的基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，所述培养基为BHI培养基，所述BHI培养基的配方为：Brain -heart Infusion Extract 37g/L、Yeast Exctact 5g/L、
Mucin 2.5g/L、刃天青1mg/L、L -半胱氨酸盐酸盐100mg/L。
权 利 要 求 书1/1页CN 111763653 A
基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法
技术领域
[0001]本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法。
背景技术
[0002]嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila，以下简称Akk菌)隶属疣微菌门，是一种革兰氏阴性菌。Akk菌广泛分布于人类和动物的肠道黏液层中，是肠道高丰度共生菌之一。Akk菌是人体肠道中一种可降解黏蛋白的细菌，能够以黏蛋白作为唯一碳源、氮源和能量来源，并在酵解过程中产生乙酸盐、乙醇、丙酸盐和硫酸盐。经研究发现，Akk菌与多种系统疾病如肥胖、糖尿病、免疫调节、酒精性脂肪肝和冠状动脉硬化等均有一定关联，其含量是衡量肠道微生态平衡的重要标志物微生物之一。作为新型候选益生菌，Akk菌的培养显得尤为重要。
[0003]Derrien M等人(Derrien M.Akkermansia v.a human intestinal mucin-degrading bacterium[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2004, 54.)公开了在嗜黏蛋白阿克曼氏菌可在含有猪胃粘蛋白作为唯一碳源和氮源的基础厌氧培养基上生长，且其培养气氛为N2/CO2(80：20，v/v)，中国专利CN110551658A公开了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的低氧培养方法，是在70～94％N2、1～5％O2、5～25％CO2的气体环境下对Akk菌进行培养。即目前普遍认为Akk菌的培养过程中以CO2作为电子受体，然而使用CO2一方面成本较高，另一方面由于在培养过程中的Akk菌自身会产生少量的CO2，将导致培养过程中气体环境产生一定的波动，影响Akk菌的正常生长。
发明内容
[0004]本发明的目的是针对现有技术存在的问题，在培养基中加入硝酸盐或TMAO溶液以替代传统的CO2作为Akk菌的电子受体，得到一种成本更低、且可控度更强的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0006]基于新型电子受体的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，向培养基中加入硝酸盐或TMAO溶液，且在混合气体配比为80～95％N2、5～20％H2和0～3％O2的培养条件下培养。[0007]为避免在Akk菌的培养过程中，CO2浓度波动对Akk菌生长的影响，本发明突破了本领域研究人员的常规思维，采用硝酸盐或TMAO(氧化三甲胺)溶液替代传统使用的CO2作为Akk菌的电子受体，可使Akk菌在无CO2存在的条件
下正常生长，不仅生产成本更低，并且相比于气态的电子受体，液态溶液浓度的可控性更强。同时硝酸盐或TMAO溶液还可增强Akk菌对氧气的耐受性，使Akk菌在一定浓度氧气存在的条件仍可正常生长，并且在有适量浓度氧气的条件下，还可适当促进Akk菌的生长，相比于传统的绝对厌氧环境，培养条件更为宽松。[0008]优选地，培养基中所述硝酸盐或TMAO的浓度为1～10mM。硝酸盐或TMAO作为Akk菌的无氧呼吸中的电子受体，其浓度过低会影响Akk菌的正常生理代谢，而浓度过高会影响细
胞渗透压和酶活性，从而影响Akk菌的正常生长。因此，优选最适宜Akk菌生长的硝酸盐或TMAO浓度为1～10mM。
[0009]优选地，培养基中所述硝酸盐或TMAO的浓度为3～8mM。
[0010]优选地，培养基中所述硝酸盐溶液的浓度为5mM，或培养基中所述TMAO溶液的浓度为8mM。
[0011]优选地，所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙中的一种或多种。[0012]优选地，所述混合气体的配比为90％N2和10％H2。即在培养基中加入硝酸盐或TMAO 溶液后，不需再另外通入CO2，即可保证Akk菌的正常生长。
[0013]优选地，所述混合气体的配比为87～90％N2、8～12％H2和1～2％O2。硝酸盐或TMAO 溶液增强了Akk菌对氧气的耐受性，并且氧气浓度为1～2％时，还可在一定程度上促进Akk 菌的生长。
[0014]优选地，所述混合气体的配比为88.5％N2、10％H2和1.5％O2。
[0015]优选地，其特征在于，所述培养基为BHI培养基，所述BHI培养基的配方为：Brain-heart Infusion Extract 37g/L、Yeast Exctact 5g/L、Mucin 2.5g/L、刃天青1mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐100mg/L。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0017](1)采用硝酸盐或TMAO溶液替代传统的CO2作为Akk菌的电子受体，并创造性地选取了最适宜Akk菌生长的硝酸盐或TMAO溶液浓度，不仅避免了CO2浓度波动对Akk菌生长的影响，并且成本更低、可控度更高，利于大规模培养，为Akk菌培养方法提供了新思路。[0018](2)硝酸盐或TMAO溶液还可增强Akk菌对氧气的耐受性，不仅避免了氧气对Akk菌生长的抑制作用，而且在一定氧气浓度范围内还可促进Akk菌的生长，相比于传统的绝对无氧环境，培养条件更为宽松，得到了一种可大规模培养Akk菌的培养方法。
具体实施方式
[0019]下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0020]本发明实施例中采用的嗜黏蛋白阿克曼氏菌为Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835，购自中国典型培养物保藏中心。
[0021]本发明实施例中均采用BHI培养基对Akk菌进行培养，所述BHI培养基的制备方法为：
[0022]S1、向1L水中加入Brain-heart Infusion Extract(脑心浸出液肉汤)37g，Yeast Exctact(酵母提取物)5g，0.1％(W/V)刃天青1mL，混合均匀并搅拌溶解后，煮沸除氧30min，然后分装于厌氧小瓶中密封，与121℃高压蒸汽灭菌15min；
[0023]S2、在厌氧状态下，将Mucin(黏蛋白)溶于无氧PBS缓冲液中，其浓度为1％(W/V)，高压灭菌并静置过夜，然后12000rpm离心5min，取上清即得Mucin溶液；
[0024]S3、将L-半胱氨酸盐酸盐溶解于超纯水，得到10％(W/V)的L-半胱氨酸盐酸盐溶液，过滤除菌得到无菌的L-半胱氨酸盐酸盐溶液；
[0025]S4、取步骤S1得到的混合液375mL，然后向其中加入125mL步骤S2的Mucin溶液，混合均匀后再加入10mL步骤S3的L-半胱氨酸盐酸盐溶液，即得BHI培养基。
[0026]实施例1电子受体的优化与选择
[0027]实验组：取对数生长期的Akk菌按1:1000接种至所述BHI培养基中，并分装至厌氧试管3mL/管，然后分别添加浓度为5mM的如下电子受体溶液：NaNO3(硝酸盐)、TMAO(氧化三甲胺)、NaNO2(亚硝酸盐)、Na2SO3(亚硫酸盐)、Na2SO4(硫酸盐)、Na2S2O3(硫代硫酸盐)、FeCl3 (铁离子)、NaClO2(次氯酸盐)、DMSO(二甲基亚砜)、富马酸二钠(延胡索酸盐)。
[0028]空白对照组：取生长对数期的Akk菌按1:1000接种至所述BHI培养基中，并分装至厌氧试管3mL/管，不加电子受体，并加入等体积的无菌水。
[0029]将实验组和空白对照组同时在无CO2(混合气体配比为90％N2、10％H2)或有CO2(混合气体配比为80％N2、10％H2、10％CO2)的条件下培养，培养温度为37℃。然后每隔24h取一次样，通过酶标仪测定每个样品在600nm波长下的OD值(记作OD600)，同时采用平板计数法测定每毫升样品中的细菌落总数(记作CFU值)。结果如表1-2所示。其中表1为无CO2条件下，不同电子受体对Akk菌生长的影响；表2为有CO2条件下，各电子受体对Akk菌生长的影响。[0030]表1不同电子受体对Akk菌生长的影响(无CO2)
[0031]
[0032]
[0033]表2不同电子受体对Akk菌生长的影响(有CO2)
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