(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010797365.7
(22)申请日 2020.08.10
(71)申请人 广州来恩生物医药有限公司
地址 510000 广东省广州市中新广州知识
城腾飞园腾飞一街2号7层721-722室
(72)发明人 蔡明芳
(51)Int.Cl.
C12N 15/85(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种电转染缓冲液及其应用，
电转染缓冲液包括Opti ‑MEM培养基；电转染缓冲 液的应用为将电转染缓冲液重悬待电转染的细
胞，然后加入外源基因载体，经混合得到电转染
体系；电转染缓冲液成分明确，不含动物源或同
和合规性；电转染缓冲液应用于细胞电转染过程
中，实现细胞电转染，提高电转染过程的稳定性
和成功率。权利要求书1页 说明书4页 附图8页CN 111808880 A 2020.10.23
C N 111808880
A
1.一种电转染缓冲液，其特征在于所述电转染缓冲液包括Opti-MEM培养基。
2.一种如权利要求1所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，所述电转染缓冲液应用于细胞电转染过程。
3.如权利要求2所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，将所述电转染缓冲液重悬待电转染的细胞，然后加入外源基因载体，经混合得到电转染体系。
4.如权利要求3所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，所述外源基因载体为mRNA。
5.如权利要求3所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，所述电转染体系中，外源基因载体的浓度为1-5pg/cell每一待电转染的细胞；所述待电转染细胞的浓度为50-100nM。
6.如权利要求3所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，所述细胞电转染过程为：将电转染体系加入电转杯的中间凹槽中，将电转杯放到电转仪电极的凹槽中，启动电转仪电转染细胞。
7.如权利要求6所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，使用HARVAR D APPARATUS品牌BTX Agile Pulse MAX电转仪电转细胞，电转仪的电转参数为电压1200V，电脉冲长度0.1ms，间隔0.2ms，电脉冲1次。
8.如权利要求6所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，电转染完成后，取出电转杯中的细胞悬液，加入表达培养基中，然后放入CO 2培养箱中培养20±4H。
9.如权利要求8所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，CO 2培养箱中的培养条件为温度37±1℃，CO 2浓度5±0.5％。
10.如权利要求8所述的电转染缓冲液的应用，其特征在于，所述表达培养基为含5-10vt％Knockout SR血清替代物和50-200IU/mL重组白介素rIL-2的A IM-V CTS无血清细胞培养基。
权 利 要 求 书1/1页CN 111808880 A
一种电转染缓冲液及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种电转染缓冲液及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
[0002]电转染是分子生物学中最常用的技术之一，通过提供瞬时局部电压，形成对细胞膜的电穿孔和对带电分子转运时的电泳作用，透细胞质膜，可以将药物、基因物质转移到体外培养的细胞内，实现对药物的直接细胞转运和细胞功能的编辑。进而实现在临床的应用。电转染过程需要提供适宜的电转染缓冲体系，维持电转染过程细胞所处环境的离子浓度，渗透压和pH等细胞敏感的条件。但是目前市售电转液主要成份为无机盐类成份，由于保密原因，成分不够明确，没有完全公开，在后续临床应用过程，是否含有对人体或细胞有害的成分，无法科学判断，对细胞的安全性隐患巨大。
发明内容
[0003]为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种电转染缓冲液，该电转染缓冲液成分明确，不含动物源或同种异体来源成分，提高细胞进行电转染的安全性和合规性。
[0004]本发明的第二个目的在于提供一种上述电转染缓冲液的应用，为将电转染缓冲液应用于细胞电转染过程中，实现细胞电转染，提高电转染过程的稳定性和成功率。[0005]实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种电转染缓冲液，电转染缓冲液包括Opti-MEM培养基。
[0006]实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的电转染缓冲液的应用，电转染缓冲液应用于细胞电转染过程。
[0007]进一步地，将电转染缓冲液重悬待电转染的细胞，然后加入外源基因载体，经混合得到电转染体系。
[0008]进一步地，外源基因载体为mRNA。
[0009]进一步地，电转染体系中，外源基因载体的浓度为1-5pg/cell每一待电转染的细胞；待电转染细胞的浓度为50-100nM。
[0010]进一步地，细胞电转染过程为：将电转染体系加入电转杯的中间凹槽中，将电转杯放到电转仪电极的凹槽中，启动电转仪电转染细胞。
[0011]进一步地，使用HARVARD APPARATUS品牌BTX Agile Pulse MAX电转仪电转细胞，电转仪的电转参数为电压1200V，电脉冲长度0.1ms，间隔0.2ms，电脉冲1次。
[0012]进一步地，电转染完成后，取出电转杯中的细胞悬液，加入表达培养基中，然后放入CO2培养箱中培养20±4H。
[0013]进一步地，CO2培养箱中的培养条件为温度37±1℃，CO2浓度5±0.5％。
[0014]进一步地，表达培养基为含5-10vt％Knockout SR血清替代物和50-200IU/mL重组白介素rIL-2的AIM-V CTS无血清细胞培养基。
[0015]本发明的配方设计原理如下：
[0016]行业中，Opti-MEM培养基虽为现有，但常规使用于细胞培养中，而本发明明申请研究认为，Opti-MEM培养基可以作为电转染缓冲液应用于细胞电转染过程中，由于该电转染缓冲液的成分是明确的，不含动物源或同种异体来源成分，因此转染后的细胞生长稳定，对于细胞后续应用的研究，具有更好的可控性，规避了细胞进行电转染操作时引入成分不够清晰的电转染缓冲液带来的安全性和合规性风险
[0017]相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0018]1、本发明电转染缓冲液中的Opti-MEM培养基虽为现有，但常规使用于细胞培养中，而本发明明申请研究认为，Opti-MEM培养基可以作为电转染缓冲液应用于细胞电转染过程中，属于新用途的开发，有别于常规的细胞培养功能，由于该电转染缓冲液的成分是明确的，不含动物源或同种异体来源成分，因此转染后的细胞生长稳定；
[0019]2、本发明电转染缓冲液成分明确，使得对于成功转让后细胞的后续应用研究，具有更好的可控性，规避了细胞进行电转染操作时引入成分不够清晰的电转染缓冲液带来的安全性和合规性风险；
[0020]3、本发明电转染缓冲液的应用，有别于常规的细胞培养功能，在电转染过程中为细胞提供良好的电转染环境，提高转染成功率。
附图说明
[0021]图1-4为细胞表型流式检测图示；
[0022]图5为外源mRNA在CD8+T细胞上的表达率比较柱形图；
[0023]图6为活细胞总数比较柱形图；
[0024]图7为细胞活率比较柱形图；
[0025]图8为胞内INF-γ与TNF-a细胞表达率比较柱形图。
具体实施方式
[0026]下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
[0027]一种电转染缓冲液，为Opti-MEM培养基；Opti-MEM培养基为Gibco品牌CTS Opti-MEM Medium培养基。
[0028]Opti-MEM培养基作为电转染缓冲液，用于电转染细胞过程，具体步骤如下：[0029]1、配制表达培养基：配-:510vt％Knockout SR血清替代物(Serum Replace ment，SR)和50-200IU/mL重组白介素rIL-2的AIM-V CTS无血清细胞培养基；表达培养基用于电转染后细胞的培养及涮洗电转杯，用于细胞培养的表达培养基转移至12孔板各孔中；该表达培养基能够充分支持电转染后细胞的生长和外源基因序列的表达；
[0030]2、配制电转染体系：取待电转染的细胞悬液离心，弃上清后用电转染缓冲液重悬待电转染的细胞，使得待电转染细胞的浓度为50-100nM，然后加入外源基因载体，浓度为1-5pg/cell每一待电转染的细胞，经轻轻吹吸混匀，得到电转染体系；其中外源基因载体包括但不限于核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等；
[0031]3、电转染步骤：将电转染体系加入电转杯(货号：45-0126)的中间凹槽中，将电转杯放到电转仪电极的凹槽中，使用HARVARD APPARATUS品牌BTX Agile Pulse MAX电转仪电
转染细胞；调节电转仪的电转参数为电压1200V，电脉冲长度0.1ms，间隔0.2ms，电脉冲1次；[0032]4、表达培养：电转染完成后，取出电转杯中的细胞悬液，加入12孔板的表达培养基中，然后放入CO2培养箱中培养20±4H，CO2培养条件为温度37±1℃，CO2浓度5±0.5％，得到电转染完成的细胞。
[0033]本发明申请使用新的电转染缓冲液，在其应用过程中，电转染体系、电转染过程参数，均需要进行相应的改进；经研究设置了特定的电转染缓冲体系，使得电转染过程中细胞具有良好的离子浓度，渗透压和pH；其电转染的电转仪参数，也是根据使用的电转染缓冲液，进行了针对性的设置，证明使用电转染缓冲液的可操作性。
[0034]实施例1：
[0035]一种电转染缓冲液，为Opti-MEM培养基；Opti-MEM培养基为Gibco品牌CTS Opti-MEM Medium培养基。
[0036]Opti-MEM培养基作为电转染缓冲液，用于电转染细胞过程，具体步骤如下：[0037]1、配制表达培养基：配制10vt％Knockout SR血清替代物(Serum Replace ment，SR)和100IU/mL重组白介素rIL-2
的AIM-V CTS无血清细胞培养基；表达培养基用于电转染后细胞的培养及涮洗电转杯，用于细胞培养的表达培养基转移至12孔板各孔中；该表达培养基能够充分支持电转染后细胞的生长和外源基因序列的表达；
[0038]2、配制电转染体系：取待电转染的细胞悬液离心，弃上清后用200μL电转染缓冲液重悬待电转染的细胞，使得待电转染细胞的浓度为80-90nM，然后加入外源基因载体mRNA，浓度为1-5pg/cell每一待电转染的细胞，经轻轻吹吸混匀，得到电转染体系；
[0039]3、电转染步骤：将电转染体系加入电转杯(货号：45-0126)的中间凹槽中，将电转杯放到电转仪电极的凹槽中，使用HARVARD APPARATUS品牌BTX Agile Pulse MAX电转仪电转染细胞；调节电转仪的电转参数为电压1200V，电脉冲长度0.1ms，间隔0.2ms，电脉冲1次；[0040]4、表达培养：电转染完成后，取出电转杯中的细胞悬液，加入12孔板的表达培养基中，然后放入CO2培养箱中培养20±4H，CO2培养条件为温度37±1℃，CO2浓度5±0.5％，得到电转染完成的细胞。
[0041]对比例1-2：
[0042]对比例1为使用HARVARD APPARATUS品牌T4 buffer作为电转染缓冲液；对比例2为使用HARVARD APPARATUS品牌T buffer作为电转染缓冲液；其使用的表达培养基、电转染仪器、操作步骤与实施例1相同；其中对比例1的电转仪的电转参数为电压1200V，电脉冲长度0.1ms，间隔100ms，电
脉冲1次；对比例2的电转仪的电转参数为电压130V，电脉冲长度0.2ms，间隔2ms，电脉冲4次
[0043]对实施例1、对比例1-2三组培养完成的细胞进行检测：
[0044]1、流式细胞术检测细胞特定表型：CD8+TCRVβ+(％)双阳值来分析外源m RNA在CD8 +T细胞上的表达效率，结果如图1-4所示，图1为未电转染阴性对照细胞图示，图2-4分别表示实施例1、对比例1-2；图5位表达效率比较柱形图；
[0045]2、显微计数法检测各组别活细胞总数：结果如图6所示；
[0046]3、显微计数法检测各组别细胞活率：结果如图7所示；
[0047]4、效靶细胞共培养法检测效应细胞(CD8+TCRVβ+)细胞因子INF-γ、TNF-a的分泌功能，电转染后细胞与经基因修饰转导HLA(人白细胞共同抗原)B细胞共孵育18h后流式检
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