(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710863891.7
(22)申请日 2017.09.22
(71)申请人 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公
司
地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新大道999号
(72)发明人 李翔宇 陆姝欢 余超 杨艳红
汪志明
(74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利代理有限
公司 42102
代理人 乔宇
(51)Int.Cl.
C12P 5/02(2006.01)
C12N 1/14(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及制备番茄红素的方法。制备番茄
红素的方法，其特征在于：对种子阶段的三孢布
素；所述的酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶或
脂肪酶其中的一种或二至四种任意混合形成的
复合酶。通过将三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液
酶处理，减少菌体中菌丝之间的粘连和缠绕，使
菌丝分布更加分散，由此达到当菌体混合后，增
加正负菌体间的接合效率，增加接合孢子的生
产，
从而提高菌体中番茄红素的产量的目的。权利要求书1页 说明书9页 附图1页CN 109536534 A 2019.03.29
C N 109536534
A
1.制备番茄红素的方法，其特征在于：对种子阶段的三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌分别进行酶解处理后，再以一定比例混合再进行发酵培养；收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取番茄红素；所述的酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶或脂肪酶其中的一种或二至四种任意混合形成的复合酶。
2.根据权利要求1所述的制备番茄红素的方法，其特征在于：种子阶段的三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌是在均匀的液体培养基中于摇瓶或发酵罐培养的。
3.根据权利要求1所述的制备番茄红素的方法，其特征在于：所述酶处理为将三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液分别在适宜三孢布拉氏霉菌生存的温度和pH范围内加入酶进行酶解处理。
4.根据权利要求1所述所述的制备番茄红素的方法，其特征在于：所述酶活性为果胶酶10000-1000000U/g；纤维素酶10000-800000U/g；中性蛋白酶100000-1500000U/g；脂肪酶10000-200000U/g。
5.根据权利要求1所述的制备番茄红素的方法，其特征在于：酶处理时酶的用量为三孢布拉氏霉菌正菌种子液或三孢布拉氏霉菌负菌种子液菌体干重的0.1％-1％，酶解体系pH 为5.0-7.5，酶解温度25-30℃，酶解处理时间为1-4小时。
6.根据权利要求1所述的制备番茄红素的方法，其特征在于：所述的酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶、脂肪酶按质量比为2-4：0-4：1-2：1-2的组合，酶用量为三孢布拉氏霉菌正菌种子液或三孢布拉氏霉菌负菌种子液菌体干重的0.05％-0.5％，酶解体系pH为5.0-
7.5，25-30℃，酶解时间0.5-2h。
7.根据权利要求1所述的制备番茄红素的方法，其特征在于：所述三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液以三孢布拉氏霉菌正、负菌干菌体质量计，按质量比1:1-1:50混合后进行发酵培养。
8.根据权利要求1所述的制备番茄红素的方法，其特征在于：包括以下具体步骤：
(1)取三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行斜面培养；
(2)将步骤(1)斜面培养的三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行种子培养，和根据需要进行种子放大培养；
(3)将步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液采用酶处理，然后按照一定的比例混合，最后进行发酵培养；
(4)收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取番茄红素。
权 利 要 求 书1/1页CN 109536534 A
制备番茄红素的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种制备番茄红素的方法，尤其是一种使用三孢布拉氏霉菌制备番茄红素的方法。
背景技术
[0002]番茄红素是一种脂溶性类胡萝卜素，具有高效猝灭单线态氧和清除自由基的作用，其抗氧化性在类胡萝卜素中最强，且对预防心血管疾病、增强机体免疫力以及延缓衰老等都具有一定的作用，是一种很有开发价值的功能性天然素。
[0003]番茄红素原料的生产，主要有植物提取法、化学合成法和微生物发酵法。植物提取法所需要的原料主要是番茄，番茄种植受气候、产地、运输等条件限制，且提取工艺繁琐冗长，成本昂贵，不能满足工业化生产的需求。化学合成法尽管成本较低，但其对环境影响比较大，且产品活性较低，因此应用范围受到极大限制。采用微生物发酵法生产番茄红素，其产品质量和生理活性和天然提取产品完全相同，且不受环境条件限制，具有产量高、成本低、安全性高、易于被人体吸收等优点。
[0004]目前，工业上利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素，主要是将三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌在种子培养阶段分开培养，之后将正菌和负菌的种子液以一定的比例混合后再接入发酵培养基中培养。如中国专利申请CN103276018和CN106047944A均是在发酵培养时，将三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的种子液以一定的比例混合后再接入发酵培养基中培养，但其发酵产量较低。现有提高三孢布拉氏霉菌产番茄红素产量的方法主要是增加溶氧和添加前体物质。增加溶氧通常采取的措施是通过增加鼓风或强制通氧，但是这种方法需要耗费大量的能源，增加成本，对工业化生产造成困
难。也有在发酵液中添加氧载体正十二烷等，但会对菌体造成伤害。添加前体物质的报道也有很多，但是效果不是很理想，而且还会增加成本。本发明旨在提供一种简便易行，更有效的提高番茄红素的产量的方法。
发明内容
[0005]本发明的目的是提供制备番茄红素的方法。该方法简便易行，可有效提高番茄红素的产量。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007]提供制备番茄红素的方法，将三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌分开培养得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液分别进行酶解处理后混合发酵培养制备番茄红素；收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取番茄红素；所述的酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶或脂肪酶其中的一种或二至四种任意混合形成的复合酶。使用酶处理可酶解菌丝体之间粘连的胶质、蛋白、油脂等，减少菌体中菌丝之间的粘连和缠绕，使菌体的菌丝分布更加分散。
[0008]按上述方案，种子阶段的三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌是在均匀的
液体培养基中于摇瓶或发酵罐培养的。
[0009]按上述方案，所述酶处理为将三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液分别在适宜三孢布拉氏霉菌生存的温度和pH范围内加入上述酶进行酶解处理。[0010]按上述方案，所述酶活性为果胶酶10000-1000000U/g；纤维素酶10000-800000U/ g；中性蛋白酶100000-1500000U/g；脂肪酶10000-200000U/g。
[0011]按上述方案，酶处理时酶的用量为三孢布拉氏霉菌正菌种子液或三孢布拉氏霉菌负菌种子液菌体干重的0.1％-1％，酶解体系pH为5.0-7.5，酶解温度25-30℃，酶解处理时间为1-4小时。
[0012]按上述方案，所述的酶优选为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶、脂肪酶按质量比为2-4：0-4：1-2：1-2的组合，酶用量0.05％-0.5％，酶解体系pH6.0-7.5，酶解温度25-30℃，酶解时间0.5-2h。本发明优选将果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶、脂肪酶按质量比为2-4：0-4：1-2：1-2组成的组合酶对三孢布拉氏霉菌种子液进行组合酶解处理，可更有利于酶解菌丝体之间粘连的胶质、蛋白、油脂等，减少菌体中菌丝之间的粘连和缠绕，使菌体的菌丝分布更加分散，由此可达到更佳的效果，且快速高效。
[0013]按上述方案，所述三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液以三孢布拉氏霉菌正、负菌干菌体质量计，按质量比为1:1-1:50优选为1:5-1:10混合后进行发酵培养(干菌体质量：分别取一定体积的正、负菌种子液，干燥处理后测得)。
[0014]按上述方案，上述制备番茄红素的方法，包括以下具体步骤：
[0015](1)取三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行斜面培养；
[0016](2)将步骤(1)斜面培养的三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行种子培养，和根据需要进行种子放大培养；
[0017](3)将步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液采用酶处理，然后按照一定的比例混合，最后进行发酵培养；
[0018](4)收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取番茄红素。
[0019]本发明具有如下有益效果：
[0020]三孢布拉氏霉菌正、负菌混合培养生产番茄红素中，正、负菌的菌丝体相互接触、融合，不断生成接合孢子，进而合成番茄红素。正、负菌的接合程度对番茄红素的产量有直接影响，目前的工艺技术均是分别培养正负菌后直接进行混合发酵生产番茄红素，然而，三孢布拉氏霉菌正负菌为丝状真菌，浓度达到一定程度之后菌丝相互缠绕，正负菌混合后接触的概率显著降低，从而导致接合孢子的量减少，进而影响了番茄红素产量，目前行业内没有任何相关技术解决该问题。本发明在将三孢布拉氏霉菌正负菌混合发酵前，通过将三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液酶处理，减少菌体中菌丝之间的粘连和缠绕，使菌丝分布更加分散，由此达到当菌体混合后，增加正负菌体间的接合效率，增加接合孢子的生产，从而提高菌体中番茄红素的产量的目的。
附图说明
[0021]图1为显微镜放大40倍，酶处理前后的菌丝形态图。酶处理前菌丝缠绕聚集在一起，使用0.1％果胶酶在pH5.0，30℃的条件下处理1小时后，菌丝分散均一。果胶酶分散效果最好，其次是纤维素酶，中性蛋白酶和脂肪酶分散效果。
[0022]图2为将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别酶解处理后混合进行发酵，发酵结束时的生物量示意图；
[0023]D1使用0.1％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理1h；
[0024]D2使用0.1％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理1h；
[0025]D3使用0.1％中性蛋白酶，在pH7.5,30℃条件下处理1h；
[0026]D4使用0.1％脂肪酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
[0027]D5使用0.1％的果胶酶和纤维素酶按质量比为1:1组成的复合酶，在pH6.0,30℃条件下处理1h；
[0028]D6使用0.1％果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶组成的复合酶按质量比为2:1:1，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
[0029]D7使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为2:2:1:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
[0030]D8使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:2:2:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
[0031]D9使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为4:3:2:2组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理2h；
[0032]D10使用0.1％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h；
[0033]D11使用0.3％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h；
[0034]D12使用0.8％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h；
[0035]D13使用1％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h；
[0036]D14使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:2:1:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
[0037]D15使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理1h；
[0038]D16使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理2h；
[0039]D17使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理3h；
[0040]D18使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理4h；
[0041]D19使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:3:2:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
[0042]D20使用0.3％的纤维素酶和中性蛋白酶按质量比为2:1组成的复合酶，在pH6.0, 25℃条件下处理2h；
[0043]D21使用0.05％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH6.0,28℃条件下处理2h；
[0044]D22使用0.2％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH6.5,25℃条件下处理1h；
[0045]D23使用0.5％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH7.0,30℃条件下处理0.5h。
具体实施方式
[0046]下面通过实施例对本发明作详细说明。应理解，这些实施例只是为了具体说明本
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