[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1657608A [43]公开日2005年8月24日
[21]申请号200510055696.9[22]申请日2005.03.23
[21]申请号200510055696.9
[71]申请人江苏省微生物研究所有限责任公司
地址214063江苏省无锡市钱荣路7号
共同申请人柏建新 邓崇亮
[72]发明人柏建新 邓崇亮 朱晓宏 张一平 杜郭君
王红连 [74]专利代理机构北京万科园知识产权代理有限责任公司代理人张亚军 曹诗健
[51]Int.CI 7C12N 1/21C12P 19/38
权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页
[54]发明名称
[57]摘要
提供了一种腺苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillu
ssubtilis)JSIM－1025，还提供一种生产高产量腺
苷的发酵方法，利用包括1.8％的最适浓度酵母膏
的最佳培养基组分，最适pH6.5和40％的最适溶氧 控制范围的发酵条件，在37℃下发酵60小时后的产
苷能稳定在23克/升以上。
200510055696.9权 利 要 求 书第1/1页 1.一种生产腺苷的新菌株，其特征是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)肌苷产生菌为亲株，采用化学、物理诱变剂处理细胞，使亲株核酸代谢关键酶缺失或形成，遗传标记的回复获得新的遗传标记，完成了新的突变株，该突变株不再积累肌苷而积累大量腺苷，新的遗传标记为：黄嘌呤、组氨酸、硫胺素三重缺陷型(缩写为Xan-、His-、Thi-)，鸟苷酸还原酶、腺苷酸脱氨酶缺失(GMP red-、Deam-)，8-氮鸟嘌呤抗性(8-AG r)，新菌株的保藏号为CGMCC No.1304。
2.一种发酵生产腺苷的方法，包括将权利要求1所述的菌株在含有浓度为1.0-2.0％的酵母膏的培养基中通气搅拌培养，控制此发酵过程中培养基的pH在5.8-7.2，通气量为1∶0.3-0.6，溶氧范围控制30～50％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中酵母膏浓度为1.8％。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于发酵过程控制培养基的pH 为6.5。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述溶氧范围为40％。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于所述发酵培养基(％)是：
葡萄糖 10
酵母膏 1.8
豆饼水解液 1.5ml/100ml
K2HPO4 0.3
MgSO4 0.1
MnSO4 0.001
FeSO4 0.001
KCl 0.2
CaCO3 3
NH4SO4 1.5
PH 6.5
200510055696.9说 明 书第1/5页
腺苷产生菌以及发酵生产腺苷的方法
技术领域
本发明涉及新的微生物菌株，以及利用该菌株生产其代谢产物的发酵方法。具体地说，本发明涉及一种高产量腺苷产生菌，还涉及一种生产腺苷的发酵方法，利用最佳培养基组分，最适PH和溶氧控制范围的生产腺苷的最优发酵工艺条件，获得了高产量的腺苷。
背景技术
腺苷又称腺嘌呤核苷[2]，是人体循环系统疾病的药物。因为腺苷有促进冠扩张及心肌代谢的机能，扩张血管，增加冠血量的药理作用因此可以用于冠状血管障碍、狭心症、动脉硬化症及高血压症等疾病的。此外，腺苷及其衍生物可以作为抑制血液凝固药物使用，用腺苷来保藏血液效果特好。
腺苷是合成三磷酸腺苷(ATP)的主要原料，ATP已被广泛应用于心不全、脑动脉硬化及肌肉萎缩等症。国内腺苷生产方法主要从酵母中提取R N A后，降解获得。R N A降解得到的4种核苷中除腺苷外，其它三种核苷在国内需求量很小，开发应用还需要等待一段时间，销售价格很便宜。如果为了生产A T P而从降解R N A获取腺苷原料，导致腺苷生产成本非常昂贵，由此而限制了国内A T P的生产量。我国每年所需A T P大部分依赖进口，ATP每年进口量约50吨左右，每吨价格约160万元，耗费大量外汇。
发明内容
本发明一方面提供了一种腺苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) JSIM-1025，它的遗传标记为：黄嘌呤、组氨酸、硫胺素三重营养缺陷型(简写为Xan-、His-、Thi-)，鸟苷酸还原酶、腺苷酸脱氨酶缺失(GMP red-、Deam-)，8-杂鸟嘌呤抗性，其代谢途径见附图1。该菌株已于2005年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1304。
本发明另一方面提供了一种生产高产量腺苷的发酵方法，将前述菌株在最佳培养基组分，最适PH的发酵培养基中，以最适溶氧控制范围条件下进行通气搅拌培养，获得了高产量的腺苷。
所述发酵方法的温度为34-38℃，通风量为1∶0.3-0.6，发酵周期为50-72小时，优选为64～66小时。
所述方法使用的发酵培养基中酵母膏浓度为1.0-2.0％，优选酵母膏的浓度为1.8％。
所述方法使用的发酵培养基中豆饼水解液浓度为1.5％。 所述发酵过程控制培养基的p H在5.8-7.2，最适p H为6.5。 所述发酵方法中通气搅拌培养的溶氧范围控制在30~50％，优选溶氧范围为40％。
发明详述
一、高产量腺苷产生菌的制备
以本实验室选育的肌苷产生菌JSIM-1019作为出发菌株，用物理、化学诱变剂对亲株进行诱变处理，所述的诱变剂为紫外线、甲基磺乙酯、亚硝基胍对肌苷产生进行诱变育种，紫外线照射时间为0.5-3min，甲基磺乙酯的浓度为0.5％-2％，处理时间为15-45min，亚硝基胍浓度为300μg/ml-500μg/ml，处理时间30-50min，处理方法为连续或相间，得到一系列突变子，然后再对突变子遗传性能进行累加性选育，获得了一批黄嘌呤营养缺陷型突变株。将黄嘌呤营养缺陷型突变株接种在种子培养基中，34℃培养18小时，然后以10％接种量接种到发酵培养基中，36℃培养72小时后，选择在发酵培养基中积累腺苷最多的突变子，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM-1025。
二、高产量腺苷的发酵生产
(1)摇瓶种子培养方法
将生长良好的斜面培养物接种至种子培养基中，接种量为5-10％，在温度30-36℃下，摇床转速为110r/
min，培养8-18小时。
(2)摇瓶发酵培养
将生长良好的种子液接种到摇瓶发酵培养基中，在温度30-37℃，摇床转速为110r/min，培养50-72小时。
(3)30M3罐发酵培养
发酵培养基装量21M3，120℃灭菌10分钟，接种量10％，34-38℃，控制30～50％溶氧范围，优选溶氧为40％，通气搅拌培养，通风量1∶0.3-0.6，发酵周期为50-72小时，优选为64～66小时，发酵过程中控制培养基的pH在5.8-7.2，优选pH为6.5。
三.发酵液产物定性鉴定和定量测定
①纸层析溶剂系统定性鉴定
纸层析溶剂系统
I正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1
II正丙醇∶NH4OH∶水＝20∶12∶3
IIII饱和硫酸铵∶异丙醇∶IN醋酸钠＝40∶1∶9
②电泳定性定量鉴定
电泳缓冲液系统
I 0.05M柠檬酸缓冲液(pH3.5)
II 10％醋酸
样品点正极，电压500v，时间2小时。
②腺苷定量测定
培养液在沸水浴中加热10分钟，4000rpm离心5分钟，点样，点样量5μl，10％醋酸缓冲液500伏电泳2小时，在紫外层析灯下出现紫外荧光斑点，用5ml 0.1N HCl浸出后，然后用紫外分光光度计在260nm处测定洗脱液的0.D值，计算出腺苷含量。
上述发酵周期测得腺苷产量稳定在23(g/l)以上。
有益效果
本发明获得了一株黄嘌呤、硫胺素、组氨酸三重缺陷型，鸟苷酸还原酶、腺苷酸脱氨酶缺失及8-氮鸟嘌呤抗性的高产量腺苷产生菌，本发明还获得了发酵生产腺苷的最优发酵条件，利用本发明的高产菌株，以及本发明选择的最适酵母膏的浓度，最适PH，最适溶氧量，在37℃下发酵60小时后的产苷量稳定在23克/升。
附图说明
附图1腺苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM-1025的代谢途径。
具体实施方式
实施例1 腺苷的摇瓶发酵生产
1、斜面菌种培养
斜面培养基的制备：
土豆汁 1000毫升
酪蛋白水解液 0.1
鸟嘌呤 25γ/ml
PH 7.0
将JSIM-1025菌种接种到上述斜面培养基上，在温度30-34℃培养24-28小时。
2、摇瓶种子培养
种子培养基(％)的制备：
葡萄糖 1
酵母膏 0.5
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