(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.11.19
C N 104155387
A (21)申请号 201410440707.4
(22)申请日 2014.09.02
G01N 30/02(2006.01)
(71)申请人四川汇宇制药有限公司
地址641000 四川省内江市城西工业园区5
号路西侧B 地块
(72)发明人刘玉应 丁兆 张仁怀 胡勋
雷富彬
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种检测方法，特别涉及一种
抗体的蛋白质含量的检测方法。包括以下步骤：
(1)配制一组不同浓度的抗体标准品，用蛋白质
层析系统测定所述抗体标准品的峰面积，由所述
峰面积和浓度梯度得出标准曲线；(2)用蛋白质
层析系统测定抗体样品的峰面积，由所述的标准
曲线计算出样品的浓度，即得抗体的蛋白质含量。
本方法操作简单、重复性好，检测时间短，准确度
高、影响因素少，不仅能检测纯化后的抗体的蛋白
质含量，还能检测细胞培养液中抗体的蛋白质含
量。并且可以选用不同的抗体标准品，得到标准曲
线，检测得出不同抗体样品的蛋白质含量，应用范
围广。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书10页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书10页 附图1页(10)申请公布号CN 104155387 A
1.一种关于抗体的蛋白质含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制一组不同浓度的抗体标准品，用蛋白质层析系统测定所述抗体标准品的峰面积，由所述峰面积和浓度梯度得出标准曲线；
用蛋白质层析系统测定抗体样品的峰面积，由所述的标准曲线计算出样品的浓度，即得抗体的蛋白质含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的用蛋白质层析系统测定，其条件是采用Protein A谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为0.5-1.0mL/min，柱温20-30℃，检测波长为280nm；
所述的流动相A，为磷酸盐和氯化钠混合的水溶液，pH为7.0-7.5；
所述的流动相B，为柠檬酸和氯化钠混合的水溶液，pH为3.4-3.8；
所述的以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，首先用流动相A进行3-5min平洗，再用流动相B进行10-15min洗脱；最后用流动相A进行3-5min洗脱。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的磷酸盐为二水磷酸二氢钠或十二水磷酸氢二钠中的一种或两种。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐的浓度为10-50mM。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的柠檬酸的浓度为10-50mM。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的氯化钠的浓度为0.05-0.3M。
7.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐的浓度为18-22mM。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的柠檬酸的浓度为18-22mM。
9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的氯化钠的浓度为0.12-0.18M。
10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的Protein A谱柱，为Mabselect SuRe 1ml预装柱。
一种关于抗体的蛋白质含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种抗体的蛋白质含量的检测方法。
背景技术
[0002] 蛋白质含量测定是在生命科学研究中经常使用的技术。目前，蛋白质测定方法有多种，但是各有局限。常规抗体的蛋白质含量的检测方法采用UV280，即利用紫外分光光度计，检测抗体在波长280nm处的OD值，然后根据抗体的摩尔消光系数计算出抗体的蛋白质含量。该方法只能对纯化后的抗体进行检测，对于细胞培养液的蛋白质含量不能进行检测，因为细胞培养液中添加物、素、杂质比较多，会干扰检测，导致检测结果不准确。[0003] 另外，常规的Lowry法用于蛋白质的含量测定。利用蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，在此复合物中加入酚试剂后，产生蓝化合物，该蓝化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。该方法试剂配制相对复杂，抗体检测结果与实际结果相差比较大，一般不采用Lowry法进行抗体蛋白质含量测定。
[0004] 抗体的蛋白质含量也可以采用Elisa来检测，该方法是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因此具有特异性；同时，由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化发生反应，产生放大作用，因此，该方法灵敏度很高，并且可以同时检测多个样品。但是该操作较复杂，需要多次洗板，重复性差，且检测时间长，通常需要24小时左右。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种抗体的蛋白质含量的检测方法，
该方法操作简单、重复性好，检测时间短，准确度高、影响因素少，不仅能检测纯化后的抗体的蛋白质含量，还能检测细胞培养液中抗体的蛋白质含量。并且可以选用不同的抗体标准品，得到标准曲线，检测得出不同抗体样品的蛋白质含量，应用范围广。[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 一种关于抗体的蛋白质含量的检测方法，包括以下步骤：
[0008] (1)配制一组不同浓度的抗体标准品，用蛋白质层析系统测定所述抗体标准品的峰面积，由峰面积和浓度梯度得出标准曲线；
[0009] (2)用蛋白质层析系统测定抗体样品的峰面积，由所述的标准曲线计算出样品的浓度，即得抗体的蛋白含量。
[0010] 所述的用蛋白质层析系统测定，其条件是采用Protein A谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为0.5-1.0mL/min，柱温20-30℃，检测波长为280nm；[0011] 根据抗体蛋白质的特点，采用Protein A谱柱进行测定，Protein A谱柱一般只结合抗体蛋白质，其它蛋白质流穿出来，专一性特别强。
[0012] 所述的流动相A，为磷酸盐和氯化钠混合的水溶液，pH为7.0-7.5；
[0013] 所述的流动相B，为柠檬酸和氯化钠混合的水溶液，pH为3.4-3.8；
[0014] 本发明选用磷酸盐、氯化钠、柠檬酸作为流动相，均为常规试剂，价格便宜，成本低，并且容易配制。
[0015] 所述的以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，首先用流动相A进行3-5min平洗，再用流动相B进行10-15min洗脱；最后用流动相A进行3-5min洗脱。
[0016] 一般细胞培养液pH值在6.8-7.4，同时，抗体蛋白质在中性环境下，抗体蛋白质容易吸附。所以我们首先用流动相A进行洗脱，pH控制在7.0-7.5，洗脱时间只需要3-5min，抗体蛋白质能很好吸附。然后再在偏酸性环境下，pH为3.4-3.8进行洗脱。因为抗体蛋白质在偏酸性环境下容易洗脱，所以只需要10-15min。最后用流动相A平衡，把层析柱再平衡好，为下一个样品做好准备。有利于提高检测的准确性和精确性。
[0017] 所述的磷酸盐为二水磷酸二氢钠或十二水磷酸氢二钠中的一种或两种。[0018] 所述磷酸盐的浓度为10-50mM。
[0019] 所述的柠檬酸的浓度为10-50mM。
[0020] 所述的氯化钠的浓度为0.05-0.3M。
[0021] 优选的，所述磷酸盐的浓度为18-22mM。
[0022] 优选的，所述的柠檬酸的浓度为18-22mM。
[0023] 优选的，所述的氯化钠的浓度为0.12-0.18M。
[0024] 所述的Protein A谱柱，优选为Mabselect SuRe 1ml预装柱。
[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0026] 本方法操作简单、重复性好，检测时间短，一般只需要30min，检测范围宽，检测浓度为0.1mg/mL-4.0mg/mL；准确度高，影响因素少，不仅能检测纯化后的抗体的蛋白质含量，还能检测细胞培养液中抗体的蛋白质含量。并且可以选用不同的抗体标准品，得到标准曲线，检测得出不同抗体样品的蛋白质含量，应用范围广。
附图说明
[0027] 图1检测纯化后的抗体的蛋白质含量的标准曲线
[0028] 图2检测细胞培养液中抗体的蛋白质含量的标准曲线
具体实施方式
[0029] 下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0030] 一、检测纯化后的抗体的蛋白质含量
[0031] 实验设计如下：
[0032] 以贝伐珠单抗的抗体标准品得到标准曲线，然后测定利妥昔单抗(实施例1)、依那西普单抗(实施例2)、西妥昔单抗(实施例3)抗体样品的峰面积，计算蛋白质浓度。[0033] 所述的利妥昔单抗为美罗华，蛋白质浓度为10mg/ml，用缓冲液稀释到1.0mg/ml；[0034] 所述的依那西普单抗为Enbrel恩利，蛋白质浓度为25mg/ml，用缓冲液稀释到1.0mg/ml；
[0035] 所述的西妥昔单抗为爱必妥，蛋白质浓度为5mg/ml，用缓冲液稀释到1.0mg/ml；[0036] 通过将本发明的检测方法得到蛋白质浓度与实际浓度相比，说明本发明检测方法的准确度。
[0037] 具体实施如下：
[0038] (1)测定贝伐珠单抗的抗体标准品的标准曲线
[0039] 以贝伐珠单抗配制一组浓度分别为4.0mg/ml,2.0mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ ml,0.25mg/ml,0.125mg/ml的抗体标准品，用蛋白质层析系统测定，采用Mabselect SuRe 1ml预装柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱的体积时间见表2所示，进样量为500ul，流速为1.0mL/min，柱温25℃，检测波长为280nm；
[0040] 所述的流动相A，为浓度为20mM的二水磷酸二氢钠和0.15M的氯化钠混合的水溶液，pH为7.2；
[0041] 所述的流动相B，为浓度为20mM的柠檬酸和0.15M的氯化钠混合的水溶液，pH为3.6。
[0042] 测定所述抗体标准品的峰面积，见表1，由所述峰面积和浓度梯度得出标准曲线(图1)，y＝164.71x+3.1171,R2＝0.9998；
[0043] 表1 抗体标准品浓度与峰面积
[0044]
[0045] 表2 流动相梯度洗脱的体积时间表
[0046]
时间(min)流动相A(v％)流动相B(v％)
0.001000
3.001000
3.010100
13.000100
13.011000
18.001000
[0047] (2)测定利妥昔单抗(实施例1)、依那西普单抗(实施例2)、西妥昔单抗(实施例3)抗体样品的峰面积，计算蛋白质浓度。
[0048] 实施例1
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