(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711474984.7
(22)申请日 2017.12.29
(71)申请人 中国中医科学院中医基础理论研究
所
地址 100007 北京市东城区东直门内南小
街16号
(72)发明人 陈春宇 陈小野 纪瑞锋
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 关畅 吴爱琴
(51)Int.Cl.
A61K 36/8945(2006.01)
A61K 9/20(2006.01)
A61P 1/16(2006.01)
(54)发明名称
应用
(57)摘要
本发明提供一种桂附地黄丸的新用途，即其
在制备肝纤维化药物中的应用。
本发明发现运用中药“桂附地黄丸”肝纤维化效果卓著，
为肝纤维化的中重视补肾法提供实验依据，
也扩大了“桂附地黄丸”
的范围。权利要求书1页 说明书5页 附图5页CN 109985146 A 2019.07.09
C N 109985146
A
权 利 要 求 书1/1页CN 109985146 A
1.桂附地黄丸在制备肝纤维化药物中的应用。
桂附地黄丸在制备肝纤维化药物中的应用
技术领域
[0001]本发明属于药物用途领域，具体涉及一种桂附地黄丸在制备肝纤维化药物中的应用。
背景技术
[0002]肝纤维化是指肝细胞发生坏死或炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织增生与分解失衡，从而在肝内异常沉积的病理过程，是多种慢性肝病的重要病理特征和发展至肝硬化的必经阶段。 [0003]肝硬化是多种慢性肝损伤的共同结果。肝硬化的一个主要发展结局是肝癌。HansPopper教授提出：“谁能阻止或延缓肝纤维化，谁将能医治大多数慢性肝病。”[0004]2006年美国第三届肝纤维化专题会议明确了肝纤维化是可逆的。目前西医肝纤维化主要从原发病、去除病因，减弱炎症与免疫
反应(IL-10、IL-1受体拮抗剂、可溶性IFN-a抗体，皮质类固醇，熊去氧胆酸、秋水仙碱和其衍生物去甲秋水仙碱、前列腺素E、S-腺苷甲硫氨酸等)，抑制肝星状细胞的活化(整合素、硒、锌制剂、金属硫蛋白、VitE、水飞蓟宾、S-腺苷甲硫氨酸、IFN-a、IFN-γ等)，中和细胞反应(TGF-β1拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制药、可溶性的6-磷酸甘露糖、肝脏生长因子等)，诱导肝星状细胞凋亡(胶黏毒素、谷氏菌素等)，增加基质的降解(佛波醇酯、细胞松弛素B、秋水仙碱、前列腺素、磷脂酰胆碱、TGF-β1拮抗剂等)等方面着手，但从临床应用来评估，抗肝纤维化研究尚未取得重大突破性进展。目前针对肝纤维化的药物不多，也没有确切而公认的有效方法，临床疗效不满意，而且药物价格昂贵，不良反应较多，费用高。很多药物还需要大规模的临床试验来证明其有效性，对肝纤维化的受到限制。中医药肝纤维化有独特的优势。[0005]中医对肝纤维化辨证主要涉及肝郁脾虚、肝肾阴虚、脾肾阳虚、瘀血阻络、湿热中阻和气滞血瘀。
[0006]2010年中国中西医结合肝病委员会制定的肝纤维化指南，将肝纤维化分为1个基本证型和3个主要证型，并强调采用基本证型和主要证型相结合的辨证和方案。该指南认为，肝纤维化的基本证型是气阴虚损、瘀血阻络，主要证型是肝胆湿热证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证。王宝恩教授认为肝纤维化及肝硬化属于血瘀证范畴，“气为血之帅，血为气之母”，运用丹参、黄芪为主的十味中药组成的861合剂抗纤维化取得较好疗效。其《阻断及逆转肝纤维的实验及临床研究》项目，获得1997年度北京市科技进步一等奖，1999年度国家科技进步奖三等奖。上海中医药大学刘平教授提出“正虚血瘀”是肝纤维化基本病
机的假说，研制出专利新药“扶正化瘀胶囊”。扶正化瘀胶囊/片由丹参、虫草菌粉、桃仁、绞股蓝、松花粉和五味子组成，2002年经国家食品药品监督管理局批准上市，已广泛应用于临床肝纤维化和肝硬化。刘平教授完成的《扶正化瘀法在抗肝纤维化中的应用及相关基础研究》获得2003年度国家科技进步奖二等奖。
[0007]综合分析中医辨治肝纤维化的现状发现：中医辨治肝纤维化的基础研究中，极少见研究补肾法对肝纤维化干预效果和机制的研究，也极少见运用温补肾阳的中药复方“桂
附地黄丸”肝纤维化。
发明内容
[0008]本发明的目的是提供一种桂附地黄丸的新用途。
[0009]本发明所提供的桂附地黄丸的新用途是其在制备肝纤维化药物中的应用。[0010]本发明发现运用中药“桂附地黄丸”肝纤维化效果卓著，为肝纤维化的中重视补肾法提供实验依据，也扩大了“桂附地黄丸”的范围。
附图说明
[0011]图1为肉眼大体观察各组大鼠肝脏的形貌图。 [0012]图2为光镜观察各组大鼠肝脏结构(HE，×100)图。
[0013]图3为光镜观察各组大鼠肝脏结构(Masson，×100)图。
[0014]图4为四组大鼠的体重对比图。
[0015]图5为四组大鼠的PT对比图。
[0016]图6为四组大鼠的PⅢP水平对比图。
[0017]图7为四组大鼠的C-Ⅳ水平对比图。
具体实施方式
[0018]下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0019]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0020]下述实施例中所采用的桂附地黄丸(浓缩丸)，规格：每8丸相当于原生药3克，购自仲景宛西制药股份有限公司，国药准字：Z41021898。
[0021]成分：肉桂、附子(制)、熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻。
[0022]性状：本品为黑棕浓缩丸，气微香，味酸、涩。
[0023]功效：温补肾阳。
[0024]实施例、药效实验
[0025]1动物模型制备及分组
[0026] 1.1实验动物分组
[0027]清洁级雄性SD大鼠48只，体重180-200g。按完全随机方法分成4组：即正常组(C组，N＝12)；模型组(M组，N＝12)；秋水仙碱组(Q组，N＝12)；桂附地黄丸组(G组，N＝12)。自由摄食全价颗粒饲料、饮水适应性喂养1周后使用。在实验过程中均分笼饲养，每笼5-6只，自然光照，并定时清洁。
[0028] 1.2肝纤维化动物模型的复制
[0029]予M组、Q组及G组大鼠40％(体积分数)CCl4(分析纯)橄榄油(化学纯)溶液皮下注射，剂量为5ml/kg，每周2次，持续2周；第三周开始，予大鼠每次剂量3ml/kg皮下注射，每周两次，持续8周，造模共计20次。C组给予相同剂量的橄榄油皮下注射，每周2次，共10周，共计20次。
[0030] 1.3给药及采取标本
[0031]从实验第1天开始定时灌胃，1次/日，根据《中药药理研究方法学》，按动物体表面积比率换算大鼠灌胃药物剂量：Q组给予秋水仙碱片0.2mg/kg；G组给予桂附地黄丸0.8g/ kg。C组及M组给予等量的蒸馏水灌胃。灌胃前先将药液静置到室温，摇匀，再根据不同体重给以药量，每日一次，共给药10周，末次给药24小时后，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，取大鼠肝脏，留取肝左叶，置于中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，用于Masson染、HE染。[0032] 1.4观测指标及检测方法
[0033](1)一般情况：体重增减、大鼠皮毛、精神状况、活动度、反应灵敏度、易激惹程度、大小便情况、死亡率。
[0034](2)肝纤维化血清标志物：血清III型前胶原(PCIII)；血清IV型胶原(C-IV)；血清透明质酸(HA)。(应用酶射免疫法测定)。
[0035](3)肝组织形态学研究
[0036]①肝脏肉眼大体观察：于实验10周末，水合氯醛麻醉下剖腹，取出完整肝脏照相。[0037]②肝组织切片HE染观察：于实验8周末，水合氯醛麻醉下剖腹，取肝左叶固定于10％中性缓冲福马林液中(配方:40％甲醛l0ml，0.0lmol/L PBS90ml)，组织从70％乙醇浓度开始，经80％，90％，95％、无水乙醇
等采用适当的时间梯度脱水，二甲苯脱水，石蜡浸蜡、包埋，制成蜡块。常规切片，HE(苏木素-伊红)染，OLYMPUS显微镜下观察。
[0038]③肝组织切片Masson染观察：将肝组织固定于Bouin氏液，流水冲洗过夜，用乙醇(70％、80％、90％、95％、100％)梯度脱水各30分钟(两次90％、95％、100％乙醇脱水)，使用二甲苯透明，之后浸蜡，最后石蜡包埋。采用常规病理切片，切片厚度为2μm，行Masson染，OLYMPUS显微镜观察并拍照。
[0039] 1.5实验结果
[0040](1)各组大鼠一般状态的比较
[0041]C组大鼠营养状况良好，体态正常，反应灵敏，眼光有神，皮毛密集有光泽，大小便正常，体重自然增加。M组大鼠一般情况较差，精神欠佳，皮毛蓬乱无华，不整洁，轻度掉毛，反应迟钝，烦躁易激惹，易抱团，体重增加较C组缓慢，大便较稀，小便发黄，部分大鼠后期出现皮肤破溃。与M组比较，Q组及G组一般情况较好，精神稍佳，较整洁，掉毛较少，G组整体精神状态优于Q组。
[0042](2)各组大鼠体重(Weight)的比较
[0043]与C组大鼠比较，M组大鼠体重明显减轻(P＜0.05)；与M组比较，Q组、G组大鼠的体重升高，但
无统计学差异(P>0.05)。(见表1，图4)
[0044](3)各组大鼠凝血酶原时间(PT)的比较
[0045]与C组大鼠比较，M组大鼠PT水平明显升高，与M组比较，Q组、G组大鼠的PT水平明显下降，但四组无统计学差异(P>0.05)。(见表2，图5)
[0046](4)各组大鼠肝纤维化结果比较
[0047]①各组大鼠PⅢP比较
[0048]与C组大鼠比较，M组大鼠PⅢP水平明显升高(P＜0.05)；与M组比较，Q组、G组大鼠的PⅢP水平明显下降(P<0.05)，与Q组比较，G组PⅢP水平下降，但无统计学差异(P>0.05)。(见表3，图6)
[0049]②各组大鼠Ⅳ型胶原比较
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