(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710034922.8
(22)申请日 2017.01.17
(71)申请人 上海市公共卫生临床中心
地址 201508 上海市金山区漕廊公路2901
号科研楼308室
(72)发明人 徐建青 张晓燕 邱趁丽
(74)专利代理机构 北京德崇智捷知识产权代理
有限公司 11467
代理人 卫麟
(51)Int.Cl.
C12N 5/0783(2010.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明建立了一种体外快速扩增CD8+T细胞
CD8+T细胞的体外培养体系中，增加TLR1/2激动
剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂或联合使用上述 激动剂可显著提升CD8+T细胞的扩增效率；此外，
TLR激动剂的使用可以使常规培养条件下难以扩
增的功能性CD8+T细胞亚得以扩增，如PD-1+
CD8+T细胞、T EM CD8+T细胞等；CD8+T细胞及其功
能性细胞亚在TLRs激动剂和重组细胞因子IL-
2、IL-7、IL-15以及抗人CD3抗体和抗人CD28抗体
包被的磁珠的共同持续刺激下快速大量增殖。权利要求书2页 说明书10页 附图4页CN 106834228 A 2017.06.13
C N 106834228
A
1.一种体外诱导扩增CD8+T细胞及其功能性CD8+T细胞亚的方法，其特征在于，在CD8 +T细胞及功能性CD8+T细胞亚培养体系中添加一种Toll样受体激动剂或联合使用多种Toll样受体激动剂，配合抗人CD3抗体或抗人CD28抗体以及各种细胞因子刺激，能够显著提升CD8+T细胞及其功能性细胞亚的扩增效率与功能修复。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，Toll样受体激动剂包括但不限于TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂，以及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9激动剂，所述激动剂可单独使用，也可联合使用。
3.根据权利要求2所述方法，所述TLR1/2激动剂包括但不限于 Pam3CK4，TLR2/6激动剂包括但不限于FSL-1与Pam2CGDPKHPKSF，TLR5激动剂包括但不限于Flagellin。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述抗人CD3抗体或抗人CD28抗体包被于磁珠上进行使用。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述抗人CD3抗体可单独与TLR激动剂联合使用，也可与抗CD28抗组合后与TLR激动剂联合使用。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15，所述细胞因子
可单独使用，也可联合使用，可同一时间加入培养，也可时间上先后加入培养体系。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述功能性CD8+T细胞亚为分选纯化的PD-1+CD8+T细胞、分选纯化的CD137+CD8+T细胞、分选纯化的CD160+CD8+T细胞、分选纯化的纯真CD8+T细胞、分选纯化的中央记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应CD8+T细胞、分选纯化的过渡记忆型CD8+T细胞、分选纯化的效应干细胞CXCR5+ CD8+T细胞、分选纯化的组织记忆型CD8+T细胞。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于对功能性CD8+T细胞亚中的PD-1+CD8+T细胞进行体外扩增时，需要抗人CD3抗体和抗CD28抗体在培养体系中持续存在以持续刺激该亚的扩增。
9.根据权利要求1～8所述方法，其特征在于，体外扩增CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞的具体步骤如下：
a.分离PBMC，使用不同荧光标记的抗人CD3抗体、抗人CD8抗体、抗人PD-1抗体标记PBMC；室温避光染，使用染液重悬细胞，离心清洗，用染液重悬细胞；
b.使用流式细胞仪分选外周血单个核细胞中的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞;
c.将上述细胞分选至96孔板中的细胞静置1小时，加入Pam3CK4（ 1-300ng/ml）、FSL-1
（1-100ng/ml）、Flagellin（10-100ng/ml）、IL-7（20ng/ml
~200ng/ml）、IL-2（10U/ml
~
100U/
ml）、IL-15（10ng/ml
~100ng/ml），抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠，磁珠与细胞比
例为1:1，放置37℃培养箱培养一周;
d. 第二周将96孔板中的细胞转移至24孔板，后续根据细胞生长多少，依次将细胞转移到T25细胞培养瓶、T75细胞培养瓶、T175细胞培养瓶; 每次更换培养皿时补充相应培养基和刺激剂，直至培养到所需的细胞数量。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于：CD8+T细胞和其它功能性CD8+T细胞亚的来源包括但不限于健康人、HIV-1感染者或肿瘤患者外周静脉血，还包括各种淋巴细胞白血病、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、子宫癌、子宫颈癌、肾癌、胰腺癌、鼻咽癌、小肠癌、大 肠癌、结直肠癌、膀胱癌、骨癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、横纹肌瘤、平滑肌瘤、脑瘤，以及HIV感染、HBV感染、HCV感染、结核杆菌感染。
一种体外扩增CD8+T细胞及其细胞亚的方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种体外诱导扩增CD8+T细胞及其功能性细胞亚的方法。
背景技术
[0003]CD8+T 细胞是参与抗肿瘤与抗感染免疫的重要效应细胞，活化的CD8+T 细胞可以迅速释放高浓度的IFN-γ、IL-2 等细胞因子，具有广泛的免疫调节作用。在急性感染中，CD8+T细胞接受抗原刺激后，活化并大量增殖，分化成效应性CD8+T细胞（CTL），通过分泌穿孔素和颗粒酶（Granzyme B）杀伤被感染的细胞，或通过Fas-FasL通路诱导被感染的细胞凋亡。当病原清除后，一小部分效应性CD8+T细胞分化成记忆性CD8+T细胞，当相同抗原再次出现时，机体里的记忆性CD8+T细胞会迅速增殖、分化成为效应CTL，进而清除感染的病原体。[0004]CD8+T细胞也是机体抗肿瘤免疫的主要效应细胞之一，通过疫苗主动免疫诱导针对肿瘤特异抗原的CD8+T细胞应答是现代肿瘤免疫的发展方向之
一。然而，在正常机体能激发有效的CD8+T细胞应答的疫苗，在荷瘤机体中效果并不理想，这与多种免疫调节细胞或因子在肿瘤局部高度富集或高表达，导致肿瘤局部CD8+T细胞无能或耗竭进而形成免疫抑制的微环境相关。肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)是从肿瘤组织中发现的肿瘤抗原特异性CD4+T与CD8+T等淋巴细胞，其中CD8+T细胞具有肿瘤杀伤作用。TIL在肿瘤周围浸润的程度及CD8+T细胞所占的比例与肿瘤患者的良好预后呈明显正相关。
[0005]在慢性感染和肿瘤发生发展的过程中，抗原特异性的CD8+T细胞由于受到抗原持久的刺激，不能有效分化成记忆性T细胞而逐步演变成功能紊乱的一细胞，称之为耗竭性CD8+T细胞。这细胞表面持续性高表达PD-1抑制性受体，及CD244(2B4)，LAG-3，CD160，TIM-3，CTLA-4等抑制性受体。PD-1已被公认为是耗竭性T淋巴细胞的表面标志。研究发现：在慢性感染性疾病中，联合阻断PD-1与CTLA-4、PD-1与LAG-3、PD-1与Tim-3可部分恢复CD8+ T细胞的生物学功能；对于肿瘤抗原特异性的CD8+T细胞，联合阻断PD-1和Tim-3，或PD-1和LAG-3，也同样可部分恢复CD8+T细胞功能。尽管阻断这些通路后可部分恢复耗竭性T细胞的功能，但未能使这些耗竭性T细胞逆转成非耗竭性T细胞，从而导致肿瘤复发与转移，不能达到根治的目的。
[0006]最近Rosenberg SA的研究表明：外周血中循环的PD1+CD8+T细胞能够特异性识别黑素瘤抗原，并且与肿瘤局部表达PD-1的肿瘤侵润的特异性CD8+T具有相似的T细胞抗原受体（T cell receptor ,TCR），因此PD-1可以作为从外周血获取肿瘤特异性T细胞的一个生物标记。这为使用肿瘤特异性的淋
巴细胞或TCR癌症提供了新的非侵入性策略，并为发展个性化的提供新的方法。
[0007]近几年, 免疫发展非常迅速, 许多经体外扩增后回输患者体内的细胞疗法,
如CAR-T、DC-CIK、NKT、NK细胞等不断涌现，相应细胞的培养和扩增方法也不断的改进和完善。目前扩增患者细胞主要的技术是使用一种或多种细胞因子如白细胞介素IL-2、IL-17、IL-15配合抗CD3抗体以及CD28抗体刺激细胞的增殖。如将艾滋病患者或肿瘤患者体内的CD8+T细胞分离出来，用CD3抗体、IL-2和IL-7刺激记忆性CD8+T细胞的体外扩增。与200 IU/ ml 的IL-2 相比，在TIL体外扩增的培养体系中加入IL-15、IL-7各5 ng /ml 就可得到相同扩增倍数和体外功能的TIL。IL-15与IL-7够刺激T淋巴细胞的体外增殖，促进CD8+T细胞产生IFN-γ，维持中央记忆性CD8+T细胞的表型，并减少调节性T细胞（CD4+CD25+Treg）的数量，对肿瘤细胞能起到很好的控制作用。因此，低剂量IL-15与IL-7联合使用可代替高剂量IL-2 应用于TIL的体外扩增。黑素瘤TIL 扩增培养体系中加入抗CD3 抗体后可显著提高TIL扩增倍数。
[0008]然而，抗肿瘤免疫必备的特定功能性细胞亚如PD-1+CD8+T细胞、TEM CD8+T细胞等，在常规培养条件下却难以扩增，迄今为止尚缺乏体外快速扩增PD1+CD8+T细胞的方法。文献报道从癌症患者中分选的PD1+CD8+T细胞体外扩增效率有限，而且扩增出的细胞具有分泌IFN-γ的能力的一般不足20%，难以满足抗肿瘤免疫与抗感染免疫的需求。如何进一步提升CD8+T细胞及其PD1+CD8+T细胞亚
的扩增效率、特别是有效扩增功能性CD8+T细胞的能力，以增强抗感染和抗肿瘤疗效是亟待解决的难题。
[0009]因此，快速高效的扩增CD8+T细胞及其功能亚并回输至患者体内，将是疾病的安全有效的方法，在保障技术安全性的同时，进一步提升肿瘤的有效性。
[0010]
发明内容
[0011]本发明所解决的技术问题是：建立一种CD8+T细胞及其功能性细胞亚的扩增方法，尤其是对被认为是耗竭性的PD-1+CD8+T细胞进行扩增的方法。通过添加Toll样受体（Toll like receptor，TLR）激动剂，如TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂或多种组合等，极大提升CD8+T细胞体外扩增效率，并有效扩增PD-1+CD8+T细胞等功能性细胞亚。[0012]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种体外诱导扩增CD8 +T细胞及其功能性CD8+T细胞亚的方法，在CD8+T细胞及功能性CD8+T细胞亚培养体系中添加一种Toll样受体激动剂或联合使用多种Toll样受体激动剂，配合抗人CD3抗体或抗人CD28抗体以及各种细胞因子刺激，能够显著提升CD8+T细胞及其功能性细胞亚的扩增效率与功能修复。
[0013]其中，Toll样受体激动剂包括但不限于TLR1/2激动剂、TLR2/6激动剂、TLR5激动剂，以及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9激动剂，所述激动剂可单独使用，也可联合使用。TLR1/ 2激动剂包括但不限于 Pam3CK4，TLR2/6激动剂包括但不限于FSL-1与Pam2CGDPKHPKSF，TLR5激动剂包括但不限于Flagellin。所述抗人CD3抗体或抗人CD28抗体包被于磁珠上进行使用。所述抗人CD3抗体可单独与TLR激动剂联合使用，也可与抗CD28抗组合后与TLR激动剂联合使用。所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15，所述细胞因子可单独使用，也可联合使用，可同一时间加入培养，也可时间上先后加入培养体系。
[0014]此外，所述功能性CD8+T细胞亚为分选纯化的PD-1+CD8+T细胞、分选纯化的CD137+CD8+T细胞、分选纯化的CD160+CD8+T细胞、分选纯化的纯真CD8+T细胞、分选纯化的
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