[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101315372A [43]公开日2008年12月3日
[21]申请号200810022034.5[22]申请日2008.06.23
[21]申请号200810022034.5
[71]申请人江南大学
地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南
大学食品学院
[72]发明人胥传来 谢会玲 袁媛 赵金山 胡拥明 [74]专利代理机构无锡市大为专利商标事务所代理人时旭丹 刘品超
[51]Int.CI.G01N 33/543 (2006.01)G01N 21/25 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 1 页
[54]发明名称
酶联免疫检测方法
[57]摘要
一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量
的酶联免疫检测方法，属于免疫分析领域。本发明
采用具有簇特异性的抗头孢类抗生素的多克隆抗体
作为检测试剂，制备酶联免疫检测试剂盒，以头孢
氨苄为标准品，通过实验测定不同种头孢类抗生素
浓度与头孢氨苄标准品的相对值，给出测定校正因
子，有望实现酶联免疫检测试剂盒的多残留检测。
本发明具有前处理简单，灵敏度高，精确度高等优
点。
200810022034.5权 利 要 求 书第1/2页 1.一种检测动物源食品中头孢类抗生素的酶联免疫试剂盒，由试剂组和包被板构成，其特征在于：
试剂组的组成为：
(1)缓冲液：为pH 7.4磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按1∶10稀释；
(2)显液A：柠檬酸0.933g，磷酸氢二钠3.68g，18μL双氧水，用蒸馏水定容至100mL；
(3)显液B：60mg 3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯TMB溶于100mL乙二醇溶液；
(4)洗涤液：为含有5％吐温-20的磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按1∶10稀释；
(5)终止液：为2mol/L的硫酸；
(6)冻干封闭液：Tris溶于双蒸水中，盐酸调节pH7.4，加入0.2％的明胶；
(7)头孢氨苄标准液：头孢氨苄标准溶液浓度为10mg/mL，使用时用磷酸盐缓冲液稀释至100ng/mL，再稀释至40ng/mL，10ng/mL，2ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL五个梯度；
(8)酶标记抗抗体：为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体，使用时按照1∶5000倍稀释；
(9)基质掩蔽剂：含0.5％酪蛋白、pH 9.0-9.5、0.01M的磷酸盐缓冲液； 包被板的构成为：
包被板为96孔或48孔酶标板，采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将头孢氨苄-BSA偶联物稀释至1/6400mg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL包被液，37℃烘箱放置2h或4℃过夜，用稀释后的洗涤液洗涤三次，每次在吸水纸上拍干，然后加入冻干封闭液37℃烘箱放置2h，取出用稀释后的洗涤液洗涤四次后，冻干，4℃保存。
2、用权利要求1所述定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的试剂盒的检测方法，其特征在于：检测步骤为：
(1)用3-5℃低温离心进行样品前处理，得到样品提取液； (2)分别将各种浓度的头孢氨苄标准溶液和样品提取液加入到包被板各自的微孔中，要双孔平行加样，然后在各微孔中加入酶标记的羊抗兔抗体即酶标二抗，混匀后37℃反应1-2h；
(3)酶标板取出后用稀释后的洗涤液洗涤3-5次，最后一次洗涤后将酶标板在吸水纸上拍干，加入显液A与显液B的混合液，37℃反应20-40min；混合液中显液A与显液B的体积比为5∶1；
200810022034.5权 利 要 求 书 第2/2页
(4)取出后向各微孔中加入100μL终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光度值，根据不同浓度头孢氨苄标准液的吸光值绘制头孢氨苄的浓度-吸光值标准曲线图，对照该标准曲线图计算得到样品中头孢类抗生素的含量。
3、根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：通过实验确定其他种头孢类抗生素的含量与头孢氨苄标准品的含量的对应值，给出校准因子，从而实现对于其他种头孢类抗生素的检测。
4、根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述的样品前处理：样品为动物组织，将样品用匀浆器捣碎，均质，取适量均质后样品加入萃取液，3-5℃低温离心，取上清液用基质掩蔽剂稀释；牛奶样品：脱脂牛奶直接检测，对于全酯牛奶则离心出去脂肪后进行检测。
5、根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所用的萃取液为pH7-8的磷酸盐缓冲液。
200810022034.5说 明 书第1/5页一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测方法
技术领域
本发明涉及一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测方法，属于免疫分析领域。
背景技术
头孢类抗生素属于β-内酰胺类抗生素。在畜类动物饲养中，β-内酰胺类抗生素广泛用于控制奶牛的乳房炎，动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌平衡和增强细菌耐药性等。因此其在乳制品中的残留也越来越引起了国内外的重视。其中头孢类抗生素由于具有抗菌谱广等优点被广泛用于人畜疾病的防治。且头孢类抗生素种类繁多，现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对所有头孢类抗生素进行快速、准确的检测，有必要研究快速、便携的多残留免疫检测技术。其中酶联免疫检测技术(ELISA)是目前能够满足上述检测要求的用于定量的免疫检测技术，且有望用本实验室所获得的具有簇特异性的抗头孢类抗生素的多克隆抗体实现对至少三种头孢类抗生素的多残留检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测方法，在于克服现有技术的不足，满足对多种抗生素进行快速筛选的要求，提供一种快速，灵敏度高，检测成本低廉的检测动物源食品中头孢类抗生素的酶联免疫检测方法。
本发明的技术方案：一种检测动物源食品中头孢类抗生素的酶联免疫试剂盒，由试剂组和包被板构成；
试剂组的组成为：
(1)缓冲液：为pH 7.4磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按1∶10稀释；
(2)显液A：柠檬酸0.933g，磷酸氢二钠3.68g，18μL双氧水，用蒸馏水定容至100mL；
(3)显液B：60mg 3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯TMB溶于100mL乙二醇溶液；
(4)洗涤液：为含有5％吐温-20的磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按1∶10稀释；
(5)终止液：为2mol/L的硫酸；
200810022034.5说 明 书 第2/5页
(6)冻干封闭液：Tris溶于双蒸水中，盐酸调节pH 7.4，加入0.2％的明胶；
(7)头孢氨苄标准液：头孢氨苄标准溶液浓度为10mg/mL，使用时用磷酸盐缓冲液稀释至100ng/mL，再稀释至40ng/mL，10ng/mL，2ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL五个梯度；
(8)酶标记抗抗体：为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体，使用时按照1∶5000倍稀释；
(9)基质掩蔽剂：含0.5％酪蛋白、pH 9.0-9.5、0.01M的磷酸盐缓冲液； 包被板的构成为：
包被板为96孔或48孔酶标板，采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将头孢氨苄-BSA偶联物稀释至1/6400mg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL包被液，37℃烘箱放置2h或4℃过夜，用稀释后的洗涤液洗涤三次，每次在吸水纸上拍干，然后加入冻干封闭液37℃烘箱放置2h，取出用稀释后的洗涤液洗涤四次后，冻干，4℃保存。
所述定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的试剂盒的检测方法，其特征在于：检测步骤为：
(1)用3-5℃低温离心进行样品前处理，得到样品提取液；
(2)分别将各种浓度的头孢氨苄标准溶液和样品提取液加入到包被板各自的微孔中，要双孔平行加样，然后在各微孔中加入酶标记的羊抗兔抗体即酶标二抗，混匀后37℃反应1-2h；
(3)酶标板取出后用稀释后的洗涤液洗涤3-5次，最后一次洗涤后将酶标板在吸水纸上拍干，加入显液A与显液B的混合液，37℃反应20-40min；混合液中显液A与显液B的体积比为5∶1；
(4)取出后向各微孔中加入100μL终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光度值，根据不同浓度头孢氨苄标准液的吸光值绘制头孢氨苄的浓度-吸光值标准曲线图，对照该标准曲线图计算得到样品中头孢类抗生素的含量。 通过实验确定其他种头孢类抗生素的含量与头孢氨苄标准品的含量的对应值，给出校准因子，从而实现对于其他种头孢类抗生素的检测。 所述的样品前处理：样品为动物组织，将样品用匀浆器捣碎，均质，取适量均质后样品加入萃取液，3-5℃低温离心，取上清液用基质掩蔽剂稀释；牛奶样品：脱脂牛奶直接检测，对于全酯牛奶则离心出去脂肪后进行检测。 所用的萃取液为pH 7-8的磷酸盐缓冲液。
检测动物源食品中头孢氨类抗生素含量的试剂盒所用的酶联免疫检测方法采用间接竞争酶联免疫检测法。
检测动物源食品中头孢类抗生素含量的试剂盒，酶标板中包被的包被原为新霉素与BSA的偶联物；头孢氨苄与BSA的偶联物是将头孢氨苄与载体蛋白用
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