(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810395344.5
(22)申请日 2018.04.27
(83)生物保藏信息
CGMCC No.14377 2017.07.03
(71)申请人 福建农林大学
地址 350002 福建省福州市仓山区上下店
路15号
(72)发明人 袁宗胜 刘芳 张国防 谢宝贵
(74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限
公司 35100
代理人 蔡学俊
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
A01N 63/02(2006.01)
A01P 21/00(2006.01)
C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称
其应用
(57)摘要
本发明提供一株毛竹内生解磷解钾固氮产
气肠杆菌及其应用，所述菌为产气肠杆菌
（Enterobacter aerogenes ）
CT-B09-2，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员
会普通微生物中心，保藏编号为：C G M C C
No.14377。所述毛竹内生产气肠杆菌具有解磷解
钾固氮的作用，可以在植物体内定殖，提高生物
酶活性，对调节植物生长和发育具有重要的作
用。权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图5页CN 108587959 A 2018.09.28
C N 108587959
A
1.一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌，其特征在于：所述菌为产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes ）CT -B09-2，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14377。
2.含权利要求1所述产气肠杆菌的生物菌剂。
3.如权利要求1所述的产气肠杆菌在解磷解钾固氮中的应用。
4.如权利要求1所述的产气肠杆菌在促进毛竹光合作用中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 108587959 A
一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌及其应用
技术领域
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌及其应用。
背景技术
[0002]植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部, 并与植物建立了和谐联合关系的细菌。植物内生细菌因其生态学优势，能在植物体内长期定殖、传导，且不易受环境条件的影响，对植物生长发育、抵抗疾病以及不良环境具有广泛的生物学作用，是非常难得的天然生物资源，在农业生产中具有良好的研究和开发潜力。人们已经从富贵竹、辣椒、柑橘、杨树、烟草、铁皮石斛等多种植物中分离到多种内生细菌，针对植物组织内生且具有解磷、解钾或固氮等促生功能细菌也进行了相应的研究，Sheng等从植物体内分离到能降解有机污染物或具有重金属抗性并能促进植物生长的内生细菌。 [0003]毛竹（Phyllostachys edulis）属散生型竹种，具有生长快、成材早、用途广、经济收益大等优点，是中国南方重要的森林资源。根据中国第6次森林资源清查统计，中国毛竹林面积约为337.20万公顷，约占世界竹林面积的47%。但毛竹的研究多集中在毛竹丰产理论、土壤理化性质、物种多样性等方
面，近年来李潞滨、齐等人分别对毛竹和苞箭竹根际微生物和土壤细菌进行了研究，夏冬亮也探索了毛竹根部内生细菌分离培养基的选择。但目前对毛竹不同组织可培养内生细菌分离、解磷解钾固氮功能内生细菌的筛选及具有促进光合作用的功能内生细菌方面尚未见报道。
发明内容
[0004]本发明的目的在于提供一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌及其应用。[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌，其分类命名为产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）CT-B09-2，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14377，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006]所述内生解磷解钾固氮产气肠杆菌的菌落特征及菌体形态为：
将CT-B09-2在NA平板上培养24h后形成菌落颜为白，具有光泽，呈圆形、表面光滑、半透明、边缘整齐，无流动性，革兰氏染阴性，无芽孢；菌落直径4-5mm。
[0007]所述内生解磷解钾固氮产气肠杆菌的生理生化特征：
CT-B09-2 接触酶反应呈阳性，V．P测定呈阳性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阳性，葡萄糖产气试验阳性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阳性，需氧性测定呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产H2S试验试验阳性。
[0008]将所述内生解磷解钾固氮产气肠杆菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明: CT-B09-2与Enterobacter aerogenes 同处于一个分支上，其16S rDNA序
列与Enterobacter aerogenes（JQ660204）的相似度达99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）。
[0009]本发明的优点在于：
所述毛竹内生产气肠杆菌具有解磷解钾固氮的作用，可以在植物体内定殖，提高生物酶活性，对调节植物生长和发育具有重要的作用。
[0010]本发明毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌制成菌剂通过灌根接种到毛竹幼苗，可以明显提高毛竹叶片叶绿素含量、提高光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)，降低叶片胞间CO2浓度(Gs)，与对照相比，差异达显著水平。通过竹腔注射接种到II度毛竹，可以提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量，与对照相比，差异达显著水平。因此，本发明为将来开发毛竹专用的微生物菌剂菌肥提供了良好的菌株资源。
附图说明
[0011]图1 内生细菌处理后毛竹叶片 SPAD值的变化。
[0012]图2 内生细菌处理后毛竹叶片 CAT 活性的变化。
[0013]图3 内生细菌处理后毛竹叶片MDA含量的变化。
[0014]图4 内生细菌处理后毛竹叶片POD活性的变化。
[0015]图5内生细菌处理后毛竹叶片SOD 活性的变化。
[0016]图6内生细菌处理后毛竹叶片可溶性蛋白含量的变化。
[0017]图7内生细菌处理后毛竹叶片可溶性糖含量的变化。
具体实施方式
[0018]下面结合实例对本发明进一步说明。
[0019]一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌，其分类命名为产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）C
T-B09-2，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14377。
[0020]实施例1 毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌的筛选
（1）筛选过程：
通过梯度稀释法，从福建省武夷山市、长汀县、将乐县毛竹中心产区I度毛竹中分离出82株分离物。通过三区划线法对分离到的内生细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转移到NA斜面上保存备用。通过平板解磷解钾固氮效果测定，初步筛选出20株具有较好解磷解钾固氮效果的内生菌株，最终筛选出一株具有良好解磷解钾固氮效果的内生细菌，标记为CT-B09-2。
[0021]（2）菌落特征及菌落形态：
将CT-B09-2在NA平板上培养24h后形成菌落颜为白，具有光泽，呈圆形、表面光滑、半透明、边缘整齐，无流动性，革兰氏染阴性，无芽孢；菌落直径4-5mm。
[0022]（3）生理生化特征：
CT-B09-2 接触酶反应呈阳性，V．P测定呈阳性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阳性，葡萄糖产气试验阳性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阳性，需
氧性测定呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产H2S试验试验阳性。
[0023]（4）解磷解钾固氮能力测定：
将分离得到的内生细菌菌株分别接种到事先配制好的有机磷培养基、无机磷培养基、钾细菌培养基以及Ashby无氮培养基平板上，每皿4个接菌点，重复３次。28℃恒温培养 5 d。分别观察并记录菌株生长情况及分解圈大小，根据分解圈大小、透明圈直径／菌落直径（Ｄ/ｄ值）确定内生细菌的解磷解钾固氮活性。分解圈越大、Ｄ/ｄ值越大，表示解磷解钾固氮活性越强。
[0024]其中，有机磷培养基： 葡萄糖 10g，(NH4)2 SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，卵磷脂 0.2 g，CaCO3 5.0g，酵母膏 0.4 g，琼脂 20g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
无机磷培养基：葡萄糖 10g，(NH4)2 SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，MgSO4 0.3g，CaCO3 5.0g，Ca3(PO4) 2 5.0g，酵母膏 0.4 g，琼脂 20g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
钾细菌培养基：蔗糖10.0g，酵母膏 0.5 g ，(NH4)2SO4,1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0 g，钾长石粉 1g，琼脂 15g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
Ashby无氮培养基：蔗糖10.0g，酵母膏 0.5 g ，(NH4)2SO4,1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0 g，钾长石粉 1g，琼脂 15g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）。
[0025]通过测定，产气肠杆菌CT-B09-2解有机磷活性为“+++”，透明圈/菌落直径（D/d）为5.05±0.41，解无机磷活性为“++”，透明圈/菌落直径（D/d）为2.12±0.08，解无机磷活性为“++”，透明圈/菌落直径（D/d）为3.30±0.36。固氮活性为“+++”。
[0026]表1高效解磷解钾固氮菌株的初步筛选
注: D：透明圈直径 ， d：菌落直径 ，
“-”：无活性（分解圈＜10mm）；“+”：有活性（分解圈:10-15mm）；
“++”：较强活性（分解圈：16-20mm）；“+++”：很强活性（分解圈：＞20mm）；
将初筛中具有解磷解钾活性的菌株接种于NB培养基中，待菌悬液的浓度达到108 cfu/ mL时，各取5mL菌悬液分别接种于100 mL有机磷液体培养基、无机磷液体培养基及钾细菌液体培养基中，每个处理重复3 次，同时设不接种为对照。28℃，160 r /min 培养7d后进行离心（４℃，10000 r/ min，15 min），取上清液采用钼锑抗比法测定测定有效磷增量（扣除对照后的值），可溶性磷含量计算公式如下：P＝K×V/V1。式中，P为有效磷含量；Ｋ为标准曲线查得显液的磷含量（mg/L）；V为显时溶液定容的体积（mL）；V1为显时吸取上清液的体积（mL）。用火焰光度法测定有效钾增量（扣除对照后的值）。
[0027]通过测定，产气肠杆菌CT-B09-2从0.2g/L卵磷脂中释放出的可溶性磷为81.77 mg/L，是对照处理的53.10倍，差异显著（P＜0.05）；从5.0g/L磷酸三钙中释放出的可溶性磷
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议