(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510929395.8
(22)申请日 2015.12.11
C12P 7/26(2006.01)
C12R 1/865(2006.01)
(71)申请人中国药科大学
地址211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道
639号
(72)发明人许激扬 卞筱泓 张修芹 朱兴宇
孙天娇
(54)发明名称
中的应用
(57)摘要
本发明提供了酿酒酵母菌在生物合成L-苯
基乙酰基甲醇中的应用，包括苯甲醛耐受酵母菌
株的获得、生物催化剂的构建、微生物转化等步
骤。该方法一方面通过筛选酵母菌株获得对苯甲
醛的耐受性高、生长性状稳定的酵母菌株，另一方
面采用复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株改善
菌体的代谢状况，稳定并延长酶的催化时间，改进
反应条件，提高关键底物苯甲醛的浓度，简化菌体
与转化液分离程序，从而提高L-PAC 累积量(转化
液中L-PAC 浓度接近45g/L)。该方法大大提高了
原料利用率，降低了生产成本，显著提高L-PAC 的
产量，可为生物法合成的产业化奠定基础。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 105331639 A 2016.02.17
C N 105331639
A
1.酿酒酵母菌在生物合成L-苯基乙酰基甲醇中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
(1)苯甲醛耐受酵母菌株的获得：将酵母菌株活化后接种于含不同浓度苯甲醛的固体培养基中培养；将苯甲醛耐受菌株接种到高浓度种子培养基中培养；将生长到稳定期的细胞分离后，再接种到相同的高浓度种子培养基中培养；获得的稳定期的菌株，即为苯甲醛耐受酵母菌株；
(2)生物催化剂的构建：利用复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株，即为生物催化剂；
(3)微生物转化：生物催化剂、底物在转化培养基和等体积辛醇的两相体系中发酵即得L-苯基乙酰基甲醇。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述酵母菌为酿酒酵母菌为S.cerevisiae AY93161。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述复合载体为含聚乙烯醇和海藻酸钠的固定化缓冲液；所述固定化缓冲液为含20mmol/L MgSO
4
和1mmol/L硫胺素焦磷
酸的0.5M KH
2PO
4
/K
2
HPO
4
缓冲液；复合载体中，所述聚乙烯醇的质量百分比浓度为5-15％；
所述海藻酸钠的质量百分比浓度为1.5-2.5％。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株的步骤具体为：将聚乙烯醇和海藻酸钠和1g苯甲醛耐受酵母菌株加入到4ml的含
20mmol/L MgSO
4和1mmol/L硫胺素焦磷酸的0.5M KH
2
PO
4
/K
2
HPO
4
缓冲液中，混匀后用20ml
注射器吸取混合液并滴入4℃的含0.2％戊二醛的4％CaCl
2
饱和硼酸溶液中制粒固化24h，洗涤2～3次。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，所述转化培养基的组成为：
葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，MgCl
20.5g/L，(NH
4
)
2
SO
4
10g/L，MnCl
2
0.2g/L，CaCl
2
0.2g/L，
KH
2PO
4
0.6g/L，pH用醋酸钠-冰醋酸调至6.5。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，反应体系中还可加入添加剂，
所述添加剂为β-环糊精或3-(N-吗啉)丙磺酸。
酿酒酵母菌在生物合成L-苯基乙酰基甲醇中的应用技术领域
[0001]
本发明涉及酿酒酵母菌在生物合成L-苯基乙酰基甲醇中的应用，属于生物工程
技术领域。背景技术
[0002]
苯甲醛又称安息香醛、苦杏仁油，是一种重要的医药中间体，广泛用于医药、香料、农药、染料、塑料添加剂等行业。以淀粉类和糖类作为发酵材料，以苯甲醛为底物，采用微生物法生物合成药物中间体是一项缓解能源危机的技术，但底物苯甲醛对细胞毒性作用使其工业应用受到限制。
[0003] L-苯基乙酰基甲醇(L-phenylacetylcarbinol，L-PAC)是合成药物L-(L-ephedrine)和D-伪麻黄
素(D-pseudoephedrine)的关键手性前体，以苯甲醛为底物酶催化合成L-PAC 的研究着眼于寻成本低、产率高和产量高的生物催化剂。目前获得苯甲醛耐受菌株的方法多是通过进化工程和基因工程。然而，其工艺复杂，成本较高。微生物的一个重要特性就是在压力环境下改变细胞内部的物理条件来适应抗性环境并将其应用在生物合成L-苯基乙酰基甲醇。发明内容
[0004] 发明目的：本发明的目的是提供酿酒酵母菌在生物合成L-苯基乙酰基甲醇中的应用。
[0005] 技术方案：本发明提供的酿酒酵母菌在生物合成L-苯基乙酰基甲醇中的应用。
[0006] 所述应用，具体包括以下步骤：
[0007] (1)苯甲醛耐受酵母菌株的获得：将酵母菌株活化后接种于含不同浓度苯甲醛的固体培养基中培养；将苯甲醛耐受菌株接种到高浓度种子培养基中培养；将生长到稳定期的细胞分离后，再接种到相同的高浓度种子培养基中培养；获得的稳定期的菌株，即为苯甲醛耐受酵母菌株；
[0008] (2)生物催化剂的构建：利用复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株，即为生物催化剂；
[0009] (3)微生物转化：生物催化剂、底物在转化培养基和等体积辛醇的两相体系中发酵即得L-苯基乙酰基甲醇。
[0010] 其中，步骤(1)中，所述酵母菌为酿酒酵母菌为S.cerevisiae AY93161(购自ATCC，编号CCTCCAY93161)。
[0011] 其中，步骤(2)中，所述复合载体为含聚乙烯醇和海藻酸钠的固定化缓冲液；所述固定化缓冲液为含20mmol/L MgSO 4和1mmol/L 硫胺素焦磷酸(TPP)的0.5M KH 2PO 4/K 2HPO 4缓冲液；复合载体中，所述聚乙烯醇的质量百分比浓度为5-15％；所述海藻酸钠的质量百分比浓度为1.5-2.5％。
[0012] 其中，步骤(2)中，复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株的步骤具体为：将聚乙烯
醇和海藻酸钠和1g 苯甲醛耐受酵母菌株加入到4ml 的含20mmol/L MgSO 4和1mmol/L 硫胺素焦磷酸(TPP)的0.5M KH 2PO 4/K 2HPO 4缓冲液中，混匀后用20ml 注射器吸取混合液并滴入4℃的含0.2％戊二醛的4％CaCl 2饱和硼酸溶液中制粒固化24h，洗涤2～3次。
[0013] 其中，步骤(3)中，所述转化培养基的组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，MgCl 20.5g/L，(NH 4)2SO 410g/L，MnCl 20.2g/L，CaCl 20.2g/L，KH 2PO 40.6g/L，pH 用醋酸钠-冰醋酸调至6.5。
[0014] 其中，步骤(3)中，反应体系中还可加入添加剂，所述添加剂为β-环糊精或3-(N-吗啉)丙磺酸。
[0015] 有益效果：本发明方法一方面通过筛选酵母菌株获得对苯甲醛的耐受性高、生长性状稳定的酵母菌株，另一方面采用复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株改善菌体的代谢状况，稳定并延长酶的催化时
间，改进反应条件，提高关键底物苯甲醛的浓度，简化菌体与转化液分离程序，从而提高L-PAC 累积量(转化液中L-PAC 浓度接近45g/L)。该方法大大提高了原料利用率，降低了生产成本，显著提高L-PAC 的产量，可为生物法合成的产业化奠定基础。
附图说明
[0016]
图1苯甲醛耐受酵母菌株的获得的工艺流程图。
[0017] 图2本发明筛选方法筛选得到的分离菌株的相对生长率图；其中，A ：在0.2％苯甲醛浓度下分离菌株的相对生长率；B ：在0.4％苯甲醛浓度下分离菌株的相对生长率；C ：在0.6％苯甲醛浓度下分离菌株的相对生长率；D ：在0.8％苯甲醛浓度下分离菌株的相对生长率。
[0018] 图3生物催化剂转化合成L-PAC 的原理图。
[0019] 图4实施例2最终得到的反应液的HPLC 检测结果图。具体实施方式
[0020] 以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 实施例1 苯甲醛耐受酵母菌株的获得
[0022] 苯甲醛耐受酵母菌株的获得，见图1，步骤如下：
[0023] (1)苯甲醛耐受菌株的筛选：从市售酵母菌株中活化挑取单菌落发酵，获得酵母细胞；取酵母细胞1g 悬浮于10ml 生理盐水中，分别取细胞液50μl 接种于含苯甲醛0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％的固体培养平板上，30℃培养，每12h 观察平板菌落生长情况；
[0024] (2)耐受性分析：挑含苯甲醛0.2％、0.4％、0.6％的固体培养平板上的耐受单菌落，接种至分别含0.2％、0.4％、0.6％、0.8％苯甲醛的150ml 种子培养基中发酵24h‘
[0025]
(3)以OD 600＝0.1的初始菌体浓度接种到相同的高浓度种子培养基中发酵24h，在600nm 波长下，用分光光度计测定菌体密度，计算菌株的相对生长率，即可获得苯甲醛耐
受菌株，结果如图2所示。图2显示，酿酒酵母菌S.cerevisiae AY93161对苯甲醛的耐受性提高，生长性状稳定。
[0026] 其中，种子培养基为葡萄糖26g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉8g/L，NaCl 3g/L，
KH
2PO
4
0.4g/L，MgCl
2
0.5g/L，pH为自然值，余量为单蒸水；种子培养基内培养条件：30℃、
220r/min。
[0027] 实施例2 生物合成L-PAC
[0028] (1)生物催化剂的构建
[0029] 利用复合载体固定化苯甲醛耐受酵母菌株，即为生物催化剂；其中，所述复合载体为含聚乙烯醇和海藻酸钠的固定化缓冲液，所述固定化缓冲液为含20mmol/L MgSO
4
和
1mmol/L硫胺素焦磷酸(TPP)的0.5M KH
2PO
4
/K
2
HPO
4
缓冲液，所述聚乙烯醇的质量百分比浓
度为5-15％；所述海藻酸钠的质量百分比浓度为1.5-2.5％；
[0030] 具体操作为：将聚乙烯醇和海藻酸钠和1g苯甲醛耐受酵母菌株加入到4ml的含
20mmol/L MgSO
4和1mmol/L硫胺素焦磷酸(TPP)的0.5M KH
2
PO
4
/K
2
HPO
4
缓冲液中，混匀后
用20ml注射器吸取混合液并滴入4℃的含0.2％戊二醛的4％CaCl
2
饱和硼酸溶液中制粒固化24h，洗涤2～3次，转入转化培养基中；
[0031] (2)微生物转化
[0032] 用50ml摇瓶盛装为摇瓶容量的10％的含生物催化剂的转化培养基，30℃、200r/ min活化1h后，加入等体积辛醇，再一次性添加底物1200mmol/L苯甲醛、7％葡萄糖、600mM 丙酮酸钠，培养6h实现转化的连续反应。
[0033] 所述转化培养基的组成为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，MgCl20.5g/L，
(NH
4)
2
SO
4
10g/L，MnCl
2
0.2g/L，CaCl
2
0.2g/L，KH
2
PO
4
0.6g/L，pH用醋酸钠-冰醋酸调至6.5。
[0034] 生物催化剂转化合成L-PAC的原理，如图3所示，包括：在辛醇/水两相体系中固定化苯甲醛耐受酵母菌株中存在的丙酮酸脱羧酶实现丙酮酸脱羧反应而产生活性乙醛，活性乙醛和底物苯甲醛缩合而合成具有手性结构的产物L-PAC。
[0035] 从两相中分别取1ml反应液，12000r/min4℃离心10分钟，取样品上清200ul，用多于样品5倍的乙醇溶解样品，对最终得到的反应液进行HPLC检测。
[0036] 分析条件是：仪器为Agilent 1100高效液相谱，分析柱为Hedera ODS-2柱(5μm，250mm×4.6mm)；流动相为乙腈和水梯度洗脱，0-20min乙腈10％→50％，20-21min 乙腈50％，21-25min乙腈50％→10％，流速为1.0mL/min。
[0037] 在283nm下检测产物L-PAC和底物苯甲醛，L-PAC和苯甲醛出峰时间分别14.6min 和19.6min，最终可以确认制备得到的L-PAC浓度，图谱见图4，结果如表1所示，复合载体采用10％PVA与2％海藻酸钠最佳。
[0038] 表1复合载体对合成L-PAC的影响
[0039]
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