(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010110769.4
(22)申请日 2020.02.24
(71)申请人 中南大学湘雅二医院
地址 410011 湖南省长沙市芙蓉区人民中
路139号
(72)发明人 陆前进 吴海竞 李倩文 周素清
赵明
(74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所(普
通合伙) 43114
代理人 袁靖
(51)Int.Cl.
A01K 67/027(2006.01)
(54)发明名称
构建方法和应用
(57)摘要
本发明提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小
鼠模型及其构建方法和应用。本发明构建的人源
统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞联合紫外
线(UVB)刺激来进行构建。即裸鼠(T淋巴细胞缺
陷)在经过疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周
血单个核细胞人源化处理后，予以适当剂量的
UVB连续照射。本发明提供的人源化皮肤型红斑
狼疮小鼠模型较好的模拟了狼疮患者异常活化
的免疫细胞在小鼠皮肤对UVB刺激下产生的免疫
反应。该模型可用于探讨红斑狼疮疾病进展的发
生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发等研究，对
加快推进科研临床转化方面意义重大。权利要求书1页 说明书13页 附图3页CN 111149767 A 2020.05.15
C N 111149767
A
1.一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法，其特征在于，将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞皮下注射裸鼠，联合UVB照射处理。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的皮下注射部位为背部。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，皮下注射的细胞个数至少1×107个。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于；采用每日总辐照剂量为200-500mJ/cm 2高剂量UVB照
射至造模小鼠出现持续性瘢痕样，优选每日总辐照剂量为250-350mJ/cm 2，进一步优选300mJ/cm 2；之后采用每日总辐照剂量为80-120mJ/cm 2低剂量UVB照射维持皮损，优选每日总辐照剂量为100mJ/cm 2，直至建模完成。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射前先用高剂量UVB照射2-4天，优选3天，然后将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射到裸鼠皮下部位，此后继续用此辐照剂量连续照射1周-3周；然后将低剂量UVB继续连续照射1-3周，停止UVB辐照。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，小鼠在行疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞皮下注射之前，按照每日10×100uW/cm 2强度UVB照射300s，，连续UVB照射3天后，将刚分离的1×107细胞数的疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射到裸鼠背部皮下部位；此后继续予小鼠每日相同强度和时间紫外辐照处理，直至造模裸鼠存在持续性瘢痕样红斑，然后每日予以10×100uW/cm 2强度UVB照射100s照射连续1-3周，以维持皮损形态，即建立稳定的模型。
7.权利要求1-6任一项所述的方法构建而成的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型。
8.权利要求7所述的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型在探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发中的应用。
9.疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞和紫外线在制备构建人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型工具中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 111149767 A
一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型及其构建方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于动物实验模型及其制备技术领域，具体涉及人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型及其构建方法和应用。
背景技术
[0002]红斑狼疮(Lupus erythematosus,LE)是一种多因素参与的慢性自身免疫性疾病。大多数红斑狼疮患者存在皮肤受累，其中根据系统脏器受累情况可分为皮肤型红斑狼疮(cutaneous lupus erythematosus,CLE)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)两大类。CLE病变主要局限于皮肤，而SLE常急性发病，伴多系统受累，严重者可危及生命。红斑狼疮是一种持续性、进行性疾病。临床上，有近半数CLE患者在疾病发病后的几年内会出现白细胞减少、关节痛、尿蛋白异常等系统受累情况。目前，关于CLE与SLE的分子机制上的区别或导致CLE患者进展为SLE的机制，人们知之甚
少，其中很大原因在于缺乏理想的CLE动物模型。
[0003]以人本身作为实验对象来进行疾病分子机制及药物靶向研究，不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。因此我们必须借助于动物模型的间接研究，在有意识地改变一些自然条件下不可能或不易排除的因素后，可更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于有效地认识疾病的发生发展规律，在科研临床转化和疾病精准的推进中起重要作用。然而，现有的多数红斑狼疮小鼠模型都是基于对SLE的研究需求而建立的，具有与SLE易感性相关的遗传背景，如NZB/W F1小鼠7、MRL/lpr小鼠8和BXSB/Yaa小鼠模型。这些小鼠模型主要症状是狼疮样肾炎和自身抗体的产生，皮损的发生并不稳定，一般在造模后期偶有面颈部皮肤的大面积溃烂结痂，故并不能用于CLE到SLE进展的发病机制探讨及靶向红斑狼疮皮损的药物研发。
[0004]截至目前，还没有任何的人源化CLE小鼠模型。考虑到小鼠与人免疫系统存在的实质性差异，构建人源化CLE小鼠模型能更全面地再现人CLE发病的复杂性。若能构建一种较理想的人源化CLE小鼠模型(存在类似人CLE的皮肤损伤，且无系统受累情况)，将使科研工作者及临床医生更好的了解红斑狼疮皮肤损伤的发病机制，有助于CLE向SLE发展的机制研究以及靶向红斑狼疮皮损免疫的转化研究。本发明提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法。利用疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)联合紫外线UVB刺激来进行构建。即裸鼠(T淋巴细胞缺陷)在经过疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞人源化处理后，予以适当剂量的
UVB连续照射。本发明操作简单，造模时间短，较好的模拟了人CLE的皮损改变，可用于探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发等研究。
发明内容
[0005]本发明的首要目的在于提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法。本发明可较好的模拟人CLE的皮损改变，填补了目前人源化CLE动物模型的空白，而且操作简
单，造模时间短。
[0006]本发明的方法首次将来自系统性红斑狼疮患者的异常活化免疫细胞用于构建小鼠CLE疾病模型，并结合合适的紫外线(UVB)照射处理，构建出目前最佳模拟人CLE的皮损改变的动物模型。
[0007]一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法：将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞皮下注射裸鼠，联合UVB照射处理。
[0008]本发明尝试了两组不同疾病活动度的系统性红斑狼疮患者(活跃期：在规律接受激素及其它免疫抑制剂的下其疾病活动性评分(SLEDAI评分)≥8)；非活跃期：在规律接受激素及其它免疫抑制剂的下其疾病活动性评分(SLEDAI评分)≤4)外周血单个核细胞来进行模型构建，由于非活跃期的患者在规律接受激素及其它免疫抑制剂的下，其外周血免疫细胞活性受抑制，故同样的UVB照射处理情况下，
非活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞处理组未能诱发出CLE样皮损(见附图4a)。
[0009]进一步的，所述的构建方法，所述的皮下注射是注射在小鼠背部皮下脂肪层。用拇指和食指捻起3-5cm宽度的皮肤，把这块皮肤挤到一起使皮下形成空隙方便注射，确保所有的细胞注射到了脂肪层而不是其下面的肌肉里(本小鼠为无毛型免疫缺陷鼠，故注射前不需要做被毛处理)。
[0010]进一步的，所述的构建方法，疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的注射量不可少于1×107细胞数(细胞悬液体积为150-200ul)。
[0011]注射部位为小鼠背部中央区域，注射完成后可形成直径1cm左右隆起的皮丘。鉴于至今没有人外周血单个核细胞皮下注射来进行动物造模人源化的相关研究，本发明模型构建时对比了不同疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射量的造模效果(1×106、5×106、1×107)，同样的UVB照射处理情况下，1×106和5×106个细胞注射无法诱发CLE样皮损(见附图4b)。
[0012]进一步的，所述的构建方法，
[0013]采用每日总辐照剂量为200-500mJ/cm2高剂量UVB照射至造模小鼠出现持续性瘢痕样，优选每日总辐照剂量为250-350mJ/cm2，进一步优选300mJ/cm2；之后采用每日总辐照剂量为80-120mJ/cm2低剂量UVB照射维持皮损，优选每日总辐照剂量为100mJ/cm2，直至建模完成。
[0014]模型构建时设立了3组不同UVB剂量来诱发皮损(100mJ/cm2、300mJ/cm2、600mJ/ cm2)，接受同样注射剂量的疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的情况下，不同剂量UVB连续照射3周后，100mJ/cm2处理组未能诱发出CLE样皮损，而600mJ/cm2处理组因紫外剂量过高，致使小鼠皮肤出现菜花样癌变(见附图4c)。故诱发CLE样皮损的理想紫外剂量优选为每日辐照总剂量300mJ/cm2。
[0015]在成功诱发出CLE样皮损后，需用低剂量UVB连续照射3周。这个方法的获得是基于造模尝试初期，我们设立了对照组(仅予以同样剂量紫外照射，未行人疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的皮下注射)，对照组在予以连续3周高剂量UVB照射后，部分小鼠可出现红斑脱屑等皮肤损伤，系正常皮肤经较强UVB照射后产生的一种急性炎症反应，临床上，在接受UVB的光激发试验后，有20％左右的正常人可出现日光性皮炎。我们设立的对照组小鼠，在接受UVB照射后出现的皮肤损伤与人的反应类似。故在3周高剂量UVB照射
后，需调低紫外剂量使这种非CLE皮损消退，以排除日光性皮炎的混合影响。此处我们予以调低紫外剂量而非停止紫外照射的原因为，本模型需尽可能模拟人日常紫外照射情况。鉴于临床上，常有狼疮患者因爬山或旅游等原因，较长时间暴露于紫外下(3-5小时)，从而导致皮损的发生或加重。而正常情况下(非户外工作者)人们每日紫外暴露时间为1-1.5小时左右，即紫外过度暴露时间近似为紫外日常暴露时间的3倍。故我们将维持期的UVB剂量设置优选为每日辐照总剂量100mJ/cm2。
[0016]进一步的，所述的构建方法，疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射前先用高剂量UVB照射2-4天，优选3天，然后将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射到裸鼠皮下部位，此后继续用此辐照剂量连续照射1周-3周；然后将低剂量UVB继续连续照射1-3周，停止UVB辐照。
[0017]此处模型构建要在细胞皮下注射前先用UVB连续照射3天的原因为：本模型模拟的是人CLE皮损的发生。大量研究表明红斑狼疮患者在紫外诱导下，凋亡的角质形成细胞增加了自身抗原的暴露，促使异常活化的免疫细胞的炎症级联反应，进而可能导致皮损的发生。基于此可能性，在人源细胞接种到小鼠皮下前，需先予以高剂量UVB照射处理，诱发凋亡并释放足量可引发人源免疫细胞反应的自身抗原，进而导致狼疮样皮肤损伤。
[0018]本发明的第二个目的是提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型，是由上述方法构建得到的，是目前最佳模拟人CLE的皮损改变的动物模型。
[0019]本发明的第三个目的是提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的应用。[0020]具体包括人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型在探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发中的应用，具有重大的医学意义。
[0021]本发明的第四个目的是提供疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞和紫外线在制备构
建人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型工具中的应用。
[0022]本发明所指的裸鼠为T淋巴细胞缺陷小鼠。
[0023]本发明在人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型构建中发现以下这些因素也会影响模型构建是否成功。
[0024]1、保证购入的裸鼠健康质检达标：
[0025]因裸鼠免疫机能的缺陷，易受微生物、病毒和寄生虫感染，特别是易受小鼠肝炎病毒的感染，一旦裸鼠在繁育时感染上小鼠肝炎，同窝裸鼠会于生后数月内相继死亡，无一幸免。病鼠肝脏发生大理石样变化，质较硬，呈黄、粗造、结节样、边缘不齐，偶伴有脾肿大。在裸鼠的饲养中，常易发生所谓的“消耗性综合征”，即在饲养1-2月后，小鼠逐渐出现食欲不振，体形消瘦直至死亡，在死前1周体重下降明显，死后肝脏组织病理学检查可见泛发性凝固性坏死。这种消耗性综合征实与购入裸鼠存在病毒性肝炎感染有关。本小鼠模型构建中，第二批实验小鼠即出现此类症状，应与购入的裸鼠健康质检不达标有关，因此在选择订购的裸鼠饲养基地时，应慎重评估，一旦出现大批小鼠饲养过程中显著消瘦死亡的情况，及时更换订购方，确保造模的顺利进行。
[0026]2、采集外周血时，要严格筛选入组样本：
[0027]本模型构建的尝试中，曾因采集了经过激素冲击的SLE患者的外周血(因此类患者病情较重，
在收治之际即采取大剂量激素冲击来快速稳定病情，故同非活跃患者一样，免疫细胞活性处于被抑制状态)，从而导致对应皮下注射小鼠皮损诱发失败的情况
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