(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011593381.0
(22)申请日 2020.12.29
(71)申请人 中国科学院海洋研究所
地址 266071 山东省青岛市市南区南海路7
号
(72)发明人 李富花 孙明哲 李诗豪 于洋
(74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限
公司 21002
代理人 马驰
(51)Int.Cl.
C07K 14/435(2006.01)
A61K 38/17(2006.01)
A61P 31/04(2006.01)
A61P 31/12(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种小分子多肽及其抗菌抗病
表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列及结构特
征；该小分子多肽衍生自序列列表中SEQ ID
No.2所示凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8；经对 本发明涉及的小分子多肽进行功能活性测试，证
实其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒的生
长或增殖均具有很强的抑制作用。
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图2页CN 112694525 A 2021.04.23
C N 112694525
A
1.一种小分子多肽，其特征在于：其氨基酸序列如序列列表中SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列。
2.按照权利要求1所述的小分子多肽，其结构特征为：
所述的小分子多肽序列具有二硫键结构，小分子多肽的氨基端第一个半胱氨酸(C)和羧基端第一个半胱氨酸(C)之间形成二硫键结构。
3.按照权利要求1或2所述的小分子多肽，其序列特征在于：SEQ I DNo.1：Ac ‑c (CSYSTRPYFLRWRLKFKSKVWC)‑NH 2。
4.按照权利要求1或2所述的小分子多肽，其特征在于：所述的环状的小分子多肽衍生自凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8。
5.按照权利要求4所述的小分子多肽，其特征在于：所述的凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8具有序列列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
6.一种权利要求1‑5任一所述小分子多肽的应用，其特征在于：
所述小分子多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或病毒的增殖均具有明显抑制作用，可用于制备抗菌和/或抗病毒的药物或制剂。
7.按照权利要求6所述小分子多肽的应用，其特征在于：
所述小分子多肽可作为抗菌和/或抗病毒的活性成份，用于制备抗菌和/或抗病毒的药物或制剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 112694525 A
一种小分子多肽及其抗菌抗病毒应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种小分子多肽及其抗菌抗病毒应用，具体地说是一种合成的来自凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8的脂多糖(LPS)结合结构域的环状多肽及其抗菌抗病毒应用。
背景技术
[0002]对虾的养殖在我国的水产养殖业中占有重要地位，近些年来，对虾养殖过程中的病害问题已经严重阻碍了其养殖生产的健康发展，抗生素的滥用与环境的恶化使海水养殖动物的病害难以从根本上得到控制。
[0003]抗菌肽(蛋白)被认为是鱼、虾、贝等防御细菌、病毒等外源病原感染的重要效应分子，在动物的先天免疫过程中发挥重要作用。目前从甲壳动物中发现的抗菌肽种类繁多，抗脂多糖因子(anti‑lipopolysaccharide factor，ALF)就是其中一种重要的抗菌肽。1982年，Tanaka等首次从中国鲎(Ta
chypleus tridentatus)和北美鲎(Limulus polyphemus)的血细胞中分离得到ALF，并发现其能抑制LPS介导的凝血反应的激活。1985年，Morita等发现ALF还具有很强的抗革兰氏阴性菌活性。之后，人们相继在斑节对虾(Penaeus monodon)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、桃红对虾(Farfantepenaeus duorarum)等多种甲壳动物中发现ALF基因的存在，并证实ALF的重组蛋白具有广泛的抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长的活性。另外，研究还发现对虾白斑综合征病毒(WSSV)预先与重组表达的ALF蛋白一起孵育后再注射入虾体中，能抑制虾体中WSSV的复制。
[0004]与传统抗生素的作用机理不同，ALF直接中和细菌细胞壁的脂多糖，溶解细菌，因此不易产生细菌的耐药性。ALF对病毒的作用机理目前仍不清楚。随着抗生素的应用，许多病原菌对现有抗生素逐步产生耐药性，而新型抗生素的发现又极其困难，因此，ALF的研究为开发新型抗菌药物开辟了广阔的前景。
[0005]研究发现，ALF氨基酸序列中的两个保守半胱氨酸之间形成二硫键，并与之间的氨基酸序列共同形成一段阴离子多肽，具有与LPS结合的能力，这段保守的结构命名为LPS结合结构域，被认为是ALF降解革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖的功能域。2011年，Sachin Sharma 等研究了根据锯缘青蟹(Scylla serrata)ALF的LPS结合结构域合成的具24个氨基酸残基的多肽在抗菌免疫过程中作用，发现合成多肽SsALF24具有结合LPS的活性并且对大肠杆菌都具有明显的抑制作用，其最小抑制浓度为16.16～32.32
μM(Sharma S,Yedery RD, Patgaonkar MS,Selvaakumar C,Reddy KV.Antibacterial activity of a synthetic peptide that mimics the LPS binding domain of Indian mud crab,Scylla serrata anti‑lipopolysaccharide factor(SsALF)also involved in the modulation of vaginal immune functions through NF‑kB signaling.Microbial pathogenesis 2011；50:179‑191.)。基于中国明对虾ALF的LPS结合结构域合成的多肽不但表现出明显的抗菌活性，也具有抗病毒活性(Shihao Li,Shuyue Guo,Fuhua Li,Jianhai Xiang.Functional
diversity of anti‑lipopolysaccharide factor isoforms in shrimp and their characters related to antiviral activity.Marine Drugs,2015；13(5):2602‑2616.)。[0006]令人感兴趣的是，不同种类的ALF多肽对不同细菌的抑制活性具有明显的差异，提示我们LPS结合结构域因氨基酸组成的不同，其抗菌抗病毒活性差异显著。因此，发掘更多新的LPS结合结构域类型，对于开发更多的抗微生物多肽并对其开发利用具有重要意义。基于此，我们对发现的凡纳滨对虾LvALF8的LPS结合结构域的功能活性进行了研究，利用化学合成的方法合成了环状多肽，研究了其抗菌和抗病毒生物学活性，发现其与已报道LPS结合结构域来源多肽相比具有差异明显的抗菌谱特征，且表现出更广的抗菌谱和更强的抗菌抗病毒活性，具有重要的应用前景。
发明内容
[0007]本发明旨在提供一种衍生自凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8的小分子多肽，具有明显的抗菌和抗病毒活性。
[0008]本发明的技术方案如下：
[0009]利用化学合成的方法获得了小分子多肽，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其序列特征为：
[0010]SEQ ID No.1：Ac‑c(CSYSTRPYFLRWRLKFKSKVWC)‑NH
2
[0011]所述的小分子多肽序列具有二硫键结构。其结构特征在于：小分子多肽序列氨基端第一个半胱氨酸(C)和羧基端第一个半胱氨酸(C)之间具有二硫键结构；多肽的氨基端C
)。
的氨基被乙酰化(Ac‑)，羧基端C的羧基被酰胺化(‑NH
2
[0012]所述的小分子多肽，其特征在于：所述的小分子多肽衍生自凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8。
[0013]所述的凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8，其特征为：具有序列列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，具体序列为：
[0014]MTNLRTPWTHWLTLLLLMATSMMLLSAQEMEDQENYASDIFSNIFNSLVKDGEIELLGHYCSYSTRPY FLRWRLKFKSKVWCPGWTLVYGSASESSSVSNSIQNAIINFIQKAYQEGVITEEDAKPWLQGSH。
[0015]所述的小分子多肽具有明显的抗菌抗病毒活性。具体为：对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及病毒的生长或增殖均具有很强的抑制作用。
[0016]所述的小分子多肽可作为抗菌和/或抗病毒的活性成份，可用于制备抗菌和/或抗病毒的药物或制剂中。
[0017]本发明有如下优点
[0018]1、本发明确定了一种衍生自凡纳滨对虾抗脂多糖因子LvALF8的抗菌抗病毒小分子多肽及其结构特征。
[0019]2、通过本发明可开发有效的对虾细菌类和病毒类疾病的防治药物。
附图说明
[0020]图1小分子多肽的骨架结构图；
[0021]图2小分子多肽的空间结构图；
[0022]图3小分子多肽的HPLC纯度检测图；
[0023]图4小分子多肽的MS质谱鉴定图。
具体实施方式
[0024]下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0025]一种化学合成的具有明显抗菌和抗病毒活性的小分子多肽，其序列及来源序列信息如下：
[0026](1)SEQ ID No.1的信息
[0027](a)序列特征
[0028]*长度：22氨基酸
[0029]*类型：氨基酸
[0030]*链型：单链
[0031]*拓扑结构：环形，两个半胱氨酸之间形成二硫键
[0032]*空间结构：具有1)图1所示骨架结构：两个半胱氨酸之间通过二硫键相连接，形成环状结构，其中二硫键用黑表示，C骨架及其它原子其它颜表示；和2)图2所示空间结构：多肽序列形成两个相连的β折叠结构。
[0033](b)分子类型：蛋白
[0034]序列描述：SEQ ID No.1
[0035]Ac‑c(CSYSTRPYFLRWRLKFKSKVWC)‑NH
2
[0036]其中括号内的氨基酸为成环的氨基酸，括号外左侧的小写c表示括号内的氨基酸
表示氨基酸P的羧基被乙酰为形成环状结构氨基酸；Ac‑表示氨基酸S的氨基被乙酰化；‑NH
2
化。
[0037](2)SEQ ID No.2的信息
[0038](a)序列特征
[0039]*长度：132氨基酸
[0040]*类型：氨基酸
[0041]*链型：单链
[0042]*拓扑结构：线性
[0043](b)分子类型：蛋白
[0044]序列描述：SEQ ID No.2
[0045]MTNLRTPWTHWLTLLLLMATSMMLLSAQEMEDQENYASDIFSNIFNSLVKDGEIELLGHYCSYSTRPYF LRWRLKFKSKVWCPGWTLVYGSASESSSVSNSIQNAIINFIQKAYQEGVITEEDAKPWLQGSH
[0046]所述抗菌抗病毒小分子多肽的合成、环化、纯化、鉴定及生物活性分析：[0047]通过人工化学合成途径，利用固相合成方法获得粗品多肽，经固相环化、质谱鉴定和液相谱纯化获得含有二硫键的合成小分子多肽。具体为：
[0048]1)多肽合成
[0049]采用9‑芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，从C端向N端方向合成。用10mg Rink‑Amide‑Resin树脂(AAPPTec，货号RRZ001)作为载体，依靠载体本身的活性基团与5mg被Fmoc进行氨基保护的第一个氨基酸(Fmoc‑Cys‑NH
)的羧基相连(详细方法参考文献：Panagiotis
2
Stathopoulos,Serafim Papas,Vassilios Tsikaris.C‑terminal N‑alkylated peptide
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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