一种巴戟天多糖缓解肉鸡胫骨软骨发育不良的方法及应用

1.本发明涉及巴戟天多糖的新方法和用途，具体涉及巴戟天多糖缓解肉鸡胫骨软骨发育不良的方法和应用。

背景技术

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：：2.胫骨软骨发育不良(tibialdyschondroplasia，td)是速成型家禽常见的营养代谢性腿部疾病。该病以软骨内骨化受阻和胫骨干骺端的软骨细胞增生所形成的无血管、玉白的“软骨楔”为特征，其临床表现主要为精神萎靡，食欲下降，不愿站立，行走困难，胫骨发育畸形等，造成肉鸡生产性能下降和免疫功能低下，还会诱发胸囊肿、骨折和骨髓炎等一系列继发性疾病，影响肉鸡的机体健康。该病于1965首次在美国由leachrm和mcnesheim在快速生长的肉鸡上发现并报道，之后在鸭及火鸡等家禽类的养殖过程中陆续发现。随着全球经济的发展，对禽类肉蛋产品的需求也随之增多，集约化的养鸡模式在追求发展数量、产量以及出栏速度的过程中，由于饲养空间的限制及增重速度过快，导致肉鸡腿部疾病发生增多，对肉鸡健康构成严重威胁，也给肉鸡养殖业带来全球性的损失。3.目前，尚未存在可广泛使用td的特异物。先前的研究表明，饲喂维生素c和维生素d3并改变饲粮中钙和磷的比例，可以降低肉鸡td的发病率。但是，由于肉鸡的生产周期短，药物的代谢周期长，成本高，以及药物残留在商品鸡中并不断积累，如何广泛使用药物防治td是个重要问题。4.中药的应用历史悠久，因其疗效好、毒性小、副作用小，被广泛用于预防和疾病。巴戟天多糖(morinadaofficinalispolysaccharide，mop)是从巴戟天中提取的衍生物，其在自然界中广泛分布，具有抗氧化，抗炎和促进骨骼形成的作用。研究表明，mop能够有效改善去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度，并通过调控大鼠体内肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)和白细胞介素-1(interleukin-1，il-1)的水平，起到抗骨质疏松的效果。同时mop在改善去卵巢大鼠体内的矿物质含量方面也具有一定的作用，其通过调控细胞核因子-κb受体活化因子(receptoractivatorofnuclearfactor-κb，rank)和骨保护素(osteoprotegerin，opg)的水平来提高骨钙和骨磷含量，从而起到减少破骨细胞生成的效果。mop还可以通过调节bmp-2/runx-2/osterix途径来促进骨骼形成。鉴于mop对动物骨骼生长发育的作用，其在预防和肉鸡骨骼生长发育疾病方面可能具有一定的潜力。技术实现要素：5.本发明的目的在于提供一种巴戟天多糖在缓解肉鸡胫骨软骨发育不良中的应用，经试验发现，mop可缓解td导致的肉鸡跛行，并通过bmp/smads信号通路改善胫骨相关指标，恢复胫骨生长板结构，平衡td导致的钙磷代谢紊乱。同时mop也提高了机体抗氧化能力，改善了肉鸡肠道菌的结构，提高了有益菌的丰度，降低了有害菌的丰度，为td的提供了新的思路，并证明了mop在防治td的潜在应用价值。6.本发明采用杨凌慈缘生物技术有限公司提供的巴戟天多糖，所述中药提取物—巴戟天多糖用于肉鸡。优选的是，所述巴戟天多糖的给药量为500mg/kg，在饮水中给药。7.本发明利用艾拔益加(arboracres，aa)肉鸡建立福美双诱导的td模型，该模型通过在第4-7天饲喂添加100mg/kg的福美双的饲料来诱导td，其发病率明显高于因日粮成分改变、酸碱性平衡变化和其他因素所致的发病率。而且福美双诱导的td模型，一方面可以使肉鸡几乎同期发病，另一方面使发病率几乎达到100％，这为深入研究其发病机理提供了充足而可靠的试验材料，可作为一个研究肉鸡理想的试验动物模型。巴戟天多糖饮水给药，剂量为500mg/kg/d，连续十四天。每日记录体重，观察肉鸡临床症状。14天后取材，记录胫骨重量、长度、胫骨生长板宽度，测定胫骨中灰分、钙和磷含量，提取肉鸡胫骨生长板rna进行rt-qpcr测定bmp/smads相关基因的表达水平，对胫骨生长板进行组织病理学检查，采取血液测定血浆中钙、磷及骨形成标志物碱性磷酸酶(alp)水平，结果证明mop通过bmp/smads信号通路改善胫骨相关指标，恢复胫骨生长板结构，平衡td导致的钙磷代谢紊乱。通过测定血浆氧化应激相关指标发现，mop可以提高机体抗氧化能力，收集肉鸡盲肠内容物，进行16srna测序，对样本肠道菌进行out统计分析，alpha多样性分析，beta多样性分析及优势菌分析，发现mop能够td肉鸡肠道菌结构，提高有益细菌的相关丰度，降低有害细菌的相关丰度，进而调控机体代谢功能。附图说明8.图1.mop对td肉鸡临床症状及组织病理学的影响9.(a)肉鸡适应时期、福美双诱导td时期和mop时期的临床特征。(b)胫骨和胫骨生长板形态学检查(c)胫骨生长板指数和胫骨重量指数。(d)胫骨生长板组织病理学检查。10.图2.mop对td肉鸡胫骨灰分、钙、磷含量及血浆钙、磷水平及骨代谢指标的影响。11.(a)第14、21天胫骨钙、磷、灰分含量。(b)血浆钙水平。(c)血浆磷水平。(d)血浆alp水平。12.图3.mop对td肉鸡bmp/smads信号通路的影响13.图4.mop对td肉鸡抗氧化能力的影响14.(a)血浆t-sod、gsh-px活性及mda水平。(b)胫骨生长板sod、gpx-1基因表达水平15.图5.mop对td肉鸡肠道菌的影响16.(a)基于otus的venn图。(b)beta多样性：基于unweighted-unifrac的pcoa。(c)alpha多样性：simpson指数，chao1指数，observe_species指数、shannon指数。(d)门水平肠道菌组成及相对丰度。(e)属水平肠道菌组成及相对丰度。17.有益效果18.1.本发明提供了一种中药提取物—巴戟天多糖，巴戟天多糖是来源自中药巴戟天的提取物，其在自然界中广泛分布，具有抗氧化，抗炎和促进骨骼形成的作用，而且其疗效好、毒性小、副作用小，具有潜在的临床价值。19.2.本发明通过体内实验证明了巴戟天多糖具有促进骨骼生长、抗氧化及改善肠道菌结构的特性，可以有效缓解肉鸡胫骨软骨发育不良，为td的防治提供了新思路。具体实施方式20.本发明具体实施方式包括以下内容：21.作为本发明优选的技术方案，本发明的方法包括巴戟天多糖通过bmp/smads信号通路对福美双诱导的肉鸡胫骨软骨发育不良的改善方法及应用。22.作为本发明优选的技术方案，本发明的方法包括巴戟天多糖提高td肉鸡抗氧化能力的方法和应用；23.作为本发明优选的技术方案，本发明的方法包括巴戟天多糖改善td肉鸡肠道菌的方法和应用。24.实施例125.巴戟天多糖通过bmp/smads信号通路对福美双诱导的肉鸡胫骨软骨发育不良的改善方法包括如下步骤：26.步骤一、原料的选择及饲养方法27.巴戟天多糖(批号：cy180812)，购自杨凌慈缘生物技术有限公司。福美双(二硫化四甲基秋兰姆，m03718066)，购于上海麦克林生物化学有限公司。选取120只aa鸡(1日龄；46.96±6.53g)取自兴达禽业股份有限公司。28.所有肉鸡饲养在标准室温和相对湿度的光/暗循环设施中，并免费提供水和食物。试验将肉鸡随机分为3组，每组10只鸡，每组4个重复，分别为对照组(con)、福美双诱导的td组和mop组。第4-7天，con组饲喂正常饲粮，td组和mop组饲喂添加100mg/kg福美双的饲粮。第7-21天，mop组肉鸡在饮用水中加入500mg/kgmop。试验一共21天。29.步骤二、取样及测定方法30.试验期间每天记录肉鸡体重，分别于第7、14和21天每组10只鸡采用颈椎脱位法处死，颈动脉静脉无菌采血后，于4℃，3000rpm离心10min，-20℃保存血浆样品。测量胫骨长度和生长板宽度并进行h&e染。每组取6只肉鸡右侧胫骨，测量胫骨中灰分、钙和磷的含量。通过试剂盒测定血浆中钙、磷及alp的水平。31.trizol法提取胫骨生长板rna32.试验前期准备：提取rna用的研钵、研磨棒、手术剪等器械提前用高压锅进行高压蒸汽灭菌后，加入液氮中预冷。33.(1)将胫骨生长板组织从-80℃冰箱中取出，取少量(黄豆粒大小)组织于研钵中加入液氮，用研磨棒进行研磨，期间不断往研钵中加入液氮，直至将组织研磨呈粉末状，使用小药勺将样品粉末转移至1.5ml无酶离心管中。34.(2)向1.5ml的ep管中加入1ml的trizol液中(裂解液过少会导致样品裂解不充分，使产物浓度降低)，使用振荡器剧烈震荡或用移液反复吹打，颠倒混匀，放置5min。35.(3)ep管中加入200ml氯仿，震荡混匀，室温放置5min，4。c，12000/15min。36.(4)用移液吸取上清液，加入异丙醇，室温静置10min，4。c12000转10min。37.(5)弃上清加入1ml75％乙醇洗涤，轻弹混匀，4。c7500转5min。38.(6)重复步骤6。39.(7)于室温静置晾干，加入20μl的rnase-freeddh2o溶解沉淀，轻微震荡3min，使rna沉淀充分溶解。40.(8)使用核酸蛋白分析仪对rna的浓度进行测量，并将浓度降至1000ng/μl，方便用于后续的试验与计算。41.对rna进行反转录成cdna的试剂iiirtsupermixforqpcr(+gdnawiper)由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供，反转录体系如表1-1所示，具体操作步骤如下：42.(2)反转录合成cdna43.按照反转录说明配制反转录体系44.1)去除基因组dna体系45.在rnase-free离心管中配制如下混合液46.表1-1去基因组体系47.table1-1genomicsystem[0048][0049]用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min[0050]2)配制逆转录反应体系[0051](1)抽取1μl被稀释后的样品rna，与4μl的4×mixgdna混合于1.5ml的无酶离心管中，在42℃的水浴锅中水浴2min。[0052](2)取出后，往1.5ml的无酶离心管中加入11μl的rnase-freeddh2o与4μl的5×mixqrt，在37℃的水浴锅中水浴15min。[0053](3)之后在85℃的水浴锅中水浴5s。[0054](4)最后加入80μl的rnase-freeddh2o进行稀释。[0055]表1-2反转录体系[0056]table1-2reversetranscriptionsystem[0057][0058]如图1a-c所示，td组及mop组肉鸡在第3-7天饲喂添加并充分混匀100mg/kg福美双的饲料，建立td肉鸡模型。td肉鸡模型建立后，td组肉鸡的临床症状表现为食欲减退或废绝、胫骨关节肿胀、站立行走困难，严重者无法站立行走，而且肉鸡胫骨生长板区域明显增厚，可见未钙化及血管化的白透明“软骨栓”。td组肉鸡胫骨生长板指数因“软骨栓”的存在而显著高于con组肉鸡(p＜0.05)。经mop后，mop组肉鸡精神食欲逐渐恢复，关节肿胀减轻，站立和自由行走能力逐渐恢复。肉鸡胫骨生长板结构逐渐恢复正常，胫骨近端肥厚区血管显著增多。同时，mop显著提高了肉鸡胫骨体重指数(p＜0.05)，降低了肉鸡胫骨生长板指数，并逐渐趋于正常。[0059]如图1d所示，组织病理学进一步显示，td组肉鸡胫骨生长板中血管和软骨细胞数量显著减少，软骨细胞分布排列紊乱，细胞形态不完整，同时伴有核裂解和核碎裂。经mop后，肉鸡胫骨生长板血管浸润显著增多，软骨细胞逐渐修复再生，排列整齐有序，仅有少量空核细胞。结果表明，mop可通过提高胫骨重量，恢复胫骨生长板结构和促进胫骨生长板血管浸润及软骨细胞发育分化来恢复肉鸡td所造成的不良影响。[0060]胫骨灰分含量和无机矿物含量结果如图2a所示，结果显示，td组肉鸡胫骨灰分含量在第14天显著低于con组和mop组(p＜0.05)，在第21天差异不显著。td组肉鸡胫骨钙含量在第14天、21天均显著低于con、mop组肉鸡(p＜0.05)。各组肉鸡胫骨磷含量无显著性差异。进一步检测各组肉鸡血浆alp、钙、磷水平(图2b-d)。在整个试验阶段，td组肉鸡血浆钙和alp水平均显著低于con组(p＜0.05)。在第7、21天，td组肉鸡血浆磷水平显著高于con组肉鸡(p＜0.05)。经mop后，mop组肉鸡血浆钙、alp水平均显著高于td组肉鸡(p＜0.05)，而且在第21天血浆磷水平显著低于td组肉鸡(p＜0.05)。结果表明，mop可以提高胫骨中灰分的含量，缓解td造成的钙磷代谢紊乱，提高骨形成标记物alp活性，从而促进骨形成。[0061]如图3所示，mop对肉鸡胫骨生长板中bmp-2、smad4和runx2基因表达的影响如图3所示，在整个试验阶段，td组肉鸡胫骨生长板bmp-2、smad4和runx2基因的表达水平均显著低于con组肉鸡(p＜0.05)。经mop后，mop组肉鸡胫骨生长板bmp-2、smad4和runx2基因表达水平均显著高于td组肉鸡(p＜0.05)。结果表明，mop通过bmp/smads信号通路促进骨骼形成。[0062]实施例2[0063]本发明巴戟天多糖提高td肉鸡抗氧化能力的方法包括如下步骤：[0064]步骤一、原料的选择及饲养方法[0065]同实施例1[0066]步骤二、取样及测定方法[0067]分别于第7、14和21天每组10只鸡采用颈椎脱位法处死，颈动脉静脉无菌采血后，于4℃，3000rpm离心10min，-20℃保存血浆样品，通过elisa试剂盒测定血浆中超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，gsh-px)活性及丙二醛(malondialdehyde，mda)的含量。采用rt-qpcr检测胫骨生长板中抗氧化相关基因sod、gpx-1的表达，具体步骤同实施例1。[0068]肉鸡血浆中抗氧化相关指标结果如图4a所示，结果显示，在整个试验阶段，td组肉鸡血浆gsh-px和t-sod活性均显著低于con组肉鸡(p＜0.05)，血浆mda水平显著高于con组肉鸡(p＜0.05)。经mop后，mop组血浆t-sod和gsh-px活性均显著高于td组肉鸡(p＜0.05)，而mda含量显著低于td组肉鸡(p＜0.05)，恢复到与con组相似的水平。[0069]如图4b所示，通过rt-qpcr进一步测定胫骨生长板中抗氧化相关基因sod和gpx-1的表达水平。在整个试验阶段，td组肉鸡胫骨生长板sod、gpx-1基因表达水平均显著低于con组肉鸡(p＜0.05)。经mop后，mop组肉鸡胫骨生长板sod和gpx-1基因表达水平显著高于td组肉鸡(p＜0.05)。结果表明，mop可逆转td引起的氧化指标异常变化，促进抗氧化基因的表达，从而提高td肉鸡抗氧化能力。[0070]实施例3[0071]本发明的方法包括巴戟天多糖改善td肉鸡肠道菌的方法包括如下步骤：[0072]步骤一、原料的选择及饲养方法[0073]同实施例1[0074]步骤二、取样及测定方法[0075]第21天，收集各组4只肉鸡的盲肠内容物，置于-80℃保存，然后分别冰化、均质化，使用qiaampdna工具迷你试剂盒，按照制造商的操作规程提取样品中的微生物基因组dna。为确保成功分离dna，采用nanodrop仪器测定dna提取物的浓度和纯度，以确定是否成功分离dna，并通过1％琼脂糖凝胶电泳评价dna样品的完整性。用引物338f(5'-actcctacgggaggcagca-3')和引物806r(5'-ggactachvgggtwtctaat-3')pcr扩增细菌16srrnav3-v4高变区。扩增物用agcourtampurebeads和picogreendsdna检测试剂盒(invitrogen,carlsbad,ca,usa)纯化和定量。构建dna文库，在illuminamiseq250平台对扩增产物进行测序。采用chao1指数、observed_species指数、simpson指数和shannon指数对alpha多样性进行评价。采用主坐标分析法(principalco-ordinatesanalysis，pcoa)评价beta多样性。[0076]巴戟天多糖对td肉鸡肠道菌的影响如图5所示，结果显示，venn图展示了各分组之间的otu分布的重叠情况，结果如图5a所示，三个实验组共观察到747种out分布，在con组、td组和mop组肉鸡盲肠内容物分别发现了457、537、311种out分布，共有out数量为163种(图5a)。肠道菌的beta多样性由pcoa分析显示，结果显示3个试验组的肠道菌聚类差异显著(图5b)。肠道菌的alpha多样性由4个指标反映，分别是simpson指数，chao1指数，observe_species指数和shannon指数，如图5c所示，结果显示各试验组肉鸡肠道微生物落的alpha多样性没有显著差异。为了分析各试验组肉鸡盲肠肠道微生物落的特异性变化，我们分析了优势菌(门水平相对丰度前10细菌和属水平相对丰度前20细菌)的相对丰度。门水平上，与con、td组肉鸡相比，mop组肉鸡盲肠中厚壁菌门(firmicutes)的相对丰度显著增加(p＜0.05)，而变形菌门(protebacteria)的相对丰度显著降低(p＜0.05)。td组肉鸡盲肠中放线菌门(actinobacteria)的丰度显著高于con、mop组肉鸡(p＜0.05)。各组间拟杆菌门(bacteriodetes)相对丰度差异不显著(图5d)。在属水平上，相较于con组肉鸡，td组肉鸡盲肠中乳杆菌属(lactobacillus)、布劳特氏菌属(blautia)、瘤胃球菌属(ruminococcus)及分节丝状菌属(candidatus_arthromitus)等与肠道膜屏障，减少炎症，为机体提供能量及免疫功能相关的有益菌丰度显著下降(p＜0.05)，气球菌属(aerococcus)及棒状菌属等(corynebacterium)会引起骨骼和关节感染，导致骨髓炎和化脓性关节炎的有害菌丰度显著上升(p＜0.05)，mop组肉鸡盲肠中乳杆菌属(lactobacillus)、布劳特氏菌属(blautia)、瘤胃球菌属(ruminococcus)及分节丝状菌属(candidatus_arthromitus)等有益菌的丰度显著上升(p＜0.05)，气球菌属(aerococcus)及棒状菌属(corynebacterium)等有害菌的丰度显著下降(p＜0.05)(图5e)。结果表明，mop能够改善td肉鸡肠道菌结构，提高有益菌的丰度，降低有害菌的的丰度，进而调控机体代谢功能。[0077]需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.一种缓解肉鸡胫骨软骨发育不良的方法，其特征在于，在肉鸡食物中添加巴戟天多糖。2.如权利要求1所述缓解肉鸡胫骨软骨发育不良的方法，其特征在于，使用巴戟天多糖通过bmp/smads信号通路对福美双诱导的改善肉鸡胫骨软骨发育。3.如权利要求1所述缓解肉鸡胫骨软骨发育不良的方法，其特征在于以下步骤：步骤一、原料的选择及饲养方法所有肉鸡饲养在标准室温和相对湿度的光/暗循环设施中，并免费提供水和食物。试验将肉鸡随机分为3组，每组10只鸡，每组4个重复，分别为对照组(con)、福美双诱导的td组和mop组；第4-7天，con组饲喂正常饲粮，td组和mop组饲喂添加100mg/kg福美双的饲粮，第7-21天，mop组肉鸡在饮用水中加入500mg/kg mop，试验一共21天。步骤二、取样及测定方法试验期间每天记录肉鸡体重，分别于第7、14和21天每组10只鸡采用颈椎脱位法处死，颈动脉静脉无菌采血后，于4℃，3000rpm离心10min，-20℃保存血浆样品。测量胫骨长度和生长板宽度并进行h&e染；每组取6只肉鸡右侧胫骨，测量胫骨中灰分、钙和磷的含量；通过试剂盒测定血浆中钙、磷及alp的水平。4.一种使用巴戟天多糖在缓解肉鸡胫骨软骨发育不良中的应用。5.一种提高肉鸡胫骨软骨发育不良肉鸡抗氧化能力的方法，其特征在于，在肉鸡食物中添加巴戟天多糖。6.一种使用巴戟天多糖提高肉鸡胫骨软骨发育不良肉鸡抗氧化能力的应用。7.一种改善肉鸡胫骨软骨发育不良肉鸡肠道菌的方法，其特征在于，在肉鸡食物中添加巴戟天多糖。8.一种使用巴戟天多糖改善肉鸡胫骨软骨发育不良肉鸡肠道菌的应用。

技术总结

一种巴戟天多糖缓解肉鸡胫骨软骨发育不良的方法和应用，巴戟天多糖可缓解胫骨软骨发育不良导致的肉鸡跛行，并通过BMP/Smads信号通路改善胫骨相关指标，恢复胫骨生长板结构，平衡TD导致的钙磷代谢紊乱。同时巴戟天多糖也提高了机体抗氧化能力，改善了肉鸡肠道菌的结构，提高了有益菌的丰度，降低了有害菌的丰度。度。度。