(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011124579.4
(22)申请日 2020.10.20
(71)申请人 天津贝猫科技有限公司
地址 301700 天津市武清区下朱庄街道龙
湾城龙吉园28号楼1单元301室
(72)发明人 张士方 刘静
(74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代
理事务所 12201
代理人 陆艺
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6804(2018.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种核酸检测方法，包括如下
步骤：合成目标核酸或从待测生物样本中获取含
目标核酸的待测物；获得捕获有目标核酸的固相
支持物；将带有酶标记的特异性抗体加入到抗体
稀释液中，滴加到获得的捕获有目标核酸的固相
支持物上，孵育，得到第一种固相支持物；将含有
酶的底物的检测液滴加到的第一种固相支持物
上，所述酶的底物与酶进行化学发光反应或进行
显反应，得到第一产物，用酶标仪检测第一产
物信号，根据信号强弱判断待检测核酸的含量。
本发明的方法灵敏度高：最低可以检测单个分子
的DNA和RNA或低于1pM miRNA，特异性高，抗干扰
性强，快速，高通量，操作简单，成本低，可应用于
各类核酸检测试剂盒的制备。
权利要求书3页 说明书12页序列表16页 附图5页CN 112226485 A 2021.01.15
C N 112226485
A
1.一种核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)合成目标核酸或从待测生物样本中获取含目标核酸的待测物
从GenBank检索到目标核酸，从中选出特异性核苷酸序列，并将一部分序列作为捕获功能引物区(5)，另一部分序列作为标记功能引物区(6)； 根据所述捕获功能引物区(5)的序列，设计合成捕获功能区引物(1)，捕获功能区引物(1)包括A段和B段，所述A段的序列与捕获功能引物区(5)的序列互补；
根据所述标记功能引物区(6)的序列，设计合成标记功能区引物(2)，标记功能区引物包括C段和D段，所述C段的序列与标记功能引物区(6)的序列互补；
将氨基修饰的通用引物(4)通过交联吸附法与固相支持物(3)结合，形成包被有通用引物的固相支持物；所述通用引物的序列与所述捕获功能区引物(1)的B段的序列互补；
2)将所述待测物或目标核酸与所述捕获功能区引物(1)和标记功能区引物(2)一起放入杂交缓冲液中，混合均匀，滴加到所述包被有通用引物的固相支持物上，孵育，弃去液体，用杂交洗液洗涤，弃去液体，获得捕获有目标核酸的固相支持物(14)；
3)采用下述两种方式之一种进行：
方式一：
将带有酶(8)标记的特异性抗体(7)加入到抗体稀释液中，混合均匀，滴加到步骤2)获得的捕获有目标核酸的固相支持物(14)上，孵育，弃去液体，用抗体洗液洗涤，弃去液体，得到第一种固相支持物(15)；
将含有酶的底物(10)的检测液滴加到的第一种固相支持物(15)上，所述酶的底物与酶进行化学发光反应或进行显反应，得到第一产物(17)，用酶标仪检测第一产物信号，根据信号强弱判断待检测核酸的含量。
方式二：
a将特异性抗体(7)加入到抗体稀释液，混合均匀，滴加到步骤2)获得的捕获有目标核酸的固相支持物(14)，孵育，弃去液体，用抗体洗液洗涤，弃去液体；
b将带有酶(8)标记的二抗(9)加入到抗体稀释液中，混合均匀，滴加到步骤a获得的固相支持物上，孵育，弃去液体，用抗体洗液洗涤，弃去液体，得到第二种固相支持物(16)；
将含有酶的底物(10)的检测液滴加到第二种固相支持物(16)上，所述酶的底物与酶进行化学发光反应或进行显反应，得到第二产物(18)，用酶标仪检测第二产物信号，根据信号强弱判断待检测核酸的含量。
2.一种核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)合成目标核酸或从待测生物样本中获取含目标核酸的待测物；
从GenBank检索到目标核酸，从中选出特异性核苷酸序列，并将一部分序列作为捕获功能引物区(5)，另一部分序列作为标记功能引物区(6)；
根据所述捕获功能引物区(5)的序列，设计合成捕获功能区引物(1)，捕获功能区引物包括A段和B段，所述A段的序列与捕获功能引物区(5)的序列互补；
根据所述标记功能引物区(6)的序列，设计合成标记功能区引物(2)，标记功能区引物包括C段和D段，所述C段的序列与标记功能引物区(6)的序列互补；
将氨基修饰的通用引物(4)通过交联吸附法与固相支持物(3)结合，形成包被有通用引物的固相支持物；所述通用引物的序列与所述捕获功能区引物(1)的B段的序列互补；
2)设计合成核酸支链信号放大系统，所述核酸支链信号放大系统包括初级信号放大链(11)，次级信号放大链(12)以及检测引物(13)；初级信号放大链(11)序列包括E段和F段；次级信号放大链(12)序列包括G段和H段；所述E段序列为与所述标记功能区引物(2)的D段序列互补；所述F段的序列能与2-20条次级信号放大链(12)的G段序列互补；所述H段序列与2-20条检测引物(13)序列互补；
3)采用下述两种方式之一种进行：
方式一：
将所述待测物或目标核酸与所述的捕获功能区引物(1)、标记功能区引物(2)、初级信号放大链(11)、次级信号放大链(12)以及检测引物(13)一起放入杂交缓冲液，混合均匀，滴加到所述的包被有通用引物的固相支持物上，孵育，弃去液体，用杂交洗液洗涤，弃去液体，获得含核酸支链信号放大系统的捕获有目标核酸的固相支持物(19)；
方式二：
a将所述待测物或目标核酸与所述捕获功能区引物(1)和标记功能区引物(2)一起放入杂交缓冲液中，混合均匀，滴加到所述包被有通用引物的固相支持物上，孵育，弃去液体，用杂交洗液洗涤，弃去液体；
b将所述初级信号放大链(11)加入杂交缓冲液中，混合均匀，滴加到步骤a获得的固相支持物上，孵育，弃去液体，用杂交洗液洗涤，弃去液体；
c将所述次级信号放大链(12)加入到杂交缓冲液中，混合均匀，滴加到步骤b获得的固相支持物上，孵育，弃去液体，用杂交洗液洗涤，弃去液体；
d将所述检测引物(13)加入到杂交缓冲液中，混合均匀，滴加到步骤c获得的固相支持物上，孵育，弃去液体，用杂交洗液洗涤，弃去液体，获得含核酸支链信号放大系统的捕获有目标核酸的固相支持物(19)；
4)采用下述两种方式之一种进行：
方式一：
将带有酶(8)标记的特异性抗体(7)加入到抗体稀释液中，混合均匀，滴加到步骤2)获得的含核酸支链信号
放大系统的捕获有目标核酸的固相支持物(19)上，孵育，弃去液体，用抗体洗液洗涤，弃去液体，获得第三种固相支持物(20)；
将含有酶的底物(10)的检测液滴加到第三种固相支持物上，所述酶的底物与酶进行化学发光反应或进行显反应，得到第三产物(22)，用酶标仪检测第三产物信号，根据信号强弱判断待检测核酸的含量；
方式二：
a将特异性抗体(7)加入到抗体稀释液，混合均匀，滴加到步骤3)获得的含核酸支链信号放大系统的捕获有目标核酸的固相支持物(19)上，孵育，弃去液体，用抗体洗液洗涤，弃去液体；
b将带有酶(8)标记的二抗(9)加入到抗体稀释液中，混合均匀，滴加到步骤a获得的固相支持物上，孵育，弃去液体，用抗体洗液洗涤，弃去液体，获得第四种固相支持物(21)；
将含有酶的底物的检测液滴加到第四种固相支持物(21)上，所述酶的底物与酶进行化学发光反应或进行显反应，得到第四产物(23)，用酶标仪检测第四产物信号，根据信号强弱判断待检测核酸的含量。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征是所述酶为碱性磷酸酶或辣根氧化酶。
4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于所述待测生物样本选自血液、粘液、尿液、粪便、细胞或组织。
5.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于所述固相支持物为聚苯乙烯微孔板、尼龙膜、纤维素膜和聚偏二氟乙烯膜中的一种。
6.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于所述氨基修饰的通用引物通过交联吸附法与固相支持物结合的步骤为：将氨基修饰的通用引物与化学交联剂一起加入到PBS缓冲液，反应后，加入乙醇得到沉淀，离心后弃去液体，将离心得到的沉淀用PBS溶解，再加入含氨基的蛋白或多肽，混合均匀，滴加到固相支持物上，孵育，弃去液体，用PBS缓冲液洗涤，弃去液体。
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸检测方法。
背景技术
[0002]目前检测核酸的主流方法是PCR技术、基因芯片和测序技术。其中，基因芯片和测序技术用于大量基因的检测，对仪器、操作人员以及数据分析的要求比较高，且需要其他的实验来验证，普通实验室无法独立完成。PCR技术适合一种或多种核酸的检测，是实验室常用的技术手段，也被广泛地应用于临床上，对多种疾病、细菌感染和病毒感染进行快速诊断。由于PCR技术需要使用引物对核酸序列的其中一个片段进行扩增，所以要求扩增的片段是完整的。若样本中的核酸序列断裂、降解或发生变异，则无
法与引物结合，从而导致假阴性结果。尤其是RNA，在一般的环境和运输保存中极易降解，使得PCR容易产生假阴性的结果。另外，很多样本如粪便中含有PCR酶抑制物，会严重影响PCR的扩增效率。因此，PCR技术具有其固有的不确定性。
[0003]目前基于杂交捕获进行核酸检测技术有bDNA和HC2两种。
[0004]bDNA(branched DNA，bDNA)技术根据固相杂交的原理，采用人工合成的可结合多个酶标记物的分支DNA，在目标核酸序列不扩增的情况下，放大检测信号，从而提高灵敏度，克服了PCR技术中的不确定因素。bDNA方法已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于艾滋病毒(HIV)和丙肝病毒(HCV)检测，但是该方法涉及到酶标记探针的合成，价格昂贵，而且耗时长，大约需要16小时。
[0005]HC2是美国马里兰州的分子诊断公司Digene(后被Qiagen公司收购)推出的第二代杂交捕获技术，通过将RNA探针与单束DNA杂交，随后利用ELISA化学发光检测RNA和DNA形成的杂交物。基于HC2的人乳头瘤病毒(HPV)检测是目前唯一经美国食品药品监督管理局(FDA)、欧洲CE和中国食品药品监督管理局(SFDA)共同认证的HPV检测技术，准确率高，是公认的HPV DNA检测的金标准。但是，该方法需要合成长链RNA探针，需要两种抗体，步骤复杂，检测成本昂贵。
发明内容
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高灵敏、高通量、操作简便快捷、低成本的核酸检测方法。
[0007]本发明的第二个目的是提供第二种核酸检测方法。
[0008]本发明的技术方案概述如下：
[0009]一种核酸检测方法，包括如下步骤：
[0010]1)合成目标核酸或从待测生物样本中获取含目标核酸的待测物
[0011]从GenBank检索到目标核酸，从中选出特异性核苷酸序列，并将一部分序列作为捕获功能引物区5，另一部分序列作为标记功能引物区6；
[0012]根据所述捕获功能引物区5的序列，设计合成捕获功能区引物1，捕获功能区引物
说 明 书
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