(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710656465.6
(22)申请日 2017.08.03
(71)申请人 上海上药第一生化药业有限公司
地址 200240 上海市闵行区剑川路1317号
(72)发明人 贾存宇 李晓倩 陆倩 黄臻辉
(74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283
代理人 薛琦 袁红
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种硫酸多黏菌素B的分析检
测方法。该检测方法包含以下步骤：采用高效液
相谱法联合蒸发光散射器，对硫酸多黏菌素B
进行分析检测，即可。该方法实现了将硫酸多黏
菌素B中四个组分完全分离，专属性强，操作简
单，且不受其他有机杂质干扰，效果与EP 9.0原
料药的HPLC方法接近、
灵敏度高、简单快速，能更准确地用于测定硫酸多黏菌素B制剂中各组分含
量。权利要求书2页 说明书9页 附图7页CN 107367562 A 2017.11.21
C N 107367562
A
1.一种硫酸多黏菌素B的分析检测方法，其特征在于，包含以下步骤：采用高效液相谱法联合蒸发光散射器，对硫酸多黏菌素B进行分析检测，即可；
所述的高效液相谱法中的谱柱为反相分析柱，所述谱柱固定相为十八烷基键合硅胶；
所述的高效液相谱法中的流动相为极性有机溶剂和三氟乙酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积百分含量为0.01％～0.3％。
2.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于，所述的高效液相谱法采用梯度洗脱，所述梯度洗脱时所述三氟乙酸水溶液与所述极性有机溶剂的体积比为85:15～60:40。
3.如权利要求2所述的分析检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱中，所述流动相比例随时间的变化范围如表1所示：
表1
4.权利要求2或3所述的分析检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱中，所述流动相比例随时间的变化范围如表2或表3所示：
表2
表3
5.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于，所述三氟乙酸水溶液中的三氟乙酸的体积百分含量为0.05％～0.1％。
6.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于，所述极性有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种；
和/或，所述高效液相谱法中的高效液相谱仪为Waters的型号为Alliance e2695高效液相谱仪；
和/或，所述谱柱为Kromasil 100-5C18柱；
和/或，所述谱柱的填料颗粒度为2.7μm～5μm；优选3μm～5μm；所述谱柱的长度为100mm～250mm，优选250mm；
和/或，所述谱柱的进样体积为1～50μL，优选20μL；
和/或，所述高效液相谱法中的柱温为20～40℃，优选35℃；
和/或，所述的流动相的流速为0.5～1.5mL/min，优选0.8～1.0mL/min。
7.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于，所述蒸发光散射器为厂家为Waters 的型号为2424的蒸发光散射器；
和/或，所述蒸发光散射器的漂移管温度为40～80℃，优选60～70℃；
和/或，所述蒸发光散射器的载气压力为20～45psi，优选25～35psi；
和/或，所述蒸发光散射器的雾化口温度为12℃～35℃；优选12～30℃。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的分析检测方法在硫酸多黏菌素B原料药或制剂含量检测中的应用。
9.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述制剂为注射用无菌粉末。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包含以下步骤：步骤(1)、分别配置一定浓度的对照品溶液和硫酸多黏菌素B原料药或制剂待测品溶液，采用上述分析检测方法对所述对照品溶液和所述硫酸多黏菌素B制剂待测品溶液进行分析检测；测得所述对照品溶液和所述硫酸多黏菌素B制剂中各组分的峰面积；
步骤(2)、根据所述对照品溶液中所述硫酸多黏菌素B中各组分的峰面积和相应的组分浓度，得到回归方程；较佳地，所述回归方程通过拟合二次曲线计算获得；
步骤(3)、所述硫酸多黏菌素B原料药或制剂的各组分的含量由步骤(1)中测得的各组分的峰面积的代入步骤(2)中得到的回归方程，即可。
硫酸多黏菌素B的分析检测方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及硫酸多黏菌素B分析检测方法及应用。
背景技术
[0002]多黏菌素B(polymyxin B)是由多黏芽胞杆菌产生的、由多种氨基酸和脂肪酸组成的一种碱性多肽类抗生素。目前的生产主要采用微生物发酵法生物合成，再经提取精制得到。临床使用其硫酸盐，主要作为抗感染类药物使用，由绿脓杆菌等革兰氏阴性菌引起的皮肤创面、泌尿系统以及眼、耳、气管等部位感染，也可用于败血症、腹膜炎等。硫酸多黏菌素B为结构相似的多组分混合物，包括多黏菌素B1、B2、B3、B1-I。其中，B1和B2是有效成分，B3和B1-I为主要杂质。化学结构式如下：
[0003]
[0004]具体地，多黏菌素B1、B2、B3和B1-I结构上的区别如下所示：
[0005]
[0006]
[0007]目前，欧洲药典EP 9.0、美国药典USP 40及中国药典ChP 2015均收载了硫酸多黏菌素B或其制剂的相关分析检测方法。
[0008]其中，在EP 9.0中硫酸多黏菌素B含量测定采用硫酸钠-磷酸-水-乙腈体系的反相高效液相谱法等度洗脱，紫外波长215nm处检测，外标法计算各组分含量，单针分析时间约50min。无相关制剂的检测方法；
[0009]USP 40和ChP 2015虽采用微生物抗生素效价法计算硫酸多黏菌素B及其制剂的含量，但在多黏菌素组分检查项下也采用了和EP 9.0一致的高效液相谱法，且均要求以干燥品计，B1、B2、B3、B1-I
总和≥80.0％，B3≤6.0％、B1-I≤15.0％；
[0010]Orwa等采用乙腈-硫酸钠水溶液(0.7％，m/v)-磷酸水溶液(5.8％，v/v)-水(22.25：50：5：22.75)为基础流动相，在215nm考察了不同pH下硫酸多黏菌素B1、B2、B3的分离情况(Journal of Chromatography A,870(2000)237–243)。
[0011]由于硫酸多黏菌素B中的各组分结构相似，仅在脂肪酸链和Z位氨基酸残基有区别，且各单组分的含量差异大。加之硫酸多黏菌素B在215nm下吸收较弱，采用上述方法时各组分的信号强度低，所以会一定程度影响定量分析时谱积分的准确性；并且，等度洗脱方法也有导致分离各组分的柱效低、分析时间较长等缺点。因此，开发一种快速、灵敏、准确、同时能对各组分进行定量分析的方法，对药品的质量控制有重要意义。
发明内容
[0012]本发明所解决的技术问题在于为了克服现有技术中采用抗生素微生物效价法测定硫酸多黏菌素B时专属性差、精密度低、或者采用高效液相谱联用紫外检测器对硫酸多黏菌素B进行分析检测时，存在流动相配制复杂、灵敏度低、重复性差、分析时间长等问题，从而提供了一种硫酸多黏素菌B的分析检测方法及其应用，该分析方法相对于抗生素微生物效价法专属性强操作简单，可以将四个组分完全分离，且不受其他有机杂质干扰，效果与EP 9.0原料药的HPLC方法接近、灵敏度高、简单快速，能更准
确地用于测定硫酸多黏菌素B 制剂中各组分含量。
[0013]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的。
[0014]本发明提供了一种硫酸多黏菌素B的分析检测方法，其包含以下步骤：采用高效液相谱法联合蒸发光散射器，对硫酸多黏菌素B进行分析检测，即可；
[0015]所述的高效液相谱法中的谱柱为反相分析柱，谱柱固定相为十八烷基键合硅胶；例如Kromasil 100-5C18柱；
[0016]所述的高效液相谱法中的流动相为极性有机溶剂和三氟乙酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积百分含量为0.01％～0.3％；所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积百分含量的计算方法为三氟乙酸的体积占三氟乙酸水溶液总体积的比例。[0017]本发明中，所述硫酸多黏菌素B为多黏菌素B1、B2、B3和B1-I混合物。
[0018]本发明中，所述的高效液相谱法可采用梯度洗脱，所述梯度洗脱时所述三氟乙酸水溶液与所述极性有机溶剂的体积比可为85:15～60:40。
[0019]本发明中，所述梯度洗脱中，所述流动相比例随时间的变化范围可如表1所示：[0020]表1
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