(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010959757.9
(22)申请日 2020.09.14
(71)申请人 江苏省奥谷生物科技有限公司
地址 213300 江苏省常州市溧阳市经济开
发区康平路17号
(72)发明人 刘翔 唐谋 田淑芳
(74)专利代理机构 广州市百拓共享专利代理事
务所(特殊普通合伙) 44497
代理人 卢刚
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 9/24(2006.01)
C12R 1/265(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及了一种菌发酵生产酶的培养基
及培养方法，更具体地，涉及一种玫瑰微球菌
发酵生产海藻糖酶的培养基及培养方法。所述发
酵培养基的组成成分为海藻糖、酵母浸粉、KCL、
KH 2PO 4和VB 1，培养基pH为5.6～7.5，发酵所使用
的菌种为通过平板划线分离法分离纯化后的玫
瑰微球菌，先将所述玫瑰微球菌接种于液体
培养基，制得发酵种子液；再将发酵种子液接种
于发酵培养基中，所得发酵液经过离心超滤制得
粗酶液。通过本方法发酵得到的海藻糖酶具有更
高的酶活性，在工业和医学应用中具有广阔的前
景。权利要求书1页 说明书8页 附图1页CN 112080448 A 2020.12.15
C N 112080448
A
1.一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基，其特征在于，所述的培养基含有：海藻糖25～40g/L、酵母浸粉8～15g/L、KCL0.2～0.4g/L、KH 2PO 40.25～0.5g/L、VB 10.1～0.3g/L，培养基起始pH为5.6～7.5。
2.根据权利要求1所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基，其特征在于，所使用的菌种需通过平板划线分离法进行分离纯化。
3.根据权利要求1所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基，其特征在于，培养基组分为海藻糖30g/L、酵母浸粉8g/L、KCL0.35g/L、VB 10.15g/L，pH7.5。
4.一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
(1)采用菌种为玫瑰微球菌，先将所述玫瑰微球菌接种于液体培养基，制得发酵种子液；
(2)将制得的发酵种子液接种于如权利要求1所述的培养基中，于35～38℃、150～200rpm条件下培养25～40h得到发酵液；
(3)离心后取上清液，在25～30℃，0.1mpa的条件下超滤得到粗酶液，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比法测定产生的海藻糖酶的酶活。
5.根据权利要求4所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中液体培养基为自然pH，并加入抗生素去除杂菌。
6.根据权利要求4所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中种子液接种量为3％(v/v)，在36℃、180rpm条件下培养35h。
7.根据权利要求4所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中上清液在4℃、4000rpm离心10min得到，超滤膜截留分子量为10Kda。
权 利 要 求 书1/1页CN 112080448 A
一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法
技术领域
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种菌发酵生产海藻糖酶的培 养基及方法。
背景技术
[0002]玫瑰微球菌是革兰氏阳性菌，为较大球状菌，直径0.5-3.5um，其特征是 可以向几个平面分裂，形成规则或是不规则的立方堆，没有休眠期，好氧或兼 性厌氧，可用作海藻糖酶产生菌种。
[0003]海藻糖酶于1893年首先在黑曲霉中发现，是一种专一性催化海藻糖水解的 酶，属于葡萄糖苷酶的一种，广泛存在于昆虫、哺乳动物、微生物和植物中， 对海藻糖有特异作用，能将海藻糖水解成2个分子的葡萄糖单糖。葡萄糖是生物 体内新陈代谢不可缺少的营养物质，在食品、发酵工业上都可直接使用；微生 物的生长需要合适的碳氮比，葡萄糖作为微生物的碳源，是发酵培养基的主料， 如抗生素、维生素、氨基酸、酶制剂等都需大量使用葡萄糖，同时也可用作微 生物多聚糖和有机溶剂的原料；目前结晶葡萄糖主要用于食品行业，随着生活 水平的提高和食品行业科技的不断发展，葡萄糖的应用越加广泛。[0004]目前海藻糖酶的来源匮乏，主要来源于昆虫、植物、酵母等生物，但现阶 段与其相关的文献报道都较为少见，因海藻糖酶能专一将海藻糖转化成两分子 的葡萄糖，使其在工业和医学都具有非常可观的使用前景；在糖加工工业中， 通常使用酶法生产高纯度麦芽糖，但在此过程中会产生少量海藻糖，降低了麦 芽糖的纯度，因海藻糖是非还原糖，所以加入海藻糖酶将其转化成两分子的葡 萄糖既能提高 麦芽糖的纯度，又能充分利用海藻糖节约原料，所以研究海藻糖 酶酶活能提升此转化过程中海藻糖的利用率，提高葡萄糖的产量，对糖工业中 葡萄糖、麦芽糖的生产十分具有实用价值。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法。为实现 上述目的，本发明首先提供一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基，所述的培养基 含有：海藻糖25～40g/L、酵母浸粉8～15g/L、KCL0.2～0.4g/L、KH2PO40.25～0.5g/L、 VB10.1～0.3g/L，培养基起始pH为5.6～7.5。
[0006]进一步优选的，所使用的菌种需通过平板划线分离法进行分离纯化。
[0007]进一步优选的，所述发酵培养基组分为海藻糖30g/L、酵母浸粉8g/L、 KCL0.35g/ L、VB10.15g/L，pH7.5，以海藻糖作为碳源加入培养基中不仅可以满 足玫瑰微球菌生长的营养需求，还能进一步诱导玫瑰微球菌发酵产生海藻 糖酶，使菌丝生长速度加快，增强了玫瑰微球菌在培养过程中应对环境胁迫 的能力，酶活显著提高。
[0008]其次，本发明还提供一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，海藻糖所述方法包 含以下步骤：
[0009](1)采用菌种为玫瑰微球菌，先将所述玫瑰微球菌接种于液体培养基， 制得
发酵种子液；
[0010](2)将制得的发酵种子液接种于如权利要求1所述的培养基中，于35～38℃、 150～200rpm条件下培养25～40h得到发酵液；
[0011](3)离心后取上清液，在25～30℃，0.1mpa的条件下超滤得到粗酶液，采 用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比法测定产生的海藻糖酶的酶活。
[0012]进一步优选的，所述步骤(1)中液体培养基为自然pH，并加入抗生素去 除杂菌。[0013]进一步优选的，所述步骤(2)中种子液接种量为3％(v/v)，在36℃、180rpm 条件下培养35h。
[0014]进一步优选的，所述步骤(3)中上清液在4℃、4000rpm离心10min得到， 超滤膜截留分子量为10Kda。
[0015]采用本发明优化后的培养基以及方法，能使玫瑰微球菌发酵产出更多海 藻糖酶，酶活能达到20U/ml以上；且实验周期较短，条件简易可控。
具体实施方式
[0016]本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于 下列实施例，本发明还可通过不同的实施方式加以实现或运用，本领域普通技 术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明 保护的范围。
[0017](1)基础培养基的配制：取海藻糖30g/L、酵母浸粉10g/L、KCL0.3g/L、 KH2PO40.3g/ L、VB10.2g/L，自然pH，1.0mpa下灭菌25min，降至室温后加入已 用无菌水配制好的抗生素进行预处理去除其他杂菌。
[0018](2)发酵种子液的制备：将通过平板划线法分离纯化后的玫瑰微球菌 (ATCC 9815)接种于(1)中的基础培养基，在摇床中30℃，200rpm富集培养 48h后制得种子液。[0019](3)发酵液的制作：将(2)中的种子液3％(v/v)接种于发酵培养基中， 培养基含有海藻糖25～40g/L、酵母浸粉8～15g/L、KCL0.2～0.4g/L、 KH2PO40.25～0.5g/L、VB10.1～0.3g/L，培养基起始pH为5.6～7.5，于35～38℃、 150～200rpm条件下培养25～40h得到发酵液。
[0020](4)酶液的制备：取(3)中所得发酵液以4℃、4000rpm离心10min，得 到的上清液在25～30℃，0.1mpa的条件下通过截留分子量为10Kda的超滤膜， 制得粗酶液，保存待用。[0021](5)酶活的测定：
[0022]采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比法测定产生的葡萄糖的含量，方法如 下：取105℃干燥至恒重的分析纯的海藻糖配制成5％的水溶液作为酶活待测底 物；取2支试管，分别为实验组和对照组，前者加入2mL酶液和2mL底物溶液， 后者加入2mL酶液和2mLpH6.5的PBS 缓冲液；37℃反应15min，再各加入3mL 的DNS试剂，沸水浴5min终止反应，置于冰水混合物中冰浴2min，冷却后用 水补足到10mL；取反应后的混合液在540nm处测定其吸光度值。[0023]酶活定义：在上述实验条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量为1 个海藻糖酶活力单位(U)。
[0024]DNS试剂的配制：将含有182g酒石酸钾钠的500mL热水溶液中加入 6.3gDNS和262mL2mol/LNaOH，再加入5g苯酚和5gNaHSO3，搅拌溶解，待 冷却后加水定容至1000mL，将配制好的DNS试剂贮于棕瓶中避光保存，放 置7～10天备用。
[0025](6)制作标准曲线：分别准确称取葡萄糖标准液(1mg/mL)0、0.1、0.3、 0.5、0.7、
0.9、1.0mL，加入蒸馏水补足至1mL，分别加入2mlDNS试剂，沸水 浴5min终止反应，置于冰水
混合物中冰浴2min，用水补足到10mL，在540nm 处测定其吸光度值。
[0026]实施例1
[0027]单因素实验确定培养基最优成分
[0028](1)基础培养基的配制：取海藻糖30g/L、酵母浸粉10g/L、KCL0.3g/L、 KH2PO40.3g/
L、VB10.2g/L，自然pH，1.0mpa下灭菌25min，降至室温后加入已 用无菌水配制好的抗生素
进行预处理去除其他杂菌。
[0029](2)发酵种子液的制备：将通过平板划线法分离纯化后的菌种接种于(1) 中的基
础培养基，在摇床中30℃，200rpm富集培养48h后制得种子液。
[0030](3)发酵液的制作：将(2)中的种子液3％(v/v)接种于发酵培养基中， 培养基含有
海藻糖25～40g/L、酵母浸粉8～15g/L、KCL0.2～0.4g/L、 KH2PO40.25～0.5g/L、VB10.1～
0.3g/L，培养基起始pH为5.6～7.5，于35～38℃、 150～200rpm条件下培养25～40h得到发
酵液。
[0031](4)酶液的制备：取(3)中所得发酵液以4℃、4000rpm离心10min，得 到的上清液在
25～30℃，0.1mpa的条件下通过截留分子量为10Kda的超滤膜， 制得粗酶液，保存待用。
[0032](5)酶活的测定：
[0033]采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比法测定产生的葡萄糖的含量，方法如 下：取105
℃干燥至恒重的分析纯的海藻糖配制成5％的水溶液作为酶活待测底 物；取2支试管，分别
为实验组和对照组，前者加入2mL酶液和2mL底物溶液， 后者加入2mL酶液和2mLpH6.5的PBS
缓冲液；37℃反应15min，再各加入3mL 的DNS试剂，沸水浴5min终止反应，置于冰水混合物
中冰浴2min，冷却后用 水补足到10mL；取反应后的混合液在540nm处测定其吸光度值。
[0034](6)不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产海藻糖酶的影响
[0035](a)不同碳源对产海藻糖酶的影响，在含有酵母浸粉10g/L、K C L0.3g/L、
KH2PO40.3g/L、VB10.2g/L、起始pH为7.0的培养基中分别添加30g/L的海藻糖、 蔗糖、麦芽
糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉，灭菌后将(2)中的种子液3％(v/v) 接种于培养基中，于35℃、
200rpm条件下培养35h得到发酵液，后续如步骤(4)、 (5)处理测定酶活，重复实验三次取平
均值，结果见表1。
[0036](b)不同氮源对产海藻糖酶的影响，在含有海藻糖30g/L、KCL0.3g/L、KH2PO40.3g/
L、VB10.2g/L、起始pH为7.0的培养基中分别添加10g/L的酵母浸 粉、蛋白胨、甘氨酸、(NH4)
HPO4、NaNO3、NH4NO3，灭菌后将(2)中的 种子液3％(v/v)接种于培养基中，于35℃、200rpm条2
件下培养35h得到发酵 液，后续如步骤(4)、(5)处理测定酶活，重复实验三次取平均值，结
果见表2。
[0037](c)不同金属离子对产海藻糖酶的影响，在含有海藻糖30g/L、 KH2PO40.3g/L、
VB10.2g/L、起始pH为7.0的培养基中分别添加0.3g/L的 FeCl3·6H2O、NaCl、MgSO4、CaCl2、MnCl2·4H2O、KCl，灭菌后将(2)中的 种子液3％(v/v)接种于培养基中，于35℃、200rpm条件下培养35h得到发酵 液，后续如步骤(4)、(5)处理测定酶活，重复实验三次取平均值，结果见表3。
[0038](d)不同维生素对产海藻糖酶的影响，在含有海藻糖30g/L、酵母浸粉10g/L、
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