(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610911807.X
(22)申请日 2016.10.18
(83)生物保藏信息
CGMCC NO. 12836 2016.08.15
(71)申请人 中国科学院天津工业生物技术研究
所
地址 300308 天津市东丽区空港经济区西
七道32号
(72)发明人 王敬敬 黄志勇 王欢 徐松
赵维
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务
所(普通合伙) 11350
代理人 汤东凤
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12P 17/10(2006.01)C05F 11/08(2006.01)A01N 63/00(2006.01)A01P 21/00(2006.01)C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一株假单胞菌(Pseudomonas
sp.)C3-6株，其保藏号为CGMCC NO.12836。本发
明提供的假单胞菌C3-6可显著促进黄瓜苗的生
长。盆栽实验表明，与空白对照相比，假单胞菌
C3-6可提高黄瓜苗鲜重71.53％、干重69.78％、
株高33.55％；与阳性对照枯草芽孢杆菌FH1相
比，可提高黄瓜苗鲜重2.52％、干重21.14％和株
高8.
27％。权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 106399185 A 2017.02.15
C N 106399185
A
1.一种假单胞菌，其特征在于，所述的假单胞菌的保藏号为CGMCC NO.12836。
2.权利要求1所述的假单胞菌在制备微生物肥料中的应用。
4.权利要求1所述的假单胞菌在合成吲哚乙酸中的应用。
5.权利要求1所述的假单胞菌在制备促植物生长的制剂的应用。 6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的制备为促磷元素吸收的制剂、促吲哚乙酸合成的制剂、促铁载体合成的制剂中的一种或几种。
7.一种微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂是用权利要求1所述的假单胞菌制备的。
8.一种微生物肥料，其特征在于，所述的微生物肥料是用权利要求1所述的假单胞菌制备的。
权 利 要 求 书1/1页CN 106399185 A
一株假单胞菌及其应用
技术领域
[0001]本发明属于有益菌筛选技术领域，具体涉及一株假单胞菌及其应用。
背景技术
[0002]磷元素是植物生长所需的一种主要营养元素之一，土壤中的磷主要以难溶性的磷酸盐形式存在。为了提高农产品的产量，人们长期大量施用磷肥。但磷肥在施用后很快就被固定形成无效态磷，变得不可利用，造成了作物的低吸收和磷元素在土壤中的大量积累；因此提高土壤中磷的利用率一直是农业科技工作者研究的热点课题之一。土壤中存在着一些微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的状态，这些微生物称为解磷菌。解磷菌分为两种，分别是解无机磷细菌和解有机磷细菌。解无机磷细菌的主要作用是分解无机磷化物，如磷酸钙、磷灰石等，其作用机理是借助细菌生命活动过程中所产生的酸溶解无机磷；解有机磷细菌的主要作用是分解有机磷化物，如核酸、磷脂等，其作用机理主要是借助于细菌生命活动中所产生的酶分解有机磷。目前国内外对解无机磷菌的筛选已有一些报道。然而由于解有机磷菌在应用中的促生效果不明显、促生作用不稳定等，使得解有机磷菌尚未实现大规模的应用和商业化生产。本发明拟从环境中筛选促生效果显著、促生作用稳定的高效有机磷降解菌，推动有机磷降解菌的大规模应用和商业化生产，并促进我国农业的绿、可持续发展。 发明内容
[0003]本发明的目的是提供一株假单胞菌，即一具有高效解有机磷的假单胞菌及其在促进植物生长方面的应用。
[0004]本发明首先提供一株从天津草坪根周土壤中分离的假单胞菌(Pseudomonas sp.) C3-6株，其于20
16年8月15日，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.12836。
[0005]上述的假单胞菌C3-6用于制备微生物肥料：
[0006]所述的菌株具有较好的解有机磷作用。
[0007]所述的菌株还可以用于合成吲哚乙酸。
[0008]所述的菌株还可以用于合成铁载体。
[0009]所述的菌株在制备促植物生长的制剂的应用。
[0010]所述的制剂为促磷元素吸收的制剂、促吲哚乙酸合成的制剂、促铁载体合成的制剂中的一种或几种。
[0011]所述的制剂为微生物菌剂或微生物肥料。
[0012]本发明提供的假单胞菌C3-6，是以卵黄作为唯一磷源的培养基从天津草坪根周土壤中筛选获得的，16S r DN A序列测定结果表明该菌是一种假单胞菌，分类命名为Pseudomonas sp.C3-6。
[0013]本发明提供的假单胞菌C3-6，由于其能将土壤中不溶性的有机磷磷转换为可被植
物直接吸收、利用的有效磷，因而可促进作物生长。
[0014]本发明提供的假单胞菌C3-6，还能够合成吲哚乙酸和铁载体，但是不具有解无机磷、解钾、固氮、拮抗病原菌的能力。
[0015]本发明提供的假单胞菌C3-6可显著促进黄瓜苗的生长。盆栽实验表明，与空白对照相比，假单胞菌C3-6可提高黄瓜苗鲜重71.53％、干重69.78％、株高33.55％；与阳性对照枯草芽孢杆菌FH1相比，可提高黄瓜苗鲜重2.52％、干重21.14％和株高8.27％。
附图说明
[0016]图1：假单胞菌C3-6在LB平板(A)、解有机磷平板(B)和CAS平板(C)上的生长形态。[0017]图2：假单胞菌C3-6对黄瓜苗干重、鲜重和株高的影响图。
具体实施方式
[0018]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0019]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，本领域的普通技术人员在本发明公开内容的基础上可以选择本领域其它常用的方法来替代说明书具体实施例中采用的方法。
[0020]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0021]实施例1、解有机磷菌C3-6的分离和鉴定
[0022]1、解有机磷菌C3-6的分离
[0023]解有机磷菌C3-6的分离包括取样、筛选和纯化两个步骤，具体方法如下：[0024] 1.1、取样
[0025]样品采集于天津中国科学院天津工业生物技术研究所院内的草坪根周土壤。[0026] 1.2、筛选和纯化
[0027]称取1g土壤样品，置于9ml无菌水中高速震荡制成土壤菌悬液，将梯度稀释的土壤悬液涂布在有机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH)2SO4 0.5g，MgSO4·7H20 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H20 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，CaCO3 5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.0～7.5。将培养基融化冷却至50℃后，立即加入蛋黄液(蛋黄液为0.8％无菌生理盐水与鸡蛋黄1:1配制)，每100mL的基础培养基加卵黄稀释液3～4mL作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板)上，倒置于生化培养箱中30℃培养7天。挑取平板上透明圈较明显的菌落在有机磷固体培养基上进行重复划线分离纯化，得到单一菌落。
[0028]2、解有机磷菌C3-6的鉴定
[0029]对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA提取，16S rDNA的扩增和测序。
[0030] 2.1该菌株在LB培养基上为乳白菌落，表面光滑，菌落边缘整齐。革兰氏染为阴性。结果如图1A所示。
[0031]2.2利用引物27F(5'-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3′)和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)对解有机磷菌C3-6的16S rDNA进行扩增：
[0032]PCR反应体系为25μL，具体成分如下：
[0033]
[0034]PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。[0035]对PCR扩增产物进行测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对，结果表明，解有机磷菌C3-6与Stenotrophomonas sp.的相似度为100％，覆盖度为99％。
[0036]将上述获得的纯培养菌株中的一株命名为假单胞菌C3-6，并将其保藏。保藏时间：2016年8月15日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC；保藏号为CGMCC NO.12836。
[0037]实施例2、假单胞菌C3-6的解有机磷能力测定
[0038]将假单胞菌C3-6在牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养1～2d后，用移液吸取5μL接种到有机磷固体培养基上，30℃培养7天，测量溶磷圈直径(HD)和菌落直径(CD)。[0039]结果如图1B所示，假单胞菌C3-6在有机磷固体培养基平板上形成了较明显的溶磷圈，HD/CD值为3.28。说明CGMCC NO.12836具有将土壤中的难溶性有机磷，转换成易于吸收的有效磷的能力，这可使植物更易于吸收磷，从而促进植物生长。
[0040]实施例3、假单胞菌C3-6分泌生长激素吲哚乙酸(IAA)的能力测定
[0041]将假单胞菌C3-6接种到King培养基(蛋白胨20g，甘油15mL，K2HPO41.5g，MgSO4·7H20 1.5g，氨酸0.1g，pH 7.2(用KOH调PH))中，30℃，200rpm摇床培养24h。取3mL菌液12000rpm离心15min。取1mL的上清液加入2mL的Salkowski's反应液(12mg/L FeCl3，7.9mol/L H2SO4，加蒸馏水至1L)，混匀，在暗处反应30min后，在紫外分光光度计上选择波长530nm测吸光度值。无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、5、10、20、30、40、50、60μg·mL-1的IAA标准溶液同方法做标准曲线。每个样品设置3个重复。
[0042]根据制作标准曲线和检测结果，即可获得假单胞菌C3-6分泌吲哚乙酸(IAA)的量为9.81μg/mL。假单胞菌C3-6以氨酸(L-Trp)为前体合成植物生长激素吲哚乙酸(IAA)，由于其吸附在种子和根的表面，从而被植物所利用，同时也可以和植物内生的IAA共同作用刺激植物细胞生长和增殖，可促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分，同时对植物的其他生命活动进行调节。
[0043]实施例4、假单胞菌C3-6分泌铁载体能力测定
[0044]铬天青(chrome azurol S，CAS)培养基的配制：
[0045]A：蓝染液
[0046] a.0.06g CAS溶于50ml去离子水；
[0047] b.0.0027g FeCl·6H2O溶于10ml 10mM HCl；
[0048] c.0.073g HDTMA(十六烷基三甲基溴化胺)溶于40ml去离子水；
[0049] d.将a与9ml b混合，再混合c，此时为蓝，121℃高温灭菌20min。
[0050]B：混合液
[0051] a.MM9：15g KH2PO4，25g NaCl，50g NH4Cl溶于500ml去离子水；
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