(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201610046699.4
(22)申请日 2016.01.25
C12N 1/12(2006.01)
C12P 23/00(2006.01)
C02F 9/14(2006.01)
C12R 1/89(2006.01)
(71)申请人清华大学深圳研究生院
地址518055 广东省深圳市南山区西丽深圳
大学城清华园区
(72)发明人蔡中华 张怀瑾 周进 张晶晶
晋慧
(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事
务所(普通合伙) 11201
代理人李志东
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种培养雨生红球藻的方法、
一种提高雨生红球藻生物量的方法、一种生产虾
本发明的方法可以极大地提升雨生红球藻的生物
量，可以使雨生红球藻更快地进入虾青素合成时
期，极大地缩短了虾青素合成周期，为后续提高代
谢产物虾青素产量提供了良好的基础。而且，利用
本发明的方法得到的雨生红球藻胞内重金属等污
染物未出现显著升高，因此利用该方法得到的雨
生红球藻可以作为一种安全的产品进行后续的使
用。同时，利用本发明的方法可以使污水内的氮磷
含量显著下降，污水富营养化程度明显缓解。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书9页 附图4页CN 105483016 A 2016.04.13
C N 105483016
A
1.一种培养雨生红球藻的方法，其特征在于，所述方法利用生活污水作为培养基。
2.权利要求1的方法，其特征在于，利用所述生活污水培养所述雨生红球藻之前，对所述生活污水进行预处理，其中包括：
对所述生活污水进行沉降以去除第一杂质，
对去除第一杂质后的生活污水进行过滤以去除第二杂质，以及
3.权利要求2的方法，其特征在于，所述沉降为利用静置沉降。
4.权利要求2的方法，其特征在于，所述过滤采用的滤膜的孔径为不大于50μm。
5.权利要求2的方法，其特征在于，所述灭菌选自高温灭菌、蒸汽灭菌和高压灭菌中的至少一种；
任选的，所述灭菌为煮沸或者蒸汽加热灭菌，所述灭菌温度为100℃，所述灭菌时间为30min；
任选的，所述灭菌为利用高压蒸汽灭菌，所述灭菌的温度为121℃，所述灭菌压力为0.1MPa，所述灭菌时间为15min。
6.权利要求1的方法，其特征在于，所述培养的温度为25±1℃，所述培养的光照条件为L∶D＝12h∶12h，所述培养的光照强度3300±200Lux。
7.一种提高雨生红球藻生物量的方法，其特征在于，所述方法利用生活污水作为培养所述雨生红球藻的
培养基；
任选的，利用所述生活污水培养所述雨生红球藻之前，对所述生活污水进行预处理，其中包括：
对所述生活污水进行沉降以去除第一杂质，任选的，所述沉降为静置沉降，
对去除第一杂质后的生活污水进行过滤以去除第二杂质，任选的，所述过滤过滤采用的滤膜的孔径为不大于50μm，以及
对去除第二杂质后的生活污水进行灭菌，任选的，所述灭菌选自高温灭菌、蒸汽灭菌和高压灭菌中的至少一种；
任选的，所述灭菌为煮沸或者蒸汽加热灭菌，所述灭菌温度为100℃，所述灭菌时间为30min；
任选的，所述灭菌为利用高压蒸汽灭菌，所述灭菌的温度为121℃，所述灭菌压力为0.1MPa，所述灭菌时间为15min；
任选的，所述培养的温度为25±1℃，所述培养的光照条件为L∶D＝12h∶12h，所述培养的光照强度3300±200Lux。
8.一种生产虾青素的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求7的方法获得所述雨生红球藻；
利用所述雨生红球藻以生产所述虾青素。
9.一种净化生活污水的方法，其特征在于，包括：
将雨生红球藻以4000-6000个/mL的密度接种进所述生活污水中培养7-16天，以净化所述生活污水；
任选的，所述生活污水为经过预处理的生活污水，所述预处理包括，
对所述生活污水进行沉降以去除第一杂质，任选的，所述沉降为静置沉降，
对去除第一杂质后的生活污水进行过滤以去除第二杂质，任选的，所述过滤采用的滤膜的孔径为不大于50μm，
对去除第二杂质后的生活污水进行灭菌，任选的，所述灭菌选自高温灭菌、蒸汽灭菌和高压灭菌中的至少一种；
任选的，所述灭菌为煮沸或者蒸汽加热灭菌，所述灭菌温度为100℃，所述灭菌时间为30min；
任选的，所述灭菌为利用高压蒸汽灭菌，所述灭菌的温度为121℃，所述灭菌压力为0.1MPa，所述灭菌
时间为15min。
10.权利要求9的方法，其特征在于，所述培养的温度为25±1℃，所述培养的光照条件为L∶D＝12h∶12h，所述培养的光照强度为3300±200Lux。
培养雨生红球藻的方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物领域，具体的，本发明涉及雨生红球藻、其培养方法及应用，更具体的，本发明涉及一种培养雨生红球藻的方法、一种提高雨生红球藻生物量的方法、一种生产虾青素的方法和一种净化生活污水的方法。
背景技术
[0002]类胡萝卜素因具有抗单态氧及自由基清除能力而表现出明显的抗氧化能力，在延缓和预防动脉粥样硬化、癌症、老化和眼部疾病等均表现出了显著的效果。虾青素是一种橘红的类胡萝卜素，具有更加强有力的抗氧化能力及经济价值而得到广泛的关注。它存在于自然界中很多水生生物体内，如虾、蟹以及鲑鱼等的体内都有发现。
[0003]虾青素的抗氧化能力比玉米黄质、叶黄素、角黄素等其他类胡萝卜素强10倍，特别是在自由基清除能力方面，它比β-胡萝卜素强38倍，比维生素E强500倍。因此，虾青素能够显著降低与年龄相关的退行性疾病和局部缺血性疾病的发病风险，同时也可以增强免疫系统预防癌症发生率；在抗衰老、抗紫外线、增强免疫力、穿越血脑屏障抗氧化抗炎等方面也有着显著成效。目前，虾青素已广泛应用于营养保健品、化妆品和食品及饲料行业。
[0004]虾青素的获得主要有四种不同的来源：(1)人工合成；(2)甲壳类动物提取；(3)法夫酵母生产；以及(4)雨生红球藻生产。其中化学合成得到的虾青素占据了主要的市场份额，价格达到每公斤2500美元，每年全世界的市场份额估计超过2亿美元。然而由于化学合成的虾青素中存在非天然构象成分，从而导致其具有较低的生物利用率和安全性。因此，尽管化学合成的虾青素占据着全世界的市场份额，但仍然被美国食品药品监督管理局(FDA)禁止进入保健品市场。所以，自然界中提取天然虾青素成为市场重要的发展方向。[0005]作为一种强有力的虾青素的生产者，雨生红球藻可以积累很高含量的虾青素，每克干细胞能够生产约50毫克虾青素。与此同时，雨生红球藻已通过评估，被美国食品药品监督管理局(FDA)批准进入市场，并被膳食补充剂健康与教育法(DSHEA)认可成为一种新的膳食成分。因此，雨生红球藻是大规模生产天然虾青素最主要的来源之一。
[0006]目前，以雨生红球藻进行虾青素生产的研究主要集中在以下两个方面：获得高密度的生物量以及诱导虾青素的高效表达。为了获得高密度生物量，大量研究尝试了多种培养基的优化，包括营养元素含
量及组成等；但是性价比仍然没有达到最优，在产量与成本间存在一对矛盾。因此，为了缓解成本压力，开发产量与成本的有效耦合技术成为当下急需。[0007]随着我国城市化进程加剧，城市人口不断膨胀，导致城市污水排放量的急剧增多。生活污水以城市居民日常生活的用水为主，不含工业污染。
发明内容
[0008]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。[0009]依据本发明的一方面，本发明提供一种培养雨生红球藻的方法，所述方法利用生活污水作为培养基。
[0010]雨生红球藻是一种淡水单细胞绿藻，属于植物界(P l a n t a e)，绿藻门(C h l o r o ph y ta)，绿藻纲(C h l o r o-ph y c ea e)，团藻目(V o l v o ca l e s)，红球藻科(Haematococcaceae)，红球藻属，雨生种。由于它具有累积橘红素虾青素及其他相关类胡萝卜素及内酯的能力而得到广泛关注。其生命周期的孢子时期开始积累虾青素。[0011]所称的生活污水是人类生活过程中产生的污水，主要是粪便和洗涤污水，如城市生活中使用的各种洗涤剂和污水、垃圾、粪便等，多为无毒的无机盐类，另外生活污水中的含氮、磷、硫多，致病细菌多。城市每人每日排出的生活污水量为150-400L。需要说明的是，本发明的这一方法不需额外配置或添加无机或有机成分，只需以一般污水处理厂中的生活污水作为培养原料。虽然不同区域或者不同季节时间的生活污水包含的有机盐、无机盐种类、以及浓度等均有差异，但依据发明人从不同时间、地点的污水处理厂获得多批生活污水的试验结果，利用本发明的这一方法，均能实现高密度培养雨生红球菌。
[0012]本发明的这一方法至少具有如下优点：1)以生活污水作为培养原料，来源广泛，使生产微藻类的成本低廉；2)以生活污水作为培养原料得到的雨生红球藻的生物量相比传统方法具有显著的提高；3)不仅可以创造额外经济效益和生态效益，而且可以显著降低生活污水的氮和磷等主要污染指标，发展出可再生能源生产和减排的双效模式，具有极好的发展前景。
[0013]根据本发明的实施例，上述本发明一方面的培养雨生红球藻的方法，还可以包括以下附加技术特征至少之一。
[0014]根据本发明的实施例，利用所述生活污水培养所述雨生红球藻之前，对所述生活污水进行预处理，其中包括：对所述生活污水进行沉降以去除第一杂质，对去除第一杂质后的的生活污水进行过滤以去除第二杂质，以及对去除第二杂质后的生活污水进行灭菌。发明人发现将生活污水经过上述预处理，能更高效的培养获得高密度的雨生红球藻。[0015]根据本发明的一个较佳实施例，所述沉降为利用静置沉降，以沉降污水中的杂质和大型颗粒物。
[0016]根据本发明的一个较佳实施例，所述过滤为简单过滤，例如利用孔径不大于50微米的滤膜进行，以有效的除去细小颗粒杂质以及浮游生物。
[0017]本发明对灭菌的方式不作限定，灭菌可选自高温灭菌、蒸汽灭菌和高压灭菌方法中的至少一种。根据本发明的一个实施例，所述灭菌为煮沸或者蒸汽加热灭菌，所述灭菌温度为100℃，所述灭菌时间
为30min。根据本发明的另一个实施例，所述灭菌的温度为121℃、灭菌压力为0.1MPa、灭菌时间为15min。
[0018]根据本发明的较佳实施例，所述培养的温度为25±1℃，所述培养的光照条件为L∶D＝12h∶12h，其中L指光照时间、D指黑暗时间，所述培养的光照强度3300±200Lux。发明人综合生活污水预处理前后中的主要成分、以及已知的雨生红球藻的培养条件，在确定的条件下经过平行实验选择确定上述最佳培养条件参数，包括培养温度、采用连续光照以及光照强度，使得能够获得高密度的雨生红球藻。
[0019]依据本发明的另一方面，提供一种提高雨生红球藻生物量的方法，所述方法利用生活污水作为培养所述雨生红球藻的培养基。
[0020]根据本发明的较佳实施例，利用所述生活污水培养所述雨生红球藻之前，对所述生活污水进行预处理，其中包括：对所述生活污水进行沉降以去除第一杂质，较佳的沉降为
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