(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 104152396 A (43)申请公布日 2014.11.19 |
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(21)申请号 CN201410371954.3
(22)申请日 2014.07.31
(71)申请人 河南大学
地址 475001 河南省开封市明伦街85号
(72)发明人 张骁 赵翔 孔培涛 王雪娇 高歌
(74)专利代理机构 郑州联科专利事务所(普通合伙)
代理人 时立新
(51)Int.CI
C12N5/04
(54)发明名称
(57)摘要
本发明具体涉及一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法。该方法包括诱导棉花种子萌发、酶解分离保卫细胞原生质体、离心等步骤。本发明所提供的棉花保卫细胞原生质体的分离方法，对棉花叶片的保卫细胞采用一步酶解法，与两步酶解法相比大大缩短了实验时间，简化了实验操作流程，提高了实验效率，而且保持了原生质体较高的生理活力，更解决了棉花保卫细胞原生质体分离的难题。棉花保卫细胞原生质体的成功分离，为研究保卫细胞膜通透性、离子转运以及气孔运动机理提供了较好的实验基础。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）取棉花种子，诱导萌发；
（2）取步骤（1）中萌发3~4周后的棉花真叶，漂洗干净，撕取表皮条，将收集的表皮条转入酶解液中，于23~28℃水浴震荡1.5~2h游离保卫细胞原生质体；
（3）向步骤（2）中酶解结束后的混合液中加入混合液5~10倍体积的基本介质，滤网双层过滤，滤液低速离心，弃上清液，保留离心管管体下端1/3的溶液，所述低速离心为200~300转/min，离心5~8分钟；
（4）将步骤（3）中保留溶液加入基本介质重新悬浮，高速离心，弃上清，所述高速离心为700~800转/min，离心8~10min；重复此步骤2~3次，可获得纯净的原生质体；
步骤（3）、步骤（4）中所述基本介质为液体，其组成为：谷氨酸钾10 mmol/ L、MgCl<sub>2 </sub>2 mmol/ L、 Mes 10 mmol/ L，山梨醇调渗透压至550~600 mOsmol /Kg，1 mmol/ L KOH调pH至5.0~6.0。
2.如权利要求1所述棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，步骤（2）中所述酶解液体系组成为：纤维素酶RS 1.3wt%、果胶酶Y-23 0.03wt%、牛血清蛋白BSA 0.25wt%、抗坏血酸 0.5 mmol/L，山梨醇调渗透压至530~550 mOsmol /Kg，1 mmol/ L KOH调节pH至5.0~6.0。
3.如权利要求1所述棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，步骤（1）中诱导棉花种子萌发的具体步骤为：取成熟饱满的棉花种子，80℃水浴浸种2分钟；浸种后，棉花种子在16 h光照/8 h黑暗、光强为22 KLux、温度20~29℃、相对湿度60%至70%的条件下诱导萌发。
4.如权利要求1所述棉花保卫细胞原生质体的分离方法，其特征在于，步骤（3）中滤网为400目。
说 明 书
<p>技术领域
本发明具体涉及一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法。
背景技术
棉花，锦葵科棉属植物，植株灌木状。棉花是世界上最主要的农作物之一，而我国也是棉花产量最高的国家之一。棉花的主副产品都有较高的利用价值，它既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的粮食作物，还是纺织、精细化工原料和重要的战略物资。
棉花作为重要的经济作物和纤维作物，将现代生物技术应用于棉花育种和生产有着广阔的前景。近年来棉花生物技术发展很快，先后在植株的培育、抗性突变体筛选、转基因抗病
虫害植株的培育方面都取得了很大的进展。
保卫细胞原生质体是研究气孔运动、膜通透性和离子转运过程的重要材料。保卫细胞可说是植物体中最奇妙的细胞，能感受内、外环境信号而调节其本身体积，从而控制气孔大小，主宰植物体与外界环境所进行的水分、气体等交换，从而更好地适应不利的环境。然而如何获得纯化有活性的棉花保卫细胞原生质体，利用电生理膜片技术解析棉花保卫细胞质膜离子的跨膜流动，特别是监控K<sup>+</sup>和Ca<sup>2+ </sup>跨膜流动情况是解释棉花响应逆境条件气孔运动机理的重要前提。遗憾的是，目前没有对棉花保卫细胞的原生质体分离纯化描述，最近有对棉花叶肉细胞原生质体分离的报道（李妮娜，作物学报2014，40(2): 231?239）。叶肉细胞原生质体的获得，主要用于转化基因表达检测。目前，如何分离和纯化棉花保卫细胞原生质体，已成为限制棉花气孔运动调控机制研究的主要因素。
发明内容
本发明目的在于提供一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法，可以制备较为纯净的棉花保卫细胞的原生质体。
本发明所采取的技术方案如下。
一种棉花保卫细胞原生质体的分离方法，包括以下步骤：
（1）取棉花种子，诱导萌发；
（2）取步骤（1）中萌发3~4周后的棉花真叶，漂洗干净，优选采用无菌水漂洗，撕取表皮条，将收集的表皮条转入酶解液中，于23~28℃水浴震荡1.5~2h游离保卫细胞原生质体；
（3）向步骤（2）中酶解结束后混合液中加入混合液5~10倍体积的基本介质，滤网双层过滤，滤液低速离心，弃上清液，保留离心管管体下端1/3的溶液，所述低速离心为200~300转/min，离心5~8分钟；
（4）将步骤（3）中保留溶液加入基本介质重新悬浮，高速离心，弃上清，所述高速离心为700~800转/min，离心8~10min，重复此步骤2~3次，可获得纯净的原生质体；
步骤（3）、步骤（4）中所述基本介质为液体，其组分为：谷氨酸钾10 mmol/ L、MgCl<sub>2 </sub>2 mmol/ L、Mes（2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物） 10 mmol/ L，用山梨醇调调渗透压至550~600 mOsmol /Kg，1 mmol/ L KOH调节pH至5.0~6.0。
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