(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610089929.5
(22)申请日 2016.02.18
(83)生物保藏信息
CGMCC No.11906 2016.01.27
(71)申请人 天津泰创生物科技有限公司
地址 301906 天津市蓟县上仓酒业及绿
食品加工区内
(72)发明人 张玫 马骉 姜桂荣 孔双泉
(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人 王文君
(51)Int.Cl.
C12N 1/14(2006.01)
C12N 13/00(2006.01)
C12N 15/01(2006.01)
C12P 21/00(2006.01)C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种薄芝糖肽生产菌，其是以野
生薄树芝为出发菌株，以野生菌株的原生质体为
菌丝体和糖肽含量均有大幅提高的一株薄芝糖
肽生产菌，保藏编号为CGMCC NO.11906，其发酵 后的菌丝体生物量达到9.75mg/ml，多糖含量达
到0.89mg/ml，多肽含量达到0.174mg/ml，分别比
野生菌株提高了116.4％、128.2％和102.3％，薄
芝糖肽的产量是野生菌株的2倍以上，且遗传稳
定性可保持8代以上。利用该突变薄树芝菌株进
行液体深层发酵生产的薄芝糖肽，可应用于含有
薄芝糖肽成分的药品、保健品和化妆品等生产和
加工领域，
具有重要的经济价值和社会价值。权利要求书1页 说明书8页CN 105733956 A 2016.07.06
C N 105733956
A
1.一种薄芝糖肽生产菌，其为薄树芝的突变菌株SSYY-BZ-ARTP36，该突变菌株是以野生薄树芝的原生质体为材料，经过多次ARTP诱变和紫外诱变选育后获得，保藏编号为CGMCC NO.11906。
2.权利要求1所述薄芝糖肽生产菌在发酵生产薄芝糖肽中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵时使用的发酵培养基为：葡萄糖25～50g/L，酵母膏15～30g/L，硫酸镁1.5～4g/L，磷酸二氢钠1.5～5g/L，磷酸氢二钠1.5～5g/L，豆油0.5～2g/L，维生素B 10.001～0.003g/L，pH自然。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵时使用的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钠3g/L，豆油1g/L，维生素B 10.001g/L，pH自然。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵条件为：将菌株SSYY-BZ-ARTP36接入发酵培养基中，在25-30℃、80-130r/min下振荡培养，直至菌丝体生长至对数期。
6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵条件为：将菌株SSYY-BZ-ARTP36接入发酵培养基中，在28℃、120r/min下振荡培养，直至菌丝体生长至对数期。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，收集对数期的发酵液，采用分子筛技术分离出薄芝糖肽。 权 利 要 求 书1/1页CN 105733956 A
薄芝糖肽生产菌及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物诱变育种技术领域和微生物发酵领域，具体地说，涉及一种薄芝糖肽生产菌及其应用。
背景技术
[0002]灵芝素有“仙草”之誉，作为药物首载于东汉时期的《神农本草经》，后见于《本草纲目》，是我国中医药宝库中珍贵的药用植物。灵芝属担子菌纲多孔菌科，主要分布在热带和亚热带地区的原始雨林环境中，在中国分布的90多种灵芝中，有15种经临床证明具有药用价值。其中最常见的有赤芝、紫芝、薄树芝和云芝等，薄树芝是灵芝中的优良品种，其主要成分为糖肽，糖基部分主要为葡萄糖和半乳糖以β(1-6)、β(1-4)糖苷键连接，肽链部分主要由丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸等构成。灵芝的药理成分非常丰富，其中主要成分有：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、腺苷和氨基酸等十几种，具有扶正固本、增强免疫、滋补强壮等多方面的生物活性。灵芝不仅具有良好的保健作用，而且能够应用于心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，在抗癌、抑制肿瘤、防治肝脏病变以及多种中老年慢性代谢性疾病的辅助方面具有十分显著的疗效。
[0003]目前我国生产灵芝糖肽主要从灵芝子实体中获得，由于人工养殖灵芝子实体周期较长，工业上多采用深层发酵的方法来获得菌丝体和糖肽。北京赛升药业股份有限公司生
产的薄芝糖肽注射液(国药准字H11022156)是以野生薄树芝[Ganoderma capense (Lloyd)Teng]菌株经液体深层发酵法制得薄树芝菌丝体，再经分子筛技术分离出糖肽制得的无菌水溶液。该药品在临床应用多年，疗效可靠，并且市场需求量十分可观。到目前为止，企业针对该产品的生产工艺，在发酵产 物的分离纯化技术和产品质量控制等方面做了相应的研究，取得了很好的效果。但由于发酵使用的野生株薄芝菌中糖肽的单位产量较低，致使生产成本较高。因此，对菌种进行改良以获得高产高效的优良工业菌株，提高产能，降低成本，满足社会需求具有重大经济效益和社会效益。
[0004]菌种诱变选育技术种类繁多，传统的微生物诱变一般采取物理、化学等方法，紫外线(UV)处理是比较有效的诱变方法之一。但是，这些方法具有费时费力以及诱变结果不具定向性等缺点。随着生命科学技术的发展以及学科交叉的深入，一些行之有效的诱变新技术被应用在微生物菌株选育中。原生质体融合技术(protoplast fusion)就是一项重要的菌种改良技术，是将亲株细胞分别去除细胞壁后在高渗条件下辅以物理、化学或生物手段进行融合，经基因组间的交换重组，获得融合子的过程。通过该技术能够快速地筛选具有亲本特性的优良融合菌株，大幅提高菌种的生物表达量。目前为止该技术已在许多生物的诱变育种中被广泛采用，在丝状真菌中也有成功的报道。ARTP(Atmospheric and Room Temperature Plasma，即常压室温等离子体)技术，是在大气压下温度25-40℃之间、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。该技术是近年来一种新型的微生物诱变育种手段，工作原理是：高纯氦气在高频电场中放电产生等离子体，其富含的高浓度、高能量的活性离子和微生物产生作用可对微生物细胞
及其遗传物质产生影响，如造成遗传物质的损伤、引起细胞膜通透性和蛋白结构的改变等活性粒子对DNA物质的作用可以引起DNA结构的多样性损伤，并诱发细胞启动SOS修复机制。SOS修复为一种高容错率修复，在修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终形成突变位点丰富、遗传稳定的突变株。与传统诱变方法相比，采用ARTP能够有效造成DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株，与分子 操作手段相比，ARTP进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点。近年来该技术已在芽孢杆菌、黑曲霉、酵母的诱变育种中被尝试使用并有成功的报道。
[0005]目前，针对灵芝菌种的诱变育种的研究主要集中在灵芝属的赤芝[Ganoderma lucidum]，使用菌丝体、孢子或原生质体为材料进行的紫外、微波或化学试剂的诱变育种均有成功的报道。然而，对灵芝属薄树芝[Ganoderma capense(Lloyd)Teng]的诱变育种的研究尚属空白。本发明首次将ARPT这项高效诱变技术结合其他诱变手段应用到薄树芝菌种的诱变育种中，摸索诱变条件并选育高产薄芝糖肽的突变株。
发明内容
[0006]本发明的目的是针对现有薄芝糖肽工业化生产中存在的糖肽单位产量低的问题，提供一种通过菌体诱变选育获得优良的薄芝糖肽生产菌株SSYY-BZ-ARTP36及其在发酵生产薄芝糖肽中的应用。
[0007]为了实现本发明目的，本发明提供的薄芝糖肽生产菌，其为薄树芝[Ganoderma capense(Lloyd)Teng]的突变菌株SSYY-BZ-ARTP36，该突变菌株是以野生薄树芝的原生质体为材料，经过多次ARTP诱变和紫外诱变选育后获得的菌丝体和糖肽含量均有大幅提高的一株突变株，其发酵后的菌丝体生物量达到9.75mg/ml，多糖含量达到0.89mg/ml，多肽含量达到0.174mg/ml，分别比野生菌株提高了116.4％、128.2％和102.3％，薄芝糖肽的产量是野生菌株的2倍以上，且遗传稳定性可保持8代以上。
[0008]薄树芝(Ganoderma capense)SSYY-BZ-ARTP36现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.11906，保藏日期2016年1月27日。
[0009]具体的诱变选育步骤如下：
[0010]1、薄树芝菌原生质体的诱变
[0011](1)薄树芝菌原生质体的制备：将出发菌用种子培养基培养，过滤获得新鲜的薄树芝菌菌丝体，加入用高渗缓冲液溶解的溶壁酶恒温处理一定时间(1.5～3.5h)，用高渗缓冲液洗涤反应液并制得原生质体悬液，在显微镜下进行原生质体计数，按照计数结果将原生质体溶液稀释到使用浓度5×105～5×107个/ml。
[0012](2)ARTP诱变处理：将薄树芝菌原生质体悬液，用ARTP诱变系统进行处理，电源功率115W，高纯氦气的气流量10L/min，照射距离1-2mm，处理样品5-10μL(悬液密度5×106～5×107个/ml)，处理时间10s-4min。
[0013](3)紫外诱变处理：将薄树芝菌原生质体悬液，用UV-3000型紫外分析仪(购自上海杰涵实验设备有限公司)进行紫外照射处理，照射强度范围15w～30w，照射距离20～40cm，照射时间15s～3min。
[0014]2、薄树芝突变菌株的筛选
[0015](1)初筛：将诱变处理过的原生质体不稀释或适当稀释后混入软琼脂再生培养基，倾倒至再生培养基平板上，置于温室避光环境中培养6～7天。挑取平皿上生长出的单菌落分别接种至新的平皿上，在25-30℃温箱培养6～7天，从新平皿上选取生长活力较高的菌落菌株进行生长情况比较，挑选优势菌株。
[0016](2)摇瓶发酵筛选：
[0017]将筛选的优势菌株接入发酵培养基，25-30℃振荡培养6～7天，通过对发酵液进行菌体生物量测定和糖肽含量检测，筛选出糖肽产量增加最多的突变株，进一步考察其遗传稳定性。
[0018]检测方法：
[0019] a.菌体生物量测定：取50ml发酵培养液，过滤菌丝并用蒸馏水洗涤。在60℃干燥器中烘至恒重，在干燥器中冷却至常温称重。
[0020] b.多糖测定：
[0021]对照品溶液的制备：取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖约0.1g， 精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0022]标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述5个浓度的对照品溶液各1ml，分别置具塞试管中，置于冰浴中，分别精密加入蒽酮溶液5ml，摇匀，置水浴准确反应10分钟，取出，用冷水冷却至室温。另精密量取水1ml，同法操作，作为空白溶液。照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IV A)，在620nm的波长处测定吸光度。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。
[0023]测定样品：精密量取待测样品溶液1ml，依次稀释几个浓度置具塞试管中，按照标准曲线制备项下，从“置于冰浴中，分别精密加入蒽酮溶液5ml”开始描述的方法，测定吸光度，从线性回归方程计算待测样品溶液中的多糖含量。
[0024] c.多肽测定：精密量取待测样品溶液1ml，按照蛋白质含量测定法(中国药典2010年版第二部附录
VII M第二法)测定，根据线性回归方程计算供试品溶液中的多肽含量。[0025] d.遗传稳定性检测：将筛选出的突变株连续传代8代，用不同代数的菌种进行发酵培养，检测发酵产物中的菌体生物量和多糖、多肽含量。
[0026]通过以上方法诱变选育出的薄树芝突变菌株可以作为工业化生产菌进行液体深层发酵。
[0027]本发明还提供薄树芝突变菌株SSYY-BZ-ARTP36在发酵生产薄芝糖肽中的应用。[0028]其中，发酵时使用的发酵培养基为：葡萄糖25～50g/L，酵母膏15～30g/L，硫酸镁1.5～4g/L，磷酸二氢钠1.5～5g/L，磷酸氢二钠1.5～5g/L，豆油0.5～2g/L，维生素B1 0.001～0.003g/L，pH自然。
[0029]优选地，发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁 1.5g/L，磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钠3g/L，豆油1g/L，维生素B1 0.001g/L，pH自然。
[0030]发酵条件为：将菌株SSYY-BZ-ARTP36接入发酵培养基中，在25-30℃、80-130r/min 下振荡培养，直至菌丝体生长至对数期。收集对数期的发酵液，采用分子筛技术分离出薄芝糖肽。
[0031]优选地，发酵条件为：将菌株SSYY-BZ-ARTP36接入发酵培养基中，在28℃、120r/
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