(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911279678.7
(22)申请日 2019.12.12
(71)申请人 北京市农林科学院
地址 100097 北京市海淀区曙光花园中路9
号
(72)发明人 李兴红 韩昌坪 张玮 燕继晔
刘梅 彭军波 邢启凯
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 白凤莹
(51)Int.Cl.
C12N 3/00(2006.01)
C12N 1/14(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称一种诱导可可孢快速产生分生孢子的方法(57)摘要本发明公开了一种诱导可可孢快速产生分生孢子的方法。本发明首先公开了葡萄枝条在诱导可可孢产生分生孢子中的应用。本发明进一步公开了一种诱导可可孢产生分生孢子的方法。本发明通过水琼脂培养基和葡萄枝条制备得到的产孢培养基培养可可孢，极大地缩短了可可孢产生分生孢子的时间，提高了产孢稳定性且很大程度上也避免了其他杂菌的污染，对研究可可孢的致病机理、侵染过程、病害发生规律和防治方法等相关研究提供了充分的基础条件，具有较高的应用 潜力。权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 110878280 A 2020.03.13
C N 110878280
A
1.葡萄枝条在诱导可可孢产生分生孢子中的应用。
2.一种诱导可可孢产生分生孢子的方法，其特征在于：所述方法包括将可可孢接种至产孢培养基培养，诱导可可孢产生分生孢子；
其中，所述产孢培养基由葡萄枝条和水琼脂培养基制备而成。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述水琼脂培养基由水和琼脂制备而成，所述琼脂的浓度为20g/L；
所述葡萄枝条和水琼脂培养基的质量比为1∶25。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述培养为在温度为28℃的条件下，14h光照10h黑暗培养9-13天。
5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述产孢培养基的制备方法为：取琼脂，加水定容，灭菌，得到灭菌的水琼脂培养基；
将葡萄绿枝条切4-6cm小段，灭菌，烘干，得到灭菌的葡萄枝条；
每皿中加灭菌的葡萄枝条和灭菌的水琼脂培养基，得到产孢培养基。
6.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于：所述葡萄枝条为离体的烘干后的葡萄枝条。
7.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于：所述葡萄枝条为当年生葡萄绿枝条。
8.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2-7任一所述的方法，其特征在于：所述葡萄枝条为夏黑葡萄枝条。
权 利 要 求 书1/1页CN 110878280 A
一种诱导可可孢快速产生分生孢子的方法
技术领域
[0001]本发明属于植物病原真菌诱导产孢技术领域，具体涉及一种诱导可可孢快速产生分生孢子的方法。
背景技术
[0002]可可孢(Lasiodiplodia theobromae)是一种重要的植物机会病原真菌，寄主范围十分广泛，可以侵染葡萄、芒果、木瓜，桃等多种多年生木本植物，在适合条件下发病，造成严重损失。当前关于可可孢的研究报道主要集中在病原菌的分离鉴定、生物学特性、致病力分析等方面，近年来，国内外相关研究人员开始着手其致病机理研究，为该病原菌引起的病害防控提供理论依据。其中，获得病原菌的分生孢子是开展基因功能、侵染过程等研究的关键环节，如何快速、简易地获得大量分生孢子在很大程度上决定了病原菌致病机理的研究进程。现有技术下，可可孢人工培养过程中存在分生孢
子难产生且周期长的问题，从而导致相关研究进展缓慢。
[0003]目前获得可可孢分生孢子的主要方法是用传统PDA培养基进行培养，等待其产孢，或者在进行PDA培养基培养时，采用日光或者紫外光照射破坏其正常生长环境以及培养3-5天之后打断菌丝等措施促进其产孢。利用上述方法通常情况下需要1个月甚至更长时间才能获得可可孢的分生孢子，而且产孢量不稳定，无法在短时间内为获取致病力分析、分生孢子侵染过程等研究提供所需的大量的分生孢子悬浮液。
[0004]因此，建立一种可可孢简易、快速、大量的分生孢子产孢技术体系，是本领域亟待解决的技术问题，也是对此类真菌的致病机理、侵染过程和寄主抗病品种的培育等研究的重要条件，而目前国内外尚未见可可孢快速稳定产孢的方法。
发明内容
[0005]本发明所要解决的技术问题为如何诱导可可孢快速稳定产孢，且避免培养过程中的杂菌污染。
[0006]为解决上述技术问题，本发明首先提供了葡萄枝条在诱导可可孢产生分生孢子中的应用。
[0007]本发明进一步提供了一种诱导可可孢产生分生孢子的方法。
[0008]本发明诱导可可孢产生分生孢子的方法，包括将可可孢接种至产孢培养基培养，诱导可可孢产生分生孢子；
[0009]其中，所述产孢培养基由葡萄枝条和水琼脂培养基制备而成。
[0010]上述方法中，所述水琼脂培养基由水和琼脂制备而成，所述琼脂的浓度为20g/L；[0011]所述葡萄枝条和水琼脂培养基的质量比为1∶25。
[0012]具体的，所述产孢培养基的制备方法为：取琼脂，加水定容，灭菌，得到灭菌的水琼脂培养基；将葡萄绿枝条切4-6cm小段(例如4cm、5cm或6cm)，灭菌，烘干，得到灭菌的葡萄枝条；每皿中加灭菌的葡萄枝条和灭菌的水琼脂培养基，得到产孢培养基。
[0013]在本发明具体的实施方式中，所述产孢培养基的制备方法为取琼脂20g，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌锅灭菌20min，得到灭菌的水琼脂培养基；将葡萄绿枝条切4-6cm 小段，于121℃高压灭菌锅灭菌20min，置于90℃烘箱2h烘干，得到灭菌的葡萄枝条；每皿中加20g灭菌的水琼脂培养基和0.8g灭菌的葡萄枝条，使葡萄枝条大部分暴露在水琼脂培养基的外面，得到产孢培养基。
[0014]上述方法中，所述培养为在温度为28℃的条件下，14h光照10h黑暗培养9-13天(例如可以为9天、10天、11天、12天或13天)。
[0015]上述方法中，所述可可孢为活化后的可可孢；具体的，所述活化的方法为将可可孢置于PDA培养基上，在28℃的条件下活化3-5天(例如可以为3天、4天或5天)。
[0016]上文中，所述葡萄枝条可为离体的烘干后的葡萄枝条。
[0017]上文中，所述葡萄可为夏黑葡萄。
[0018]上文中，所述葡萄枝条可为当年生葡萄绿枝条。
[0019]本发明诱导可可孢产孢的方法经过9-13天的培养使得可可孢产孢量达到6.82×104-2.20×105个/cm2；该处“cm2”指暴露在水琼脂培养基外面的葡萄枝条的表面积。
[0020]本发明诱导可可孢产生分生孢子的方法，解决了现有技术操作周期长，操作过程复杂，产孢量不稳定，易受杂菌污染等问题。通过水琼脂培养基和葡萄枝条制备得到的产孢培养基培养可可孢，极大地缩短了可可孢的产孢时间，提高了产孢稳定性且很大程度上也避免了其他杂菌的污染，对研究可可孢致病机理、侵染过程、病害发生规律和防治方法等相关研究提供了充分的基础条件，具有较高的应用潜力。
附图说明
[0021]图1为实施例1中将可可孢的菌饼放置在产孢培养基图；
[0022]图2为实施例1中接种第1天在产孢培养基上菌落形态；
[0023]图3为实施例1中接种第9天在产孢培养基上菌落形态；
[0024]图4为对比例1中接种第9天在传统PDA培养基上菌落形态；
[0025]图5为实施例2中接种第11天在产孢培养基上菌落形态；
[0026]图6为实施例3中接种第13天在产孢培养基上菌落形态。
具体实施方式
[0027]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]下述实施例中所述PDA培养基的制备方法为：
[0029]将200g马铃薯去皮切碎，沸水煮20min，滤出残渣，加入18g琼脂粉和20g葡萄糖，溶解后定容至1000mL，高压灭菌20min，每个培养皿分装20mL，得到PDA培养基。
[0030]实施例1一种诱导可可孢产生分生孢子的方法
[0031]一种诱导可可孢产生分生孢子的方法，包括如下步骤：
[0032]1、可可孢菌种活化
[0033]将可可孢菌株CSS-01s(Yan，J Y.，Xie，Y.，Zhang，W.et al.Species of Botryosphaeria ceae involved in g ra pevine d ie back in China.Fungal Diverisity.2013，61：221-236.)保存于4℃冰箱，使用时用灭菌牙签取适量菌丝置于PDA培养基上，用parafilm封口膜将培养皿封好后倒置放入28℃恒温培养箱中活化3天，得到活化的可可孢，待用。
[0034]2、产孢培养基的制备
[0035]取琼脂20g，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌锅灭菌20min，得到灭菌的水琼脂培养基；
[0036]将田间采集的当年生夏黑葡萄绿枝条(直径3-5mm)切4-6cm小段，用皮筋捆成一捆放入铁盒中，121℃高压灭菌锅灭菌20min，置于90℃烘箱2h烘干，得到灭菌的葡萄枝条；[0037]每直径9cm的灭菌皿中加20g灭菌的水琼脂培养基和0.8g灭菌的葡萄枝条，使葡萄枝条大部分暴露在水琼脂培养基的外面，超净工作台中使水琼脂培养基凝固，即得到产孢培养基。
[0038]3、可可孢接种
[0039]用4mm灭菌打孔器在已活化的可可孢菌落边缘打取菌饼，取一个菌饼用灭菌牙签接种于产孢培养基中间(图1)，用parafilm封口膜将培养皿封好后放入28℃恒温培养箱中，14h光照10h黑暗条件下培养9天。实验设三次重复，每次重复3个培养皿。其中，图2给出了培养1天后的菌落形态，图3给出了培养9天后产孢培养基的菌落形态，从图中可以看出有部分白小点溢出(分生孢子)以及黑的分生孢子器。
[0040]4、洗孢计数
[0041]将5mL无菌水加入产孢培养基中，用一次性灭菌涂布器轻磨枝条上的菌落，碾碎分生孢子器，用双层灭菌擦镜纸过滤，洗下分生孢子，在光学显微镜下计量分生孢子数。[0042]经计量，本实施例得到的可可孢产孢量为6.82×104个/cm2，所述“cm2”指暴露在水琼脂培养基外面的葡萄枝条的表面积。
[0043]实施例2一种诱导可可孢产生分生孢子的方法
[0044]一种诱导可可孢产生分生孢子的方法，与实施例1的区别在于步骤3中“用parafilm封口膜将培养皿封好后放入28℃恒温培养箱中，14h光照10h黑暗条件下培养9天”替换为“用parafilm封口膜将培养皿封好后放入28℃恒温培养箱中，14h光照10h黑暗条件下培养11天”，其它与实施例1完全相同。结果如图5所示。
[0045]经计量，本实施例得到的可可孢产孢量为1.28×105个/cm2，所述“cm2”指暴露在水琼脂培养基外面的葡萄枝条的表面积。
[0046]实施例3一种诱导可可孢产生分生孢子的方法
[0047]一种诱导可可孢产生分生孢子的方法，与实施例1的区别在于步骤3中“用parafilm封口膜将培养皿封好后放入28℃恒温培养箱中，14h光照10h黑暗条件下培养9天”替换为“用parafilm封口膜将培养皿封好后放入28℃恒温培养箱中，14h光照10h黑暗条件下培养13天”，其它与实施例1完全相同。结果如图6所示。
[0048]经计量，本实施例得到的可可孢菌产孢量为2.20×105个/cm2，所述“cm2”指暴露在水琼脂培养基外面的葡萄枝条的表面积。
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