[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1842541A [43]公开日2006年10月4日
[21]申请号200480021897.0[22]申请日2004.07.01
[21]申请号200480021897.0
[30]优先权
[32]2003.07.02 [33]US [31]60/483,894
[32]2004.02.19 [33]US [31]60/545,471
[86]国际申请PCT/DK2004/000470 2004.07.01
[87]国际公布WO2005/003168 EN 2005.01.13
[85]进入国家阶段日期2006.01.27[71]申请人诺沃挪第克公司
地址丹麦鲍斯韦
共同申请人伊纳特医药两合公司 热纳亚大学
[72]发明人S·B·帕德克杰尔 A·莫雷塔 M·D·
谢萨 P·安德烈 L·戈捷 P·A·N·R·
瓦格特曼
[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所代理人程泳
[51]Int.CI.C07K 16/28 (2006.01)G01N 33/52 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 59 页 附图 10 页
[54]发明名称
[57]摘要
方法。本发明更具体地涉及调节哺乳动物受试者体
内NK细胞活性、并允许NK细胞细胞毒性增强的特异
及含有它们的药物组合物、及其具体在中增加
受试者体内NK细胞活性或细胞毒性中的用途。
200480021897.0权 利 要 求 书第1/2页 1.产生抗体的方法，所述抗体与多种KIR2DL基因产物交叉反应并中和这类KIR的抑制活性，所述方法包括步骤：
(a)以含有K I R2D L多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；
(b)从所述免疫的哺乳动物制备抗体，其中所述抗体与所述KIR2DL多肽结合，
(c)选择(b)中的抗体，所述抗体与至少两种不同的KIR2DL基因产物交叉反应，并且
(d)选择(c)中的抗体，所述抗体增强NK细胞
(e)选择抗体，所述抗体与灵长动物NK细胞或KIR多肽结合。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(e)中的灵长动物是猕猴。
3.评估抗体毒性的方法，其中将根据权利要求1或2的方法产生的抗体施用于灵长动物。
4.根据权利要求3的方法，其中灵长动物是猕猴。
5.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图12中列出的DF-200的轻链可变区序列。
6.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图12中列出的Pan2D的轻链可变区序列。
7.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图12中列出的DF-200的一个或多个轻链可变区CDR。
8.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图12中列出的Pan2D的一个或多个轻链可变区CDR。
9.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图13中列出的DF-200的重链可变区序列。
10.抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述抗体、抗体片段或抗体衍生物含有图13中列出的DF-200的一个或多个重链可变区CDR。
11.抗体，所述抗体在由氨基酸残基(105、106、107、108、109、
200480021897.0权 利 要 求 书 第2/2页110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、192)定义的区域内与KIR2DK1专一结合。
12.抗体，所述抗体与KIR2DL1和KIR 2DL2/3结合而不与由残基(105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、192)定义的区域之外的氨基酸残基相互作用。
13.抗体，所述抗体与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合，所述KIR2DL1突变体中R131是Ala。
14.抗体，所述抗体与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合，所述KIR2DL1突变体中R157是Ala。
15.抗体，所述抗体与KIR2DL1结合并且不与KIR2DL1突变体结合，所述KIR2DL1突变体中R158是Ala。
16.抗体，所述抗体与KIR2DL1残基(131、157、158)结合。
17.抗体，所述抗体与KIR2DS3(R131W)结合、但是不与野生型KIR2DS3结合。
18.抗体，所述抗体与KIR2DL1和KIR2DL2/3以及KIR2DS4结合。
19.抗体，所述抗体与KIR2DL1和KIR2DL2/3结合，但是不与KIR2DS4结合。
200480021897.0说 明 书第1/59页
调节NK细胞活性的组合物和方法
发明领域
本发明涉及与N K细胞表面存在的两个或多个抑制性受体交叉反应、并增强哺乳动物受试者或生物样品中N K细胞细胞毒性的抗体、抗体片段及其衍生物。本发明也涉及制作这类抗体、片段、变体和衍生物的方法；包含所述物质的药物组合物；这类分子和组合物(具体在中)在增加受试者体内N K细胞活性 或细胞毒性中的用途。 背景
自然杀伤(N K)细胞是参与非常规免疫的淋巴细胞亚。可以通过多种本领域公知的多种技术从例如血液样品、细胞提取法(cytapheresis)、收集库(collection)等获得NK细胞。
N K细胞的特征和生物学特性包括：表达表面抗原，包括C D16、CD56、和/或CD57；细胞表面缺乏α/β或γ/δ TCR复合物；通过活化特异性溶细胞酶结合并杀伤不表达“自身”M H C/H L A抗原的细胞的能力；杀伤表达N K活化受体-配体的肿瘤细胞或其它患病细胞的能力；释放刺激或抑制免疫应答的细胞因子的能力；以及经历多轮细胞分裂、产生具有与母细胞相似的生物学特性的子细胞的能力。在本发明文中，“活性”N K细胞指生物学活性N K细胞，更具体为具有裂解靶细胞的能力的N K细胞。例如，“活性”N K细胞能够杀伤表达N K活化受体-配体、并且不表达“自身”M H C/H L A抗原的细胞(K I R不相容细胞)。 基于其生物学特性，在本领域提出多种依赖于调节N K细胞的和免疫接种策略。然而，N K细胞活性由涉及刺激性和抑制性信号的复杂机制调节。因此，有效的N K细胞介导的可能要求刺激这些细胞并中和抑制性信号。
200480021897.0说 明 书 第2/59页 N K细胞由主要组织相容性复合体(M H C)I类特异性抑制性受体负调节(K_r r e等人，1986；_h lén等人，1989)。这些特异性受体与其它细胞上存在的M H C I类分子或H L A的多态性决定簇结合，并抑制N K细胞裂解。在人类中，被称为杀伤I g样受体(k i l l e r I g-l i k e r e c
e p t o r s，K I R s)的受体家族的某些成员识别H L A I类等位基因。 K I R是存在于某些淋巴细胞亚(包括N K细胞)上的受体大家族。K I R命名法基于细胞外结构域的数量(K I R2D或K I R3D)以及胞质尾区是长(K I R2D L或K I R3D L)或是短(K I R2D S或K I R3D S)。在人类，在存在于单独个体中的N K内，给定K I R的存在或缺乏在N K细胞之间是可变的。在人中也存在相对高水平的K I R分子多态性，某些K I R 分子存在于一些(但并非全部)个体中。与适当的配体结合时，某些K I R基因产物引起淋巴细胞活性的刺激。已证实的刺激性K I R都具有含有带电荷跨膜残基的短胞质尾区，所述残基与含有免疫刺激性基序(I T A M)的接头分子结合。其它K I R基因产物实质上是抑制性的。所有经证实的抑制性K I R具有长胞质尾区，并且似乎根据K I R亚型与H L A 抗原的不同亚相互作用。抑制性K I R在其胞质内部分显示一个或数个招募磷酸酶的抑制性基序。已知的抑制性K I R受体包括K I R2D L和KIR3DL亚家族成员。具有两个Ig结构域的KIR受体(KIR2D)鉴定HLA-C 同种异型：K I R2D L2(原来指定为p58.2)或密切相关的基因产物K I R2D L3识别由2组H L A-C同种异型(C w1、3、7和8)共享的表位，而K I R2D L1(p58.1)识别由交互的(r e c i p r o c a l)1组H L A-C同种异型(C w2、4、5和6)共享的表位。在H L A-C等位基因80位存在L y s 残基指示KI R2D L1识别。在80位存在As n残基指示K I R2DL2和K IR2DL3识别。重要的是，大多数H L A-C等位基因在80位具有A s n或L y s。一个具有三个I g结构域的K I R，即K I R3D L1(p70)，识别由H L A-B w4等位基因共享的表位。最后，具有三个I g结构域的分子的同型二聚体KIR3DL2(p140)识别HLA-A3和HLA-A11。
尽管抑制性K I R及其它I类抑制性受体(M o r e t t a等人，1997；Valiante等人，1997a；Lanier，1998)可能由NK细胞共表达，在任
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