一种检测PD-L1的质控品及其制备方法和应用与流程

一种检测pd-l1的质控品及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种检测pd-l1的质控品及其制备方法和应用。

背景技术：

2.程序性死亡配体-1(programmed death-ligand 1，pd-l1)是大小为40kda的第一型跨膜蛋白，属于b7家族的成员。pd-1/pd-l1信号通路是参与肿瘤免疫逃逸的重要途径，当肿瘤发生时，其细胞上高表达的pd-l1与t细胞表面的pd-1结合，下调或抑制t细胞功能，阻止机体免疫t细胞攻击肿瘤细胞，导致肿瘤细胞免疫逃逸。pd-l1在多种肿瘤细胞中均有上调表达，如三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌和胃食管结合部癌、尿路上皮癌、食道癌、头颈部鳞癌、宫颈癌、胰腺癌和黑素瘤等。免疫是通过pd-1或pd-l1单抗阻断t细胞上的pd-1与肿瘤细胞上的pd-l1结合，使t细胞识别并攻击肿瘤细胞，最终起到恶性肿瘤的作用。免疫显著改善了癌症的效果，但是这一疗法只对一部分肿瘤患者（pd-l1阳性的患者）有作用，因此在进行临床研究乃至临床时，都需要确定备选患者组织中pd-l1抗原的表达情况，如利用伴随诊断试剂针对特定的靶点进行检测，提供反应的信息，有助于确定能够从某一产品中获益的患者体，从而改善预后并降低开支。
3.目前，临床pd-l1的检测中，主要存在以下问题：（1）目前市面上主要包括autostainer link 48平台、ventana benchmark ultra平台和leica bond max/iii平台，不同平台采用的二抗系统不同，单个抗体在每个平台上的染差异显著，市面上的伴随诊断产品大多为了避免染差异，而不对染强弱进行判读；（2）不同的抗体检测结果判读标准不同，目前用于伴随诊断的pd-l1检测抗体使用的判读方法主要有tc、cps以及分别计算tc和ic判读方法，不同的肿瘤中判读方法不同，针对非小细胞肺癌，28-8和22c3抗体使用tc的判读方法，但sp142抗体采用的是tc和ic联合判读，fda批准22c3抗体的说明书中指出针对非小细胞肺癌使用tc的判读方法，但针对胃腺癌和胃食管结合部腺癌，则建议使用cps的判读方法，同样在宫颈癌和尿路上皮癌中亦推荐使用cps判读方法，因此pd-l1的判读需要专业的病理医生经过大量的训练才能保证判读的准确性，较难推广应用。
4.基于上述问题，各检测机构、试剂和仪器生产商均采用自制的质控片对每轮检测进行质控，这些质控片的质量良莠不齐，且往往组成单一，仅能给检测做定性参考，而pd-l1的检测对结果的精准度要求是相当高的，目前上市的pd-l1伴随诊断产品的cut off值均为低值，检测中些许偏差就可能导致错误的用药指导，给病人造成严重的后果。
5.综上所述，提供一种检测pd-l1的质控片，能够保证对抗体的染进行质控，以及对精准判读提供指导，对于癌症诊断及具有重要意义。

技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测pd-l1的质控品及其制备
方法和应用，通过在脂质囊泡上修饰pd-l1蛋白，获得pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物，制备不同染强度和染比例的脂质囊泡，作为pd-l1免疫组织化学染的质控品，提供全面精准的质控和判读指导。
7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种检测pd-l1的质控品，所述质控品包含pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物的切片，所述pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物包括脂质囊泡和修饰于脂质囊泡上的pd-l1蛋白，所述pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物的切片包括免疫组织化学染强度分别为0、1+、2+和3+的切片，所述pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物的切片还包括免疫组织化学染比例分别为《1%、1%~5%、5%~10%和》10%的切片。
8.本发明中，创造性地采用脂质囊泡携带pd-l1蛋白作为质控品的原料，能够高效快速制备，实现质控品的长期稳定生产，克服了采用人体组织样本来源的局限性，此外，制备包含各种比例和不同染强度的脂质囊泡切片，可以保证对抗体的染进行质控，也可以对精准判读提供指导，即为抗体的染提供全面精准的质控和判读指导，有效的排除假阴性、假阳性，对临床的意义重大。
9.优选地，所述脂质囊泡的制备原料包括二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰甘油和胆固醇。
10.第二方面，本发明提供第一方面所述的检测pd-l1的质控品的制备方法，所述制备方法包括：将脂质囊泡与修饰有生物素的pd-l1蛋白混合，得到pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物，将所述pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物制备成石蜡切片，对所述石蜡切片进行pd-l1免疫组织化学染，根据需求选择合适的pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物制备pd-l1的质控品。
11.可以理解，本领域通用pd-l1免疫组织化学染试剂均适用本发明，可选择不同克隆号的pd-l1商业化伴随诊断试剂盒，进行pd-l1的免疫组化染，包括但不限于22c3、28-8、sp263、sp142和e1l3n，同步选取同型igg抗体作为对照进行染。
12.可以理解，本领域通用的组织切片制备方法均适用于本发明，如具体可选择石蜡包埋切片制备方法。
13.优选地，所述脂质囊泡修饰有链霉亲和素，其制备方法包括：将二硬脂酰磷脂酰胆碱（dspc）、链霉亲和素修饰的二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇（dspc-peg-streptavidin）、二硬脂酰磷脂酰甘油（dspg）和胆固醇（cholesterol）按一定比例混合充分溶解到有机溶剂中，进行旋转蒸发处理形成薄膜，加入缓冲液，进行超声处理，得到所述修饰有链霉亲和素的脂质囊泡。
14.可以理解，所述有机溶剂可根据需求进行常规选择，例如使用氯仿等。
15.可以理解，所述缓冲液可根据需求进行常规选择，例如使用磷酸缓冲液等。
16.优选地，所述dspc、dspc-peg-streptavidin、dspg和cholesterol的摩尔比为(30~60):(0.001~20):(20~50):(20~60)。
17.第三方面，本发明提供一种检测pd-l1的质控片，所述质控片包括基底及设置在所述基底上的pd-l1对照区和待测样品放置区，所述pd-l1对照区含有第一方面所述的检测pd-l1的质控品。
18.本发明中，质控片制备过程可控，可制备出包含各种比例和不同染强度的脂质
囊泡质控，可以为抗体的染提供全面精准的质控和判读指导，有效的排除假阴性、假阳性。
19.优选地，所述基底包括载玻片。
20.优选地，所述基底上还设置有染图谱区。
21.优选地，所述染图谱区含有pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物的切片的染图谱。
22.本发明中，pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物的切片的染图谱为不同克隆号的pd-l1商业化伴随诊断试剂盒pd-l1对照区染图，可以对染质量做精准的评估。
23.第四方面，本发明提供第一方面所述的检测pd-l1的质控品或第三方面所述检测pd-l1的质控片在pd-l1免疫组织化学染产品中的应用。
24.第五方面，本发明提供一种pd-l1免疫组织化学染检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测pd-l1的质控品或第三方面所述检测pd-l1的质控片。
25.第六方面，本发明提供第一方面所述的检测pd-l1的质控品或第三方面所述检测pd-l1的质控片在以非疾病诊断为目的pd-l1免疫组织化学染检测中的应用。
26.第七方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的pd-l1免疫组织化学染检测方法，所述检测方法包括：取待检测样本切片，置于第三方面所述检测pd-l1的质控片的待测样品放置区，进行待测样本的pd-l1免疫组织化学染，根据染图谱比对pd-l1对照区的染是否合格，若合格，进行待测样本的染结果判定。
27.本发明的pd-l1免疫组织化学染检测方法，可以应用于体外分析检测样品中pd-l1蛋白表达水平，实现非疾病诊断为目的的基础机理、行为研究等。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明的质控品制备过程可控，包含各种比例和不同染强度的脂质囊泡质控，可以为抗体的染提供全面精准的质控和判读指导，有效的排除假阴性、假阳性；（2）本发明中脂质囊泡的制备可以选用不同的抗原，用于不同克隆的pd-l1抗体试剂检测的质控，针对性、灵活性和适用性强；（3）本发明提供的pd-l1质控片中含不同程度表达pd-l1蛋白的脂质囊泡，特别是包括大量的阳性阈值附近的脂质囊泡，可以作为pd-l1蛋白表达的灵敏度对照。
附图说明
29.图1为本发明检测pd-l1的质控片的示意图，其中1为防脱载玻片，2为质控片标签，3为pd-l1对照区，4为待测样品放置区，5为染图谱区；图2为实施例3中脂质囊泡图；图3为实施例3中脂质囊泡的免疫组化染图。
具体实施方式
30.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
31.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，
或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
32.本发明中，制备包含各种比例和不同染强度的脂质囊泡质控，可以包括pd-l1（e1l3n）表达染强度1+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）表达2+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）表达3+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）表达染强度1+、染比例20%，染强度2+、染比例30%，染强度3+及以上、染比例50%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）表达染强度1+、染比例50%，2+、染比例50%，3+及以上染比例为0%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）表达染强度0+的脂质囊泡，包含pd-1/pd-l1信号通路中的染信息和染浓度，可以保证对抗体的染进行质控，也可以对精准判读提供指导，即为抗体的染提供全面精准的质控和判读指导，有效的排除假阴性、假阳性。
33.实施例1本实施例提供一种检测pd-l1的质控片，所述质控片上包括pd-l1不同染结果的脂质囊泡，所述质控片结构示意图如图1所示，包括防脱载玻片1；质控片标签2；pd-l1对照区3，其中含有不同染强度、染比例的脂质囊泡，包括：pd-l1（e1l3n）染3+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（22c3）染3+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）染2+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（22c3）染2+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）染1+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（22c3）染1+、染比例100%的脂质囊泡，所有位点的脂质囊泡均有详细的判读结果；待测样品放置区4；染图谱区5。
34.所述检测pd-l1的质控片的制备方法包括以下步骤：（1）按摩尔比为50:1:20:20称取二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、链霉亲和素修饰的二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇(dspc-peg-streptavidin)、二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)和胆固醇(cholesterol)置于圆底烧瓶中；（2）向烧瓶中加入5 ml氯仿充分溶解，通过旋转蒸发仪减压蒸发，除去氯仿，使脂质组分在瓶壁上形成薄层；（3）加入磷酸缓冲液进行水化，通过超声分散获得水合粒径相对均匀的链霉亲和素功能化的脂质囊泡；（4）将生物素功能化修饰的pd-l1（摩尔质量同dspc-peg-streptavidin）与上述制备得到的脂质囊泡混合，即可获得目标脂质囊泡复合物；（5）1000
×
g离心获得脂质囊泡复合物，用10倍体积的10%的中性福尔马林固定36小时制备好的脂质囊泡复合物；（6）离心洗涤制备的脂质囊泡复合物；（7）参照病理技术规范要求取材、脱水、石蜡包埋并制成蜡块；（8）将蜡块切成厚度为4
ꢀµ
m的连续切片，黏附在防脱载玻片上；（9）将载玻片在25℃下斜立晾20分钟；（10）60
±
5℃烤片40分钟；（11）选择克隆号为e1l3n和22c3的pd-l1商业化伴随诊断试剂盒，进行免疫组化染，挑选不同类型染比例的组织切片和不同染强度的囊泡切片，组成最终的质控片。
35.实施例2本实施例提供一种检测pd-l1的质控片，所述质控片上包括pd-l1不同染结果的
脂质囊泡，所述质控片结构示意图如图1所示，包括防脱载玻片1；质控片标签2；pd-l1对照区3，其中含有不同染强度、染比例的脂质囊泡，包括：pd-l1（e1l3n）染3+、染比例0.5%的脂质囊泡，pd-l1（22c3）染3+、染比例10%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）染2+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（22c3）染2+、染比例20%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）染1+、染比例100%的脂质囊泡，pd-l1（22c3）染1+、染比例5%的脂质囊泡，pd-l1（e1l3n）表达染强度0的脂质囊泡所有位点的脂质囊泡均有详细的判读结果；待测样品放置区4；染图谱区5。
36.所述检测pd-l1的质控片的制备方法参照实施例1。
37.实施例3本实施例提供一种检测pd-l1的质控片，制备方法参照实施例1，其中制备的脂质囊泡如图2所示，脂质囊泡的免疫组化染图如图3所示。
38.综上所述，本发明创造性地采用脂质囊泡携带pd-l1蛋白作为质控品的原料，能够高效快速制备，实现质控品的长期稳定生产，能够长期稳定的提供具有不同染强度动态范围的pd-l1免疫组织化学参考品，可以有效的检测免疫组织化学过程是否正常，能正确检测出不同强度的pd-l1表达，可作为日常pd-l1免疫组织化学的良好外部对照，监控整个pd-l1免疫组织化学流程的有效性；或用于有效的pd-l1免疫组织化学ldt流程质控；或作为pd-l1免疫组织化学室间质评的参考品。
39.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：

1.一种检测pd-l1的质控品，其特征在于，所述质控品包括pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物的切片；所述pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物包括脂质囊泡和修饰于脂质囊泡上的pd-l1蛋白；所述pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物的切片包括免疫组织化学染强度分别为0、1+、2+和3+的切片；所述pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物的切片还包括免疫组织化学染比例分别为<1%、1%~5%、5%~10%和>10%的切片。2.根据权利要求1所述的检测pd-l1的质控品，其特征在于，所述脂质囊泡的制备原料包括二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰甘油和胆固醇。3.权利要求1或2所述的检测pd-l1的质控品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将脂质囊泡与修饰有生物素的pd-l1蛋白混合，得到pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物，将所述pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物制备成石蜡切片，对所述石蜡切片进行pd-l1免疫组织化学染，根据需求选择合适的pd-l1蛋白-脂质囊泡复合物制备pd-l1的质控品。4.根据权利要求3所述的检测pd-l1的质控品的制备方法，其特征在于，所述脂质囊泡修饰有链霉亲和素，其制备方法包括：将二硬脂酰磷脂酰胆碱、链霉亲和素修饰的二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰甘油和胆固醇按一定比例混合加入有机溶剂充分溶解，然后进行旋转蒸发处理形成薄膜，加入缓冲液，进行超声处理，得到修饰有链霉亲和素的脂质囊泡。5.一种检测pd-l1的质控片，其特征在于，所述质控片包括基底及设置在所述基底上的pd-l1对照区和待测样品放置区；所述pd-l1对照区含有权利要求1或2所述的检测pd-l1的质控品。6.根据权利要求5所述的检测pd-l1的质控片，其特征在于，所述基底包括载玻片；所述基底上还设置有染图谱区。7.权利要求1或2所述检测pd-l1的质控品或权利要求5或6所述检测pd-l1的质控片在pd-l1免疫组织化学染产品中的应用。8.一种pd-l1免疫组织化学染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的检测pd-l1的质控品或权利要求5或6所述检测pd-l1的质控片。9.权利要求1或2所述检测pd-l1的质控品或权利要求5或6所述检测pd-l1的质控片在以非疾病诊断为目的pd-l1免疫组织化学染检测中的应用。10.一种以非疾病诊断为目的的pd-l1免疫组织化学染检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：取待检测样本切片置于权利要求5或6所述检测pd-l1的质控片的待测样品放置区，进行pd-l1免疫组织化学染，根据质控片的染进行待测样本的染结果的质控和判定。

技术总结

本发明公开了一种检测PD-L1的质控品及其制备方法和应用。所述质控品包括PD-L1蛋白-脂质囊泡复合物的切片，所述PD-L1蛋白-脂质囊泡复合物包括脂质囊泡和修饰于脂质囊泡上的PD-L1蛋白，所述PD-L1蛋白-脂质囊泡复合物的切片包括免疫组织化学染强度分别为0、1+、2+和3+的切片，所述PD-L1蛋白-脂质囊泡复合物的切片还包括免疫组织化学染比例分别为<1%、1%~5%、5%~10%和>10%的切片。通过在脂质囊泡上修饰PD-L1蛋白，制备不同免疫组织化学染强度和染比例的脂质囊泡，作为PD-L1免疫组织化学染的质控品，提供全面精准的质控和判读指导。导。导。