(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110062193.3
(22)申请日 2021.01.18
CCTCC NO：M 2020876 2020.12.09
(71)申请人 贵州省生物技术研究所（贵州省生
物技术重点实验室、贵州省马铃薯
研究所、贵州省食品加工研究所）
地址 550006 贵州省贵阳市花溪区鑫中路
金欣社区农科院生技所
(72)发明人 赵兴丽 卢声洁 张莉 周玉锋
李帅 张金峰 孟泽洪
(74)专利代理机构 成都方圆聿联专利代理事务
所(普通合伙) 51241
代理人 宋红宾
(51)Int.Cl.C12N 1/14(2006.01)A01N 63/38(2020.01)A01P 3/00(2006.01)A01P 21/00(2006.01)A01G 13/00(2006.01)A01G 17/00(2006.01)A01G 7/06(2006.01)C12R 1/885(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一株软毛木霉菌及其应用，软
毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508
抗生作用，同时该菌还能促进茶树生长以及提高
茶叶的品质，该菌株在茶病和轮斑病的防治
方面有广阔的应用前景，可作为茶病和轮斑
病的生防菌剂使用。
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图3页CN 112725193 A 2021.04.30
C N 112725193
A
1.一株软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020876。
2.权利要求1所述的软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508在提高茶叶品质上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特在于，所述品质为茶青产量或/和茶叶游离氨基酸。
4.权利要求1所述的软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508在茶树病或/和茶树轮斑病防治上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述茶树病菌为刺盘孢菌(Colletotrichum camelliae)，茶树轮斑病菌为卵圆新拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis ellipsospora)。
权 利 要 求 书1/1页CN 112725193 A
一株软毛木霉菌及其应用
技术领域
[0001]本发明属于微生物领域，具体涉及一株软毛木霉菌及其应用。
背景技术
[0002]木霉菌属真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属，广泛存在于不同环境条件下的土壤中。自19世纪中叶，人类对木霉菌已有了初步的认识，但直到上世纪60年代木霉菌的分类地位
才得以确定。大多数木霉菌可产生多种对植物病原真菌、细菌及昆虫具有拮抗作用的生物活性物质，比如细胞壁降解酶类和次级代谢产物，并能提高农作物的抗逆性，促进植物生长和提高农产品产量，因此被广泛用于生物防治、生物肥料及土壤改良剂。由于化学农药对环境的负面影响较为严重，所以对环境较为友好的生物农药木霉菌受到了广泛的关注。
[0003]国内对木霉菌生物防治方面的研究还局限于木霉菌对植物病原菌拮抗机理的初步分析，拮抗菌株的筛选，发酵条件的优化等。主要剂型为粉剂和可湿性粉剂。国内登记生产木霉菌制剂的企业虽然较少，但木霉菌制剂在市场上的销售增长较为迅速，目前为止，木霉菌生防制剂已占据了真菌杀菌剂近一半的市场份额。
[0004]国外木霉菌相关的研究与应用起步比较早，发展非常迅速，已有多种登记注册的产品，例如木霉菌T22和T39。国外对木霉菌生防作用机制的研究也较为深入，不仅在木霉菌发酵过程控制方面具有先进的经验和设备，并且对木霉菌所产生的具有生物防治活性的代谢产物的种类、化学结构及作用机理等方面也进行了较为详细的研究。特别是近几年，国外利用一些新的方法如蛋白质组学分析和基因报告系统等，研究植物、病原菌及木霉菌三方互作的关系。通过基因表达的差异分析进一步了解木霉菌生防作用的机理，从而为开发木霉菌新的生物防治技术提供理论支持。然而相关的研究在国内还未引起足够的重视。[0005]近些年，木霉菌的研究与应用得到了快速的发展。结合遗传学、分子生物学、生物化学及生态学等研究方法，木霉菌及其代谢产物在促进植物生长，增加营养物质的吸收利用率，提高农作物的产
量，以及增强对病害的防御性方面势必有更为广阔的应用前景。特别是在倡导绿农业的大背景下，木霉菌的大面积推广应用已成为构建现代和高效的生物防治病虫害体系中不可或缺的一部分。
发明内容
[0006]本发明所要解决的技术问题为：如何提供一株木霉菌属新菌株，不仅能作为生防菌使用，还能提高茶叶品质。
[0007]本发明的技术方案为：一株软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508，于2020年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020876。
[0008]本发明的软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508在提高茶叶品质上的应用。
[0009]本发明中，上述所述品质为茶叶产量、茶叶游离氨基酸。
[0010]本发明的软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508在茶树病或/和茶树轮斑病防治上的应用。
[0011]本发明中，上述所述茶树病菌为刺盘孢菌(C o l l e t o t r i c h u m camelliae)，茶树轮斑
病菌为卵圆新拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis ellipsospora)。[0012]本发明的软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508生境适应性强、生长速度快，对茶病菌刺盘孢菌(Colletotrichum camelliae)和茶轮斑病菌卵圆新拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis ellipsospora)均具有明显的生长抑制作用，平板对峙培养的抑制率分别为60.67％和65.49％；发酵液对茶菌和茶轮斑病菌也具有明显的抑制作用，发酵液浓度为10％时，对茶菌病菌和茶轮斑病菌的抑制率分别为69.30％和67.92％
[0013]本发明的软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508发酵液喷施于茶棚30d后，茶青产量增加了55.39％，同时还提高了茶叶中游离氨基酸的含量，增加率达8.09％。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0015]本发明的软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508对茶树病菌和茶轮斑病菌具有竞争作用和抗生作用，同时该菌还能促进茶树生长以及提高茶叶的品质，该菌株在茶病和轮斑病的防治方面有广阔的应用前景，可作为茶病和轮斑病的生防菌剂使用。
附图说明
[0016]图1菌株TQGL17112508对N.ellipsospora和C.camelliae的抑制效果，A‑D为N.ellipsospora；E‑H为C.camelliae；
[0017]图2菌株TQGL17112508的发酵液对N.ellipsospora和C.camelliae的抑制效果，A‑D为N.ellipsospora；E‑H为C.camelliae；
[0018]图3菌株TQGL17112508的菌落特征；
[0019]图4菌株TQGL17112508菌丝和分生孢子梗的形态特征(标尺＝20um)；
[0020]图5菌株TQGL17112508与相关种的系统发育树；
[0021]软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508，于2020年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2020876。
具体实施方式
[0022]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
[0023]实施例1
[0024]本实施例为软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508的分离、鉴定和保藏：
[0025](一)软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508的分离：
[0026]采用蛇形采样法从贵州省黔西南布依族苗族自治州兴义市天沁茶场采样法采集
茶树根际土壤。利用梯度稀释涂布分离法对土样进行木霉菌分离，每个土样称取5g放入装有45mL无菌水的锥形瓶中，150r/min振荡30min，静置30sec得到10‑1样品悬液。超净工作台中将土样悬液用无菌水依次稀释成10‑2、10‑3、10‑4 4个不同浓度的土壤悬液。用移液分别取100μL浓度为10‑3和10‑4的土壤悬液的上清液滴于虎红酸钠选择性培养基平板上，用灭菌的涂布棒涂匀，封口膜密封，28℃黑暗倒置培养，每天观察，一旦有菌落生成，立即转接到新的PDA培养基上纯化，重复转接2次，获得纯培养物，利用硫酸纸袋进行(‑20℃)低温冷冻保存。所述PDA 培养基由以下用量的原料组成：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂粉18g和蒸馏水1000mL，虎红酸钠选择性培养基为1000mL PDA培养基添加0.3g氯霉素和0.02g虎红钠盐制成。
[0027](二)软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508的鉴定：
[0028](1)形态特征：软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508培养5d后，挑起菌丝制成水玻片在显微镜下观察。菌落形态如图3所示，在PDA培养基上培养5天后，菌株TQGL17112508的菌落长满整个培养皿，菌落呈灰白，气生菌丝生长茂盛，无素和特殊气味产生，有同心轮纹。形态特征如图4所示，菌丝无透明，具隔膜，直径约为1.88‑5.31um；分生孢子梗上的瓶梗呈对称分布，球形，大小
约为2.88‑7.63um。
[0029](2)分子发育分析：软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508培养5天后，刮取菌丝不含培养基，采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株TQGL17112508的基因组DNA，基因组DNA经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测其质量后，以此为模板进行PCR扩增，使用的引物为ITS1/ITS4(5′‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3′/5′‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3′)和TEF1‑728F/TEF1‑rev(5'‑CATCGAGAAGTTCGAGAA GG‑3'/5'‑GCCATCCTTGGAGATACCAGC‑3')。
O 9.5μL，灭PCR反应体系(25μL)：2×Taq Master Mix12.5μL、DNA模板1μL、引物各1μL、ddH
2
菌超纯水对照。PCR扩增程序分别为：ITS(94℃预变性5min、94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环、72℃延伸10min)、TEF(95℃预变性5min、95℃变性1min，55℃退火90sec，72℃延伸90sec，30个循环、72℃延伸10min)。1％琼脂糖凝胶电泳电泳检测PCR产物条带亮度后，依托上海生工公司进行序列测定，并将所测rDNA‑ITS序列、TEF序列通过NCBI上的BLAST软件进行同源性比较。BioEdit对测序序列和下载自NCBI‑Gen Bank的序列进行多位点序列比对并对其进行手动校正，校正后的序列采用MEGA5.1软件将各基因序列按ITS→TEF的顺序首尾相连，输出为fast格式，再利用网站(www.sing‑/ALTER/)将其转化为phy格式，并采用RAx ML软件以菌株Trichoderma yun
nanense为外，构建软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508的最大似然树(Maximum likehood phylogenetic tree)。结果如图5，软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508和Trichoderma pubescens聚为同一分支，且具有强烈的支持强度(98％)，结合软毛木霉(Trichoderma pubescens)TQGL17112508的形态学特征，将该菌株鉴定为软毛木霉Trichoderma pubescens。
[0030]通过一代测序获得的序列：(ITS序列)536bp
[0031]TGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTAAAAGCCCCGGAACCAGG CGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAA TTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCA
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