(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010085140.9
(22)申请日 2020.02.10
(71)申请人 上海海洋大学
地址 201306 上海市浦东新区沪城环路999
号
(72)发明人 王浩 吕利 苏美珍
(74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有
限公司 31227
代理人 周一新
(51)Int.Cl.
A61K 31/4375(2006.01)
A61P 31/22(2006.01)
(54)发明名称
型的用途
(57)摘要
本发明涉及一种鱼类抗病毒药物，公开了盐
酸小檗碱在水产养殖中抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的用
途，特别是盐酸小檗碱(BBH)在制备鱼类抗鲤疱
疹病毒Ⅱ型(CyHV -2)药物中的用途，
以盐酸小檗碱为活性成分，且其一次性使用剂量不低于
50mg/Kg，给药方式为拌饲投喂。本发明发现盐酸
小檗碱具有抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的功能，可用于水
产养殖中鱼类预防和控制鲤疱疹病毒Ⅱ型，且效
果显著。权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 111067898 A 2020.04.28
C N 111067898
A
1.盐酸小檗碱(BBH)在制备鱼类抗鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV -2)药物中的用途。
2.一种鱼类抗鲤疱疹病毒Ⅱ型药物，其特征在于，所述药物以权利要求1所述的盐酸小檗碱为活性成分，或还包括药学上可接受的辅料或辅助成分。
3.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述盐酸小檗碱的一次性使用剂量不低于50mg/Kg。
4.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为粉剂。
5.如权利要求2～4任一项所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式为拌饲投喂。
权 利 要 求 书1/1页CN 111067898 A
盐酸小檗碱在水产养殖中抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的用途
技术领域
[0001]本发明涉及一种鱼类抗病毒药物，具体涉及盐酸小檗碱在水产养殖中抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的用途。
背景技术
[0002]鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinidherpesvirus2，CyHV-2)是一种引起金鱼和鲫造血器官坏死病的高致病性病毒，严重危害鲫和金鱼养殖业，2012年导致江苏异育银鲫发病面积约3万hm2，发病区域死亡率在50％以上，严重地区达90％，部分养殖池塘绝收，造成严重的经济损失。
[0003]目前，防控鲤疱疹病毒Ⅱ型方法主要有：
[0004]1)加入免疫抑制剂。如在饲料中拌入酵母多糖，适量添加多种维生素、免疫多糖制剂以及肠道微
生态制剂等可明显提高鱼体细胞免疫活性，改善鱼体内代谢环境，提高鱼体健康水平和抗感染能力。 [0005]2)改善养殖模式。改善单养异育银鲫为多品种混养，改善养殖环境来减少疾病风险；或使用光合细菌、芽孢杆菌、反硝化细菌等微生态制剂以及底质改良剂和水质调节剂，有效保持养殖水环境的稳定，减少鱼体应激。
[0006]3)外用药物防治。如碘制剂用于鱼卵消毒与水体消毒来防治病毒性疾病。[0007]4)利用鲤疱疹病毒Ⅱ型体外细胞感染模型扩增病毒制备灭活疫苗或利用感染鲤疱疹病毒Ⅱ型鲫鱼制备组织灭活的疫苗预防鲫造血器官坏死病。
[0008]但是，采用上述免疫抑制剂、改善养殖模式或外用消毒剂防治等方法缺乏特异性，效果不显著；采用灭活疫苗防控鲤疱疹病毒Ⅱ型目前尚没有商品化上市的产品，且研究级的中试产品稳定性较差、保护利率较低，操作复杂。
[0009]盐酸小檗碱(Berberine hydrochloride，BBH)是一种异喹啉生物碱，又称为黄连素，是中药黄连、黄柏根茎中的主要成分。研究发现盐酸小檗碱具有广谱抗菌作用，体外对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑制作用，对溶血性琏球菌(Staphylococcus haem olytica)、金葡萄球菌(Staphk，lococcusaureus)、痢疾杆菌(Shigella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弧菌(Vibrio)等均有较强的抑制作用，水产养殖中多用于细菌性肠炎病、鳗鲡红点病、鳖红脖子病、龟肠胃炎等细菌性疾病目前还未
见关于盐酸小檗碱抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的研究报道。
发明内容
[0010]本发明提供盐酸小檗碱(BBH)在水产养殖中抗鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的用途，特别是盐酸小檗碱在制备鱼类抗鲤疱疹病毒Ⅱ型药物中的用途。
[0011]本发明还提供一种鱼类抗鲤疱疹病毒Ⅱ型药物，以所述的盐酸小檗碱为活性成分，或还包括药学上可接受的辅料或辅助成分。
[0012]在优选的实施方案中，所述盐酸小檗碱的一次性使用剂量不低于50mg/Kg；和/或
所述药物的剂型为粉剂；和/或所述药物的给药方式为拌饲投喂。
[0013]与现有技术相比，本发明发现盐酸小檗碱具有抗鲤疱疹病毒Ⅱ型活性的功能，可用于水产养殖中鱼类预防和控制鲤疱疹病毒Ⅱ型，且效果显著。
附图说明
[0014]图1是100％BBH孵育RyuF-2细胞120h后的细胞活性。
[0015]图2是CyHV-2感染RyuF-2细胞120h后细胞病变情况的电镜照片。
[0016]图3是不同BBH浓度孵育120h后CyHV-2感染RyuF-2细胞感染率。
[0017]图4是不同BBH浓度孵育120h后CyHV-2感染RyuF-2细胞中CyHV-2病毒主要基因复制情况。
[0018]图5是口灌不同剂量的55.42％BBH后感染CyHV-2异育银鲫的死亡数。
[0019]图6是口灌不同剂量的55.42％BBH后异育银鲫各组织内的药代动曲线，其中，A：血液，B：肝胰脏，C：肾脏。
具体实施方式
[0020]下面结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0021]下面实施例中以RyuF-2细胞(金鱼鳍条细胞)验证盐酸小檗碱对鲤疱疹病毒Ⅱ型的作用，所用原料100％纯度的BBH购自selleck公司。其中，盐酸小檗碱(BBH)，又名盐酸黄连素、盐酸小檗碱、小檗碱盐酸盐，CAS号为633-65-8，分子式为C20H18NO4.Cl，结构式为
[0022]
[0023]熔点200℃，黄结晶性粉末，无臭，或微有特异性的气味，味极苦；溶于热水，微溶于冷水或乙醇，极微溶于氯仿，不溶于乙醚。其药理作用：对痢疾杆菌、菌金黄葡萄球菌、沙门氏菌、变形杆菌有抗菌作用，与肠内的产生吲哚、甲基吲哚等有害氨基物的酶相拮抗，抑制肠内的腐败发酵，抑制离体的肠道蠕动作用，促进肝脏内胆汁的生成，有促进胆汁分泌的作用。
[0024](1)体外抗病毒实验用RyuF-2细胞培养，方法如下：将购得的Medium199培养基，另加入10％胎牛血清、1％青霉素。再将RyuF-2细胞用胰酶消化后，传入T25瓶，待细胞长至95％时更换为维持培养基(内含5％胎牛血清的M199培养基)。
[0025](2)BBH处理RyuF-2细胞，方法如下：
[0026]5μg/mLBBH：加入含5μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
[0027]10μg/mLBBH：加入含10μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的
DMSO)处理120h后取样。
[0028]15μg/mLBBH：加入含15μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
[0029]20μg/mLBBH：加入含20μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
[0030]25μg/mLBBH：加入含25μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理120h后取样。
[0031]12.5μLDMSO：加入12.5μLDMSO(抵消同等体积用于溶解BBH给实验带来的影响)处理120h后取样。
[0032]NC：空白处理组，120h后取样。
[0033](3)BBH处理鲤疱疹病毒Ⅱ型感染RyuF-2细胞，方法如下：
[0034]5μg/mLBBH+CyHV-2：加入含5μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h，然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI＝0.001)，病毒吸附2h后吸出，更换为含5μg/mLBBH的M199维持培养基，120h后取样。
[0035]10μg/mLBBH+CyHV-2：加入含10μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h，然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI＝0.001)，病毒吸附2h后吸出，更换为含10μg/mLBBH的M199维持培养基，120h后取样。
[0036]15μg/mLBBH+CyHV-2：加入含15μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h，然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI＝0.001)，病毒吸附2h后吸出，更换为含15μg/mLBBH的M199维持培养基，120h后取样。
[0037]20μg/mLBBH+CyHV-2：加入含20μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DMSO)处理0.5h，然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI＝0.001)，病毒吸附2h后吸出，更换为含20μg/mLBBH的M199维持培养基，120h后取样。
[0038]25μg/mLBBH+CyHV-2：加入含25μg/mLBBH的M199维持培养基(内含12.5μL用于溶解BBH的DM
SO)处理0.5h，然后加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI＝0.001)，病毒吸附2h后吸出，更换为含25μg/mLBBH的M199维持培养基，120h后取样。
[0039]CyHV-2：加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI＝0.001)，病毒吸附2h后吸出，更换为M199维持培养基，120h后取样。
[0040]12.5μLDMSO+CyHV-2：加入12.5μLDMSO(抵消同等体积用于溶解BBH给实验带来的影响)，加入鲤疱疹病毒Ⅱ型(MOI＝0.001)，病毒吸附2h后吸出，更换为M199维持培养基，120h后取样。
[0041]12.5μLDMSO：加入12.5μLDMSO(抵消同体积用于溶解BBH给实验带来的影响)，120h 后取样。
[0042]NC：空白处理组，120h后取样。
[0043]通过显微镜观察并拍照，100％BBH孵育RyuF-2细胞120h后的细胞活性如图1所示，可见不同浓度细胞活性均适用于以下实施例试验。
[0044]如图2所示，CyHV-2感染细胞120h后细胞病变情况可以看出：CyHV-2处理组、12.5μLDMSO+CyHV-2处理组出现明显CPE；5μg/mLBBH+CyHV-2处理组出现明显CPE，但CPE数量随着BBH浓度增大而减少；NC组、12.5μLDMSO组、10μg/mLBBH+CyHV-2处理组、15μg/mLBBH+CyHV-2
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