(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011238934.0
(22)申请日 2020.11.09
(71)申请人 长春金赛药业有限责任公司
地址 130012 吉林省长春市高新区越达路
1718号
(72)发明人 王富伟 王珊 王英武 王秋实
耿昕颖
(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人 潘颖
(51)Int.Cl.
G01N 21/76(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
G01N 33/68(2006.01)
(54)发明名称
一种基于镧系元素化学发光法长效生长激
(57)摘要
本发明涉及生物制药领域，
特别是涉及一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定 量检测试剂盒及其方法。该试剂盒包括：PEG抗
体、微孔板，生物素标记的PEG ‑rhGH抗体工作液， 链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，增强解离
液，PEG ‑rhGH抗原标准品和质控品。本发明经过
方法学评估，结果显示试剂盒灵敏度高、特异性
好，准确度更高，为满足长效生长激素药物临床
分析和评价提供了一种技术手段。权利要求书1页 说明书7页 附图1页CN 112362643 A 2021.02.12
C N 112362643
A
1.一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
PEG抗体、微孔板，生物素标记的PEG -rhGH抗体工作液，链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，增强解离液，PEG -rhGH抗原标准品和质控品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PEG -rhGH标准品为在0.1～150ng/mL范围内的一系列梯度浓度的标准品；
所述质控品为在2～100ng/mL范围内的高、中、低浓度的质控品。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、样品稀释液中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为0.05～0.10M、pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液；
所述洗涤缓冲液为含有0.4～0.6mM Tween -20的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液；
所述封闭液为含有4％～6％脱脂奶粉的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0.05～0.10M、pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，生物素标记的PEG -rhGH抗体用检测抗体稀释液稀释后得到生物素标记的PEG -rhGH抗体工作液；所述检测抗体稀释液为含有0.8％～1.2％的牛血清白蛋白的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液；
链霉亲和素标记的镧系元素铕用链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液稀释后得到链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液；所述链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液为DELFIA assay buffer。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的PEG -rhGH抗体的稀释倍数为1:(1400～1800)；
所述链霉亲和素标记的镧系元素铕的稀释倍数为1:(800～1200)。
8.一种非诊断目的的长效生长激素免疫定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：将PEG抗体加入微孔板，包被，洗板，封闭，得到PEG抗体包被的微孔板；
步骤2：将样品采用样品稀释液稀释，然后加入PEG抗体包被的微孔板中孵育；
步骤3：将生物素标记的PEG -rhGH抗体工作液加入微孔板中孵育；
步骤4：将链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液加入微孔板中孵育；
步骤5：最后加入增强解离液，震荡；
步骤6：激发光330，发射光620，读取荧光值；采用外标法得到样品中长效生长激素的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PEG抗体的包被浓度为6～10μg/mL，包被温度为2～8℃，包被时间为10～20h；封闭的温度为35～40℃，封闭的时间为1.5～2.5小时。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为20～30℃，孵育的时间为0.5～1.5h；
震荡的转速为100～200rpm，震荡的时间为10～30分钟。
权 利 要 求 书1/1页CN 112362643 A
一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试
剂盒及其方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法。
背景技术
[0002]生长激素(Growth Hormone，GH)是一种垂体分泌源的蛋白质，参与调节生长发育过程中的代谢，其缺乏可以导致儿童生长发育迟缓，成人则为生长激素缺乏综合征，重组人生长激素(rhGH)可以纠正上述症状。由于rhGH的半衰期短，需要每日皮下注射，大大增加了者的痛苦。为了延长半衰期，长效重组生长激素药物成为目前生物技术药物的研发主流；从技术上讲，聚乙二醇(PEG)化技术是目前最重要的蛋白融合技术。
[0003]尽管长效生长激素(PEG-rhGH)药物进展迅速，但尚无检测其完整分子的免疫定量方法，市售试剂
盒通常采用夹心酶联免疫吸附法，包被抗体和检测抗体均为抗GH的抗体，不能检测药物中PEG是否在体内仍与药物连接，且血清中含有内源性GH，易与包被板上抗GH的抗体结合，无法特异检测PEG-rhGH，反应PEG-rhGH在体内的代谢情况。如何选择包被抗体和检测抗体，特异性识别PEG-rhGH完整分子是本方法的难点。因此，生物技术药物领域的科研工作者迫切建立灵敏、特异的PEG-rhGH药物的定量检测方法并探索其可行性，从而满足此类药物临床分析和评价需求。
[0004]解离增强镧系荧光免疫分析法(Diss ocia tion-enha nced la n tha nid e fluorescence immunoassay，DEFLIA)是基于时间分辨荧光分析法(Time-resolved fluorometry，TRF)建立的微量免疫分析技术，其具体原理为：利用荧光发射体的荧光寿命差别，以镧系元素铕(Eu3+)为示踪剂，标记抗原或抗体，解离出来的铕(Eu3+)与特制的扩增液形成新的螯合物时，其荧光明显增强且持久，在检测时，用延迟测量的方法信号较紫外法更高，且不易受血清基质干扰，大大提高检测灵敏度。
[0005]对于PEG-rhGH检测，如何制备一种利用镧系元素化学发光测定技术、且可检测完成PEG-rhGH分子的试剂盒，是目前长效生长激素检测亟待解决的问题之一。
发明内容
[0006]有鉴于此，本发明提供了一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法。该方法可检测PEG-rhGH完整分子，特异性强，灵敏度高。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008]本发明提供了一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒，该试剂盒包括：
[0009]PEG抗体、微孔板，生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液，链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，增强解离液，PEG-rhGH抗原标准品和质控品。
[0010]本发明检测方法将抗PEG的抗体过量包被于微孔板上，向微孔板中加入待检的
PEG-rhGH与其反应，再加入生物素标记的PEG-rhGH抗体，结合解离增强镧系荧光免疫分析法，检测荧光信号，信号的强度与样品中PEG-rhGH的量呈正相关。本发明利用解离增强镧系荧光免疫分析技术进行长效生长激素定量检测，检测时，捕获抗体为抗PEG的抗体，检测抗体为抗GH的抗体，可检测完整PEG-rhGH分子，同时避免了内源性GH干扰，可准确检测体内长效生长激素代谢情况，或者体外长效生长激素的稳定性。
[0011]作为优选，PEG-rhGH标准品为在0.1～150ng/mL范围内的一系列梯度浓度的标准品；
[0012]质控品为在2～100ng/mL范围内的高、中、低浓度的质控品。
[0013]在本发明具体实施例中，PEG-rhGH标准品为11个，浓度分别为120.000ng/mL、60.000ng/mL、3
0.000ng/mL、15.000ng/mL、7.500ng/mL、3.750ng/mL、1.875ng/mL、0.938ng/ mL、0.469ng/mL、0.234ng/mL、0.117ng/mL；
[0014]质控品的浓度分别为96.000ng/mL、16.000ng/mL、2.344ng/mL。
[0015]作为优选，试剂盒还包括包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、样品稀释液中的一种或几种。
[0016]作为优选，包被缓冲液为0.05～0.10M、pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液；
[0017]洗涤缓冲液为含有0.4～0.6mM Tween-20的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液；[0018]封闭液为含有4％～6％脱脂奶粉的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液。
[0019]在本发明具体实施例中，包被缓冲液为0.08M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；
[0020]洗涤所用的洗涤缓冲液为含有0.5mM Tween-20的0.08M磷酸盐缓冲液；
[0021]封闭液为含有5％脱脂奶粉的0.08M磷酸盐缓冲液。
[0022]作为优选，样品稀释液为0.05～0.10M、pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液。
[0023]在本发明具体实施例中，样品稀释液为0.08M pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
[0024]作为优选，生物素标记的PEG-rhGH抗体用检测抗体稀释液稀释后得到生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液；检测抗体稀释液为含有0.8％～1.2％的牛血清白蛋白的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液；
[0025]在本发明具体实施例中，检测抗体稀释液为含有1％的牛血清白蛋白的0.08M磷酸盐缓冲液。
[0026]作为优选，链霉亲和素标记的镧系元素铕用链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液稀释后得到链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液；链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液为DELFIA assay buffer。
[0027]作为优选，生物素标记的PEG-rhGH抗体的稀释倍数为1:(1400～1800)；
[0028]链霉亲和素标记的镧系元素铕的稀释倍数为1:(800～1200)。
[0029]在本发明具体实施例中，生物素标记的PEG-rhGH抗体的稀释倍数为1:1600；[0030]链霉亲和素标记的镧系元素铕的稀释倍数为1:1000。
[0031]本发明还提供了一种非诊断目的的长效生长激素免疫定量检测方法，包括如下步骤：
[0032]步骤1：将PEG抗体加入微孔板，包被，洗板，封闭，得到PEG抗体包被的微孔板；[0033]步骤2：将样品采用样品稀释液稀释，然后加入PEG抗体包被的微孔板中孵育；[0034]步骤3：将生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液加入微孔板中孵育；
[0035]步骤4：将链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液加入微孔板中孵育；
[0036]步骤5：最后加入增强解离液，震荡；
[0037]步骤6：激发光330，发射光620，读取荧光值；采用外标法得到样品中长效生长激素的含量。
[0038]作为优选，PEG抗体的包被浓度为6～10μg/mL，包被温度为2～8℃，包被时间为10～20h；封闭的温度为35～40℃，封闭的时间为1.5～2.5小时。
[0039]在本发明具体实施例中，PEG抗体的包被浓度为8μg/mL，包被温度为2～8℃，包被时间为12h；封闭的温度为37℃，封闭的时间为2小时。
[0040]作为优选，孵育的温度为20～30℃，孵育的时间为0.5～1.5h；
[0041]在本发明具体实施例中，孵育的温度为室温，孵育的时间为1h。
[0042]作为优选，震荡的转速为100～200rpm，震荡的时间为10～30分钟。
[0043]在本发明具体实施例中，震荡的转速为150rpm，震荡的时间为20分钟。
[0044]本发明提供了一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法。该试剂
盒包括：PEG抗体、微孔板，生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液，链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，增强解离液，PEG-rhGH抗原标准品和质控品。本发明的技术效果为：
[0045]本发明经过方法学评估，结果显示试剂盒灵敏度高、特异性好，准确度更高，为满足长效生长激素药物临床分析和评价提供了一种技术手段。
附图说明
[0046]图1基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测方法的标准曲线。
具体实施方式
[0047]本发明公开了一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0048]中英文对照：
[0049]生长激素：Growth Hormone，GH；
[0050]重组人生长激素：rhGH；
[0051]聚乙二醇：PEG；
[0052]长效生长激素：PEG-rhGH；
[0053]链霉亲和素标记的镧系元素铕：Europium-labeled streptavidin；
[0054]增强解离液：Enhancement Solution。
[0055]本发明提供的基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。增强解离液(Enhancement Solution)、DELFIA assay buffer为商售。
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