(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710106474.8
(22)申请日 2017.02.27
(71)申请人 苏州引航生物科技有限公司
地址 215021 江苏省苏州市苏州工业园区
星湖街218号C13栋4楼
(72)发明人 谢新开 徐伟 刘婷
(74)专利代理机构 北京汇信合知识产权代理有
限公司 11335
代理人 夏静洁
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12P 13/06(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称
应用
(57)摘要
本发明的L-高丝氨酸生产菌株中的一个或
或弱化，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代
谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者
一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因
被突变。本发明还提供了该生产菌株的构建方法
以及其应用。本发明的L-高丝氨酸生产菌株，具
有产量高、成本低、条件温和、环境污染少等诸多
优点，
具有广阔的应用前景。权利要求书1页 说明书9页序列表5页CN 108504613 A 2018.09.07
C N 108504613
A
1.一种L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，所述L-高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；其中，所述被敲除或弱化的基因为thrB、thrL中的一个或两个；所述被突变的基因为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；所述被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于，所述L-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。
3.一种权利要求1或2所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤中一步或多步：
A、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；
B、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强；
C、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；
D、将含有L-高丝氨酸代谢途径中敲除或被弱化和/或过表达或增强和/或突变关键基因的重组质粒转入菌株中，即获得了L-高丝氨酸生产菌株。
4.根据权利要求3所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤A中所述的被敲除或弱化的基因为thrB、thrL中的一个或两个；
所述步骤B中所述的被突变的基因为thrA，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；
所述步骤C中所述的被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。
5.根据权利要求3或4中所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤D中所述的菌株为大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。
7.权利要求1或2中所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸领域的应用。
8.一种生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取权利要求1或2中所述的L-高丝氨酸生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，培养8-16h后，再将其接种至种子培养基，培养7-12h后，最后，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述L-高丝氨酸。
9.根据权利要求8中所述的生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，进行发酵时，维持温度在37±5℃、溶氧在30-40％，发酵液的pH值在7.0±0.5。
10.根据权利要求8或9中所述的生产L-高丝氨酸的方法，其特征在于，所述斜面培养基为LB培养基；所述种子培养基为TB培养基；所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖5-15g/L，玉米浆15-25g/L ，糖蜜12-18g/L，甜菜碱0.1-0.5g/L ,(NH 4)2SO 41-5g/L，KCl 1-5g/L，MgSO 4·7H 2O 0.5-3g/L，MnSO 4·H 2O 0.01-0.1g/L，其余为水。
权 利 要 求 书1/1页CN 108504613 A
一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用。
背景技术
[0002]L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于L-高丝氨酸具有L-型-α氨基酸基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，L-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。
[0003]目前，国内外生产L-高丝氨酸主要有以下几种方法：
[0004](1)化学法；该方法合成L-高丝氨酸主要是采用相对昂贵的L-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好；
[0005](2)化学手性拆分方法；该方法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出L-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大量有机溶剂，对环境有较大污染威胁。
[0006](3)生物法；目前主要见报导的是生物酶法，其工艺是利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和L-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该工艺主要问题仍然是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，
并需使用价格昂贵的辅酶等。
[0007]微生物发酵法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，由于高丝氨酸对于细菌生长具有较强的抑制作用(可能是源于其对谷氨酸脱氢酶活性抑制作用，J Bacteriol.1973Nov；116(2):663-72)，对L-高丝氨酸的直接发酵生产具有挑战性。因此，目前尚未探索出合适的通过发酵获得L-高丝氨酸的方法。
发明内容
[0008]本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种L-高丝氨酸生产菌株。
[0009]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建L-高丝氨酸生产菌株的方法。[0010]本发明要解决的第三个技术问题是现有技术中的生产L-高丝氨酸的方法存在生产成本高、污染大、产率低的问题，进而提供一种可实现低成本、高产量、条件温和、环境污染少的生产L-高丝氨酸的方法。
[0011]本发明的L-高丝氨酸生产菌株，所述L-高丝氨酸生产菌株中的一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强，并且/或者一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；
[0012]其中，所述被敲除或弱化的基因为thrB、thrL中的一个或两个；所述被突变的基因为thrA*，且所
述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；所述被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。
[0013]优选地，所述thrA*为thrA*(G433R)；
[0014]具体而言：所述thrB基因的敲除或弱化可阻断或减弱L-高丝氨酸往L-苏氨酸的转化，从而提高L-高丝氨酸的产量；
[0015]所述thrL基因为编码前导肽基因，其敲除或弱化可去除或减弱了转录衰减调控，保证thrA基因的转录效率；
[0016]所述thrA基因的突变可引入抑制产物的反馈抑制，解除产物的反馈抑制；所述rhtA基因的过表达或增强表达可提高L-高丝氨酸生产菌株对L-高丝氨酸的外运能力，同时提高L-高丝氨酸生产菌株对L-高丝氨酸的耐受性；
[0017]所述ppc、pntAB、thrA*、asd基因均属于用以糖酵解、天门冬氨酸合成以及还原性辅酶循环转化等、与天门冬氨酸或苏氨酸发酵相关的基因，其过表达或增强表达可增强从葡萄糖到L-高丝氨酸的合成途径；
[0018]所述thrB的R235H突变体可消除苏氨酸合成缺陷所带来的潜在的菌体生长问题。[0019]优选地，
所述L-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。
[0020]本发明还提供了所述的L-高丝氨酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中一步或多步：
[0021]A、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；
[0022]B、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被过表达或增强；
[0023]C、L-高丝氨酸生产菌株中一个或多个与L-高丝氨酸代谢途径相关的基因被突变；[0024]D、将含有L-高丝氨酸代谢途径中敲除或被弱化和/或过表达或增强和/或突变关键基因的重组质粒转入菌株中，即获得了L-高丝氨酸生产菌株。
[0025]优选地，所述步骤A中所述的被敲除或弱化的基因为thrB、thrC、thrL中的一个或多个；
[0026]所述步骤B中所述的被突变的基因为thrA*，且所述thrA*具有抑制产物的反馈抑制的特性；
[0027]所述步骤C中所述的被过表达或增强的基因为rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一个或多个。
[0028]优选地，所述步骤D中所述的菌株为大肠杆菌。
[0029]进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型MG1655。
[0030]本发明所述的L-高丝氨酸生产菌株在生产L-高丝氨酸领域的应用。
[0031]本发明还提供了一种生产L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
[0032]取权利要求1或2中所述的L-高丝氨酸生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，培养8-16h后，再将其接种至种子培养基，培养7-12h后，最后，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述L-高丝氨酸。
[0033]优选地，进行发酵时，维持温度在37±5℃、溶氧在30-40％，发酵液的pH值在7.0±
0.5。
[0034]优选地，所述斜面培养基为LB培养基；所述种子培养基为TB培养基；所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖5-15g/L，玉米浆15-25g/L，糖蜜12-18g/L，甜菜碱0.1-0.5g/L, (NH4)2SO41-5g/L，KCl 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-3g/L，MnSO4·H2O 0.01-0.1g/L，其余为水。
[0035]本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
[0036](1)本发明对于L-高丝氨酸代谢途径相关的特定基因进行改造，可实现截断苏氨酸合成途径中高丝氨酸的下游途径、增强上游相关生物合成基因、弱化分支代谢途径的技术效果，由此得到高产的L-高丝氨酸的生产菌株；
[0037](2)本发明的技术方案在构建L-高丝氨酸的生产菌株时，采用的手段具体包括敲除(或弱化)染体上编码高丝氨酸激酶的天然基因thrB、过表达L-高丝氨酸产物泵出基因，由此得到能耐受L-高丝氨酸并不代谢L-高丝氨酸的菌株；还包括通过基因工程修饰或增强原有菌种中编码糖酵解以及天门冬氨酸、部分苏氨酸生物合成的相关基因，使得菌种自发合成L-高丝氨酸；
[0038](3)本发明所构建的L-高丝氨酸生产菌株在发酵过程中，仅以葡萄糖为唯一碳源，辅以低成本氮源，在不需要添加任何氨基酸的发酵条件下，就能够实现发酵过程中L-高丝氨酸的有效积累，具有广阔的工业应用前景；
[0039](4)本发明的L-高丝氨酸的方法，相较于化学法、化学手性拆分法、生物法生产L-高丝氨酸，具有产量高、成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点。
具体实施方式
[0040]实施例1-中均采用大肠杆菌MG1655构建L-高丝氨酸生产菌株，对所述大肠杆菌基因组中的基因进行敲除和编辑主要是基于Lambda-Red重组、FLP-FRT重组和CRISPR/Cas9技术。可参考的文献Lambda Red RecombinationOne-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A.2000Jun 6；97(12):6640-5.和Development of a fast and easy method for Escherichia coli genome editing with CRISPR/Cas9.Microb Cell Fact.2016Dec 1；
15(1):205.。
[0041]实施例1敲除thrB基因的菌株MG1655(ΔthrB)的构建
[0042]本实施例构建的L-高丝氨酸生产菌株为thrB基因被敲除的菌株MG1655(ΔthrB)，其构建方法可参考文献:Proc Natl Acad Sci U S A.2000Jun 6；97(12):6640-5，具体包括如下步骤：
[0043](1)以pΔthrB-H1-f/pΔthrB-H2-r为引物、以包含卡纳抗性盒的质粒为模板，进行PCR扩增，并胶回收、纯化该两侧带有thrB同源臂和FRT位点的含卡纳抗性的线性DNA片段；
[0044]所述引物pΔthrB-H1-f具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述引物pΔthrB-H2-r 具有如SEQ ID No.2所示的序列，具体如下：
[0045]SEQ ID No.1:5’-TGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTTTGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCGAAG-3’
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