沙氏鹿茸草水提物的制备方法及其应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及沙氏鹿茸草水提物的制备方法及其应用。

背景技术：

2.癌症是人类死亡的主要原因之一。乳腺癌是最常见的癌症，也是女性癌症死亡的主要原因。mcf-7是研究雌激素受体阳性乳腺癌的典型模型，由于它侵入性差，因此被广泛用于增殖研究。mda-mb-231是一种三阴性乳腺癌细胞系，已知具有高度转移性，侵袭性，是适合乳腺癌迁移研究的典型模型。
3.目前，常用的化疗等方法虽然对乳腺癌有一定的疗效，但大多数都有严重的副作用。植物，特别是草药是用于乳腺癌相对安全的有效方法之一。沙氏鹿茸草是一种广泛分布在中国南部省份的植物。据报道，沙氏鹿茸草含有环烯醚萜，苯乙醇和酚类糖苷，具有抗菌、抗炎作用，可能与抗癌作用有关。但迄今为止，还没有关于沙氏鹿茸草抑制乳腺癌的研究报告，沙氏鹿茸草水提物活性成分在抗乳腺癌细胞迁移中的作用也未见报导。

技术实现要素：

4.鉴于此，本发明提出一种沙氏鹿茸草水提物的制备方法及其应用。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.本发明提供一种沙氏鹿茸草水提物在制备抗乳腺癌细胞迁移药物中的应用。
7.进一步说明，所述沙氏鹿茸草水提物在抑制侵袭性乳腺癌细胞mda-mb-231的迁移中的应用。
8.进一步说明，所述沙氏鹿茸草水提物在降低mda-mb-231细胞粘附能力中的应用。
9.进一步说明，所述沙氏鹿茸草水提物在抑制snail、vimentin和caveolin-1蛋白表达中的应用。
10.一种沙氏鹿茸草水提物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
11.(1)取沙氏鹿茸草的地上部分，在35～45℃的烘箱中干燥，并研磨至60～80目的沙氏鹿茸草粉末；
12.(2)将沙氏鹿茸草粉末在蒸馏水中煮沸1.5～2.5小时进行提取，得到提取液：
13.(3)将提取液进行过滤，在35～45℃下进行旋转蒸发，得到沙氏鹿茸草水提物。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
15.本发明提出了沙氏鹿茸草水提物对乳腺癌细胞的细胞毒性和抗细胞迁移作用，通过采用mcf-7和mda-ba-231细胞系研究了沙氏鹿茸草水提物对乳腺癌的影响。结果表明，沙氏鹿茸草水提物对mcf7和mda-mb-231细胞均无细胞毒性，但抑制侵袭性乳腺癌细胞mda-mb-231的迁移，且能降低mda-mb-231细胞的粘附能力。在沙氏鹿茸草水提物处理的mda-mb-231细胞中观察到snail和vimentin的蛋白质水平略有降低，caveolin-1蛋白表达水平明显下降。而且磷酸化erk的水平在mda-mb-231细胞中失调。即，沙氏鹿茸草水提物能通过调节
erk和akt信号通路以及snail、vimentin、caveolin-1的表达抑制乳腺癌细胞的迁移。因此，沙氏鹿茸草水提物对mda-mb-231细胞具有显著的抗迁移活性而无细胞毒性，可有效应用于乳腺癌患者的补充，防止肿瘤发生转移。
附图说明
16.图1为本发明乳腺癌细胞在不同剂量的沙氏鹿茸草水提物处理的细胞存活率的分析图；
17.图2为本发明沙氏鹿茸草水提物处理对乳腺癌细胞细胞周期影响的分析图；
18.图3为本发明沙氏鹿茸草水提物处理对乳腺癌细胞中的与细胞凋亡相关的蛋白表达水平的分析图；
19.图4为本发明沙氏鹿茸草水提物抑制mda-mb-231细胞迁移作用的划痕愈伤试验分析图；
20.图5为本发明沙氏鹿茸草水提物抑制mda-mb-231细胞迁移作用的transwell侵袭试验分析图；
21.图6为本发明沙氏鹿茸草水提物干扰mda-mb-231细胞的细胞粘附能力的分析图；
22.图7为本发明沙氏鹿茸草水提物干扰mda-mb-231细胞的细胞扩散能力的分析图；
23.图8为本发明沙氏鹿茸草水提物处理对mda-mb-231细胞中snail、vimentin和caveolin-1蛋白质表达水平影响的蛋白质杂交分析图；
24.图9为本发明沙氏鹿茸草水提物处理对mda-mb-231细胞中caveolin-1蛋白质表达水平影响的免疫荧光检测分析图；
25.图10为本发明沙氏鹿茸草水提物处理对活化的erk和akt的表达水平的影响分析图。
具体实施方式
26.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
27.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
28.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.本发明通过结晶紫染、划痕愈合和细胞迁移/侵袭实验，分别测定沙氏鹿茸草水提物对乳腺癌细胞的细胞毒性和抗迁移作用。采用流式细胞仪进行细胞周期分析，结晶紫染用于评估细胞粘附和圆形度，western blot(蛋白质杂交)检测caveolin-1、snail和vimentin的表达，并确定mda-mb-231细胞中活化erk和akt的表达水平，通过免疫荧光确认caveolin-1在mda-mb-231细胞中的表达。
30.实施例1-沙氏鹿茸草水提物的制备及细胞培养
31.沙氏鹿茸草(monochasma savatieri franch ex.maxim(orobanchaceae family)采集于中国福建省建瓯市川石村。将沙氏鹿茸草的地上部分在40℃的烘箱中干燥，并研磨成粉60目。将粉末状沙氏鹿茸草在蒸馏水中煮沸2小时进行提取，然后过滤，过滤后的提取物在40℃下进行旋转蒸发。将2g水提物溶解于10ml ddh2o中，配制成0.2g/ml的溶液，用0.22μm过滤器过滤除菌，置于-20℃下储存。
32.mcf7和mda-mb-231细胞购于中国科学院昆明细胞库。在添加了10％胎牛血清
(fbs，gibco，usa)和1％链霉素/青霉素的dmem培养基中培养细胞。在用沙氏鹿茸草水提物(处理细胞时，添加25mm hepes(上海源叶)到细胞培养物中。
33.实施例2-细胞毒性试验及细胞周期分析
34.1.细胞毒性试验
35.将mcf7(每孔4
×
103个细胞)和mda-mb-231(每孔2
×
103个细胞)细胞接种在96孔板中，预培养24h后，加入不同浓度的沙氏鹿茸草水提物处理72小时后，用含有0.05％(w/v)结晶紫(麦克林，中国)、1％(v/v)中性福尔马林和1％甲醇的pbs溶液固定细胞并染2小时。然后，用水洗涤细胞以除去多余的结晶紫并在40℃下干燥2小时。用10％冰醋酸溶解结晶紫，用分光光度计测量波长为590nm处的吸光度。细胞存活率＝a590(样品处理72h)/a590(样品处理0h)*100％。
36.2.流式细胞仪分析细胞周期
37.将6
×
105个细胞接种在60mm培养皿中培养24小时后，分别用含有400μg/ml沙氏鹿茸草水提物、0.1％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(faf-bsa)、不含沙氏鹿茸草水提物(对照)的培养基继续培养24小时。然后将细胞分离、收集，并用70％冷乙醇固定过夜。之后，使细胞在含有5μg/ml rnase a(sigma-aldrich，美国)的pbs中沉淀并重新悬浮30分钟，然后加入碘化丙啶(yeasen，上海，中国)至终浓度为20μg/ml 30分钟。使用bd facsaria(tm)ii流式细胞仪(becton and dickinson,ca,u.s.a.)测量每个细胞的荧光。使用flowing软件v.2.5.1分析数据。
38.结果分析：上述将mcf7和mda-mb-231细胞暴露于不同剂量的沙氏鹿茸草水提物72小时后，经细胞密度分析显示，在两种细胞系中，浓度高达500μg/ml的沙氏鹿茸草水提物也对两种细胞没有明显的杀伤毒性，如图1所示，不同剂量的沙氏鹿茸草水提物处理mcf7和mda-mb-231细胞72小时后的细胞存活率，其中m.savatieri为沙氏鹿茸草水提物，survial为细胞存活率。
39.两种乳腺癌细胞系均通过流式细胞术进行细胞周期分析发现对照或沙氏鹿茸草水提物处理呈现出相似的细胞周期阶段分布，如图2所示，流式细胞术分析沙氏鹿茸草水提物处理对乳腺癌细胞细胞周期的影响，其中control为对照，m.savatieri为沙氏鹿茸草水提物，faf-bsa为不含脂肪酸的牛血清白蛋白(faf-bsa)，％cell为细胞周期不同时期中的细胞数目比例。
40.此外，与抗肿瘤药阿霉素(doxorubicin，dox)相比，沙氏鹿茸草水提物不能激活mda-mb-231癌细胞中的与细胞凋亡相关的蛋白caspase-3和parp1，如图3所示，蛋白质杂交检测沙氏鹿茸草水提物处理后，mda-mb-231中的caspase-3和parp-1的表达水平，其中dox为阿霉素doxorubicin的简称，ctrl为对照，m.s.为沙氏鹿茸草水提物。
41.这些结果表明沙氏鹿茸草水提物对乳腺癌细胞缺乏细胞毒性作用，也不影响乳腺癌细胞的细胞周期。
42.实施例3-划痕愈伤实验及侵袭实验
43.1.划痕愈伤实验
44.在24孔板中每孔接种2.2
×
105个mda-mb-231细胞，培养24小时，然后用200ul的头制造划痕。用pbs洗涤细胞以除去漂浮细胞，并分别加入含有或不含沙氏鹿茸草水提取物的2.5％fbs的培养基进行培养，另一组用0.1％的faf-bsa进行培养，24小时后，除去培养
基，轻轻固定细胞并用结晶紫染。在0小时和24小时拍摄同一领域的图片。使用imagej v2.0.0确定无细胞区域。迁移指数计算公式为：[(面积0h)-(面积24h)]/(面积0h)*100。
[0045]
2.侵袭实验
[0046]
将2.6
×
105mda-mb-231细胞接种在60mm培养皿中，用dmem培养基培养24小时，然后用含有或不含有400μg/ml沙氏鹿茸草水提物的培养基更换dmem培养基，处理24小时后，用(sigma-aldrich，中国)分离细胞，计数并将1
×
104个细胞接种在系统(costar，美国)的不含fbs的培养基的上室中，下室充满了含有10％fbs的培养基。24小时后，在显微镜下对穿过多孔膜的cv染细胞进行定量。计算每个小室的五个视野(放大倍数为80倍)。
[0047]
结果分析：沙氏鹿茸草水提物抑制mda-mb-231细胞的迁移。首先为了测试沙氏鹿茸草水提物是否对细胞迁移有影响，选择采用mda-mb-231细胞进行划痕愈合试验。与暴露于faf-bsa相比，单独的fbs增强了mda-mb-231细胞的迁移，但是沙氏鹿茸草水提物以剂量依赖性的方式抑制了fbs的迁移作用。与对照相比，200g/ml和400μg/ml沙氏鹿茸草剂能够显著的抑制其迁移，且迁移指数分别降低了27％和35％。如图4所示，沙氏鹿茸草水提物抑制mda-mb-231细胞迁移作用的划痕愈伤试验分析图，m.savatieri为沙氏鹿茸草水提物，migration index为迁移指数。
[0048]
其次，在由fbs梯度介导的transwell测定结果表明，用沙氏鹿茸草水提物预处理mda-mb-231细胞24小时，能够抑制其迁移。与对照组相比，用沙氏鹿茸草水提物处理过的细胞数量减少了46％。这些结果表明沙氏鹿茸草水提物对抑制乳腺癌细胞系mda-mb-231迁移有显著的效果。如图5所示，沙氏鹿茸草水提物抑制mda-mb-231细胞的迁移作用的transwell侵袭试验分析图，其中control为对照，m.savatieri为沙氏鹿茸草水提物，cells/field为视野中的细胞数。
[0049]
实施例4-细胞粘附及圆形度分析
[0050]
为了探索细胞粘附是否能受到沙氏鹿茸草水提物的影响，在细胞分离和重新接种之前用沙氏鹿茸草水提物处理细胞，采用400μg/ml沙氏鹿茸草水提物处理mda-mb-231 24小时(不加沙氏鹿茸草水提物培养的mda-mb-231为对照)，细胞粘附时长为2小时。然后用分离细胞，计数并重新接种(每孔5
×
103个细胞)在fbs预涂的96孔板中，3h后，用pbs洗涤两次，用cv染1h。之后，用水洗涤去除多余的染，然后将板进行干燥。将细胞放大100倍进行拍照，捕获其图像并分析其形态，使用imagej软件计算圆度(nih，美国)。此外，为了测量细胞密度，如前所述重悬cv染并进行定量分析。
[0051]
结果分析：沙氏鹿茸草水提物降低了mda-mb-231细胞的粘附能力。根据沙氏鹿茸草水提物干扰mda-mb-231细胞的细胞粘附和扩散结果分析，经图像分析表明，与对照组相比，采用沙氏鹿茸草水提物显著增加了圆度值。此外，经细胞密度分析表明，当用沙氏鹿茸草水提物预处理时，能够使附着在板上的细胞数量较低。如图6所示的经沙氏鹿茸草水提物处理后，mda-mb-231细胞圆度值分析，其中control为对照，m.savatieri为沙氏鹿茸草水提物，circularity为圆度值，cell denisity为细胞密度。
[0052]
如图7所示，经沙氏鹿茸草水提物处理后和未处理(对照)的细胞形态分析表明，采用沙氏鹿茸草水提物处理降低了mda-mb-231细胞扩散的能力，因此，增加了具有较高圆度值细胞数的比例，其中ctrl为对照，m.s.为沙氏鹿茸草水提物。
[0053]
实施例5-免疫荧光分析及蛋白质杂交
[0054]
1.免疫荧光分析
[0055]
用400μg/ml沙氏鹿茸草水提物处理mda-mb-231 24小时(不加沙氏鹿茸草水提物培养的mda-mb-231为对照)，用2％甲醛固定细胞30分钟，用0.2％triton x-100在pbs(t-pbs)中渗透20分钟，并在室温(rt)下用1％bsa在t-pbs中阻断30分钟。将细胞与caveolin-1兔多克隆抗体一起在用1％bsa以1：100稀释t-pbs中孵育2小时，然后在室温下与invitrogen alexa fluor
tm 633山羊抗兔igg二抗(invitrogen，usa)(以1：500稀释)一起在室温下1小时孵育。盖玻片使用含有nucblue
tm
的prolong
tm
玻璃抗淬灭封片剂(美国invitrogen)进行封片，显微镜下观察、拍照。
[0056]
2.蛋白质杂交分析
[0057]
为了确定有哪些蛋白质参与沙氏鹿茸草水提物的抑制活性，将2
×
105mda-mb-231细胞在六孔板中预培养24小时，然后用含有或不含400μg/ml沙氏鹿茸草水提取物处理24小时以分析caveolin-1,snail的表达水平；另一方面，用400μg/ml沙氏鹿茸草水提取物处理0，15分钟或60分钟以测定活化的erk和akt的水平，之后，收集细胞并在冰上用ripa缓冲液裂解30m，离心，收集上清液并使用bca蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。
[0058]
每个样品30μg总蛋白在聚丙烯酰胺凝胶(8％或12％聚丙烯酰胺)中电泳并转移到pvdf膜上。将膜与caveolin-1、snail、vimentin、磷酸化erk1/2、磷酸化akt或β-actin(对照)的一抗一起室温孵育2小时，然后与相应的辣根过氧化物酶偶联二抗一起孵育，并通过化学发光显。使用imagej软件(1.52k)分析条带的光密度分析，并使用β-肌动蛋白条带作为参照，对数据进行标准化处理。
[0059]
结果分析：沙氏鹿茸草水提物降低了mda-mb-231细胞中的caveolin-1的表达，并调节细胞迁移相关的信号通路。通过蛋白质杂交分析发现经沙氏鹿茸草水提物处理的细胞中观察到snai和vimentin的蛋白质水平略有降低，而caveolin-1蛋白质表达水平降低显著，如图8所示的蛋白质杂交分析snail、vimentin和caveolin-1的表达水平，其中ctrl为对照，m.s.为沙氏鹿茸草水提物。并且通过免疫荧光检测也进一步证实了这一点，如图9所示的caveolin-1的免疫荧光检测，其中control为对照，m.savatieri为沙氏鹿茸草水提物。
[0060]
此外，细胞经沙氏鹿茸草水提物处理0，15或60分钟后，磷酸化erk的水平失衡，特别是，相比于对照(处理时间为0)，在60分钟时，磷酸化的p44(erk1)表达水平降低约40％，活化的akt表达水平降低了65％，如图10所示的蛋白质杂交检测活化的erk和akt的表达水平，其中ctrl为对照，m.s.为沙氏鹿茸草水提物。
[0061]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种沙氏鹿茸草水提物在制备抗乳腺癌迁移药物中的应用。2.如权利要求1所述的一种沙氏鹿茸草水提物的应用，其特征在于：所述沙氏鹿茸草水提物用于抑制侵袭性乳腺癌细胞mda-mb-231的迁移。3.如权利要求1所述的一种沙氏鹿茸草水提物的应用，其特征在于：所述沙氏鹿茸草水提物用于降低mda-mb-231细胞的粘附能力。4.如权利要求1所述的一种沙氏鹿茸草水提物的应用，其特征在于：所述沙氏鹿茸草水提物在抑制snail、vimentin和caveolin-1蛋白表达中的应用。5.一种如权利要求1～4中任意一项所述的沙氏鹿茸草水提物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)取沙氏鹿茸草的地上部分，在35～45℃的烘箱中干燥，并研磨至60～80目的沙氏鹿茸草粉末；(2)将沙氏鹿茸草粉末在蒸馏水中煮沸1.5～2.5小时进行提取，得到提取液：(3)将提取液进行过滤，在35～45℃下进行旋转蒸发，得到沙氏鹿茸草水提物。

技术总结

本发明提供沙氏鹿茸草水提物的制备方法及其应用，经过实验结果表明沙氏鹿茸草水提物对乳腺癌细胞无细胞毒性，并且可通过调节Erk和Akt信号通路以及Snail、Vimentin、caveolin-1的表达，抑制侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移，同时能够降低MDA-MB-231细胞的粘附能力；可在制备抗乳腺癌迁移药物中应用，用于乳腺癌患者的补充，防止肿瘤发生转移。防止肿瘤发生转移。防止肿瘤发生转移。