(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111304130.0
(22)申请日 2021.11.05
(71)申请人 江西邦泰绿生物合成生态产业园
发展有限公司
地址 330115 江西省南昌市赣江新区直管
区桑海产业园新港商务中心28栋1-2
楼
(72)发明人 傅荣昭 熊建伟 周文俊
(51)Int.Cl.
C12N 15/70(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
C12N 15/53(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12P 41/00(2006.01)
C12P 33/00(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种熊去氧胆酸的制备方法，通
过将7α‑羟基类固醇脱氢酶(7α‑HSDH)、7β‑羟
基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、
质粒pRSFDuet ‑1上，四个酶在表达宿主BL21
(DE3)中过表达，将鹅去氧胆酸直接在发酵培养
化率，该方法快速、温和、经济、绿，经过纯化能
于工业化生产。权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 114015712 A 2022.02.08
C N 114015712
A
1.一种熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：将7α‑羟基类固醇脱氢酶、7β‑羟基类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶四个酶构建在同一个共表达质粒pRSFDuet ‑1上，转化BL21‑DE3表达宿主，发酵转化底物鹅去氧胆酸，生成熊去氧胆酸。
2.根据权利1要求所述的一种熊去氧胆酸制备方法，其特征在于，所述7α‑羟基类固醇脱氢酶和7β‑羟基类固醇脱氢酶分别来源于大肠杆菌和活泼瘤胃球菌，乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶分别来自乳酸杆菌和芽孢杆菌，基因合成均为已优化的密码子。
3.根据权利1要求所述的一种熊去氧胆酸制备方法，其特征在于：
①四个酶共表达质粒pRSF ‑GDH ‑7β‑LDH ‑7α的构建方式为：首先分别构建2个双酶共表达质粒pRSF ‑LDH ‑7α和pRSF ‑GDH ‑7β，再通过重叠延伸PCR将LDH ‑7α和GDH ‑7β两个基因片段拼接在一起，新的基因片段GDH ‑7β‑LDH ‑7α通过酶切连接的方式连接到共表达质粒pRSFDuet ‑1上；
②验证正确的四酶共表达质粒pRSF ‑GDH ‑7β‑LDH ‑7α，转入BL21‑DE3表达菌株，得到工程菌，得到转化鹅去氧胆酸的大肠杆菌；
③鹅去氧胆酸的全细胞催化方法：首先通过发酵培养并诱导表达，得到高密度的工程菌发酵液，通过外源补加转化底物鹅去氧胆酸、丙酮酸钠和葡萄糖，继续诱导培养，最终得到熊去氧胆酸；
④熊去氧胆酸粗品纯化方法：发酵液调酸收集全部沉淀后甲醇提取产物中的熊去氧胆酸或直接在发酵液中用甲醇提取熊去氧胆酸，经过降温析晶，得到熊去氧胆酸粗品，再经过两次丙酮‑水精制，最终可得到＞99.8高纯度的熊去氧胆酸精品。
权 利 要 求 书1/1页CN 114015712 A
一种熊去氧胆酸的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种新构建的大肠杆菌(Escherichia coli)及其用于制备熊去氧胆酸的全细胞催化方法，属于应用微生物工程技术领域。
背景技术
[0002]熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)作为我国名贵中药熊胆的主要有效成分，在临床上广泛用于各种肝胆疾病，包括胆结石、病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化等。至今为止，熊去氧胆酸是唯一由美国FDA批准的可用于原发性胆汁性肝硬化的药物。[0003]目前UDCA的制备方法有三种。首先，最传统的方式是从熊胆汁中提取，即采用引流技术从活熊身上取得熊胆汁后，经过提取和分离纯化等步骤得到，由于熊胆是一种非常稀有的资源，必须依赖人工养殖活熊，这种周期过长、收率低、不人道的传统方式已经被其他方法淘汰；其次是化学合成制备UDCA，以来源于牛、猪、鸡、鸭等动物胆汁中的胆酸(Cholic acid，CA)、猪去氧胆酸(Hyodeoxycholic acid，HDCA)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)为原料合成得到，该方法广泛用于工业生产，但是化学法合成UDCA
往往过程复杂，污染大，并且涉及高温高压等危险步骤，显然这种方法已经不适合我国高质量绿发展的方向；最后，经过最近几十年的研究，人们发现以CDCA为原料，酶法制备UDCA，利用生物酶的选择性催化特性，使得底物的特定位点产生化学反应的性质，完成氧化和还原两步反应，生成熊去氧胆酸，不仅工艺简单、反应条件温和，而且效率高、杂质少。
[0004]而现在常用的酶法转化方法，通常需要(1)通过发酵生产制备多个酶，并进行细胞破碎以及分离得到用于生产的粗酶液；(2)在反应体系加入昂贵的辅酶；(3)加入少量的有机溶剂作为助溶剂；(4)多步反应等方式才能得到高转化率的产品。充分利用大肠杆菌的自身的特点，将多个生物酶构建在同一个表达宿主，成为直接转化底物的大肠杆菌“”，同时工程菌胞内含有大量可供反应的辅酶，不仅简化了繁琐的制酶和多步反应过程，同时又减少了辅酶的用量，极大地减少了生产成本。
[0005]2017年，上海中医药大学的赵淑娟研究团队，利用合成生物学手段将多个7α和7β进行组合表达构建大肠杆菌工程菌进行全细胞催化，最高的UDCA转化率也仅有50％左右，且底物浓度也只有3g/L，这完全无法达到工业化生产的要求。
[0006]本发明通过引入两个辅酶再生体系，且分别是两组不同的辅酶，通过外源性添加反应底物鹅去氧胆酸、丙酮酸钠和葡萄糖，最终可以实现99％以上的转化率。
发明内容
[0007]本发明的目的是提供一种快速、温和、经济、绿的制备熊去氧胆酸的全细胞催化方法，仅仅利用底物鹅去氧胆酸、丙酮酸钠和葡萄糖，通过大肠杆菌生物转化就能得到＞99％高转化率的熊去氧胆酸。
[0008]将7α‑羟基类固醇脱氢酶(7α‑HSDH)、7β‑羟基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)四个酶构建在同一个共表达质粒pRSFDuet‑1上，转化BL21
(DE3)表达宿主，构建好的工程菌成为一个大肠杆菌“”，直接发酵转化底物鹅去氧胆酸，生成熊去氧胆酸。
[0009]四个酶共表达质粒(pRSF‑GDH‑7β‑LDH‑7α)的构建，首先分别构建2个双酶共表达质粒pRSF‑LDH‑7α和pRSF‑GDH‑7β，再通过重叠延伸PCR将LDH‑7α和GDH‑7β两个基因片段拼接在一起，新的基因片段GDH‑7β‑LDH‑7α通过酶切连接的方式连接到共表达质粒pRSFDuet‑1上。
[0010]验证正确的四酶共表达质粒pRSF‑GDH‑7β‑LDH‑7α，转入BL21(DE3)表达菌株，得到工程菌，得到转化鹅去氧胆酸的大肠杆菌。
[0011]鹅去氧胆酸的全细胞催化，首先通过发酵培养并诱导表达，得到高密度的工程菌发酵液，通过外源补加转化底物鹅去氧胆酸、丙酮酸钠和葡萄糖，继续诱导培养，最终得到高转化率(＞99％)的熊去氧胆酸。
[0012]熊去氧胆酸发酵液粗品，调酸收集全部沉淀后甲醇提取产物中的熊去氧胆酸或直接在发酵液中用甲醇提取熊去氧胆酸，经过降温析晶，得到熊去氧胆酸粗品，再经过两次丙酮‑水精制，最终可得到＞99.8高纯度的熊去氧胆酸精品。
附图说明
[0013]图1.CDCA酶法制备UDCA的反应流程图；
[0014]图2.四酶共表达重组载体pRSF‑GDH‑7β‑LDH‑7α；
[0015]图3.四酶基因片段用HindIII单酶切琼脂糖凝胶电泳；
[0016]图4.大肠杆菌“”全细胞催化示意图。
具体实施方式
[0017]以下实施例及其说明用于解释本发明，但并不构成对本发明的不当限定。本申请中下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译。第4版，北京科学出版社，2017)中所述的方法进行。
[0018]若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为实验室常规生化试剂。
[0019]实施例1.双酶共表达载体的构建
[0020](1)pRSF‑LDH‑7α重组载体的构建
[0021]pRSFDuet‑1为实验室保存的共表达载体，LDH和7α均为金斯瑞公司全基因合成，重组表达载体分别是pET28a‑LDH和pET28a‑7α，DNA限制内切酶和高保真DNA聚合酶均购自Takara公司，具体载体构建方法如下：
[0022]pRSFDuet‑1载体的获得：‑80℃保存的Top10菌株(含有pRSFDuet‑1载体)三线划区加了50μg/ml卡那霉素(Kan)的LB固体平板培养基，37℃过夜培养后挑取单克隆接种5ml LB 液体培养基(Kan＝50μg/ml)，37℃、220rpm过夜培养后用天根质粒小提试剂盒提取质粒。[0023]pET28a‑LDH和pET28a‑7α载体获得方式同上。
[0024]目的基因片段L D H和7α的获得：L D H上下游引物分别是L D H_F(5’‑C A T G C C A T G G G C A T G A C A A A A A T‑3’)，下划线为酶切位点N c o I；L D H_R(5’‑CCAAGCTTTTAACCAACTTTCACCGGC‑3’)下划线为酶切位点HindIII。7α上下游引物分别是7α_F
(5’‑C G C C A T A T G T T C A A C A G C G A C A A C‑3’)，下划线为酶切位点N d e I；7α_R(5’‑CGCT
CGAGTTAGTTCAGTTCTTGCACGCC‑3’)下划线为酶切位点XhoI。设置PCR反应体系50μl：LDH_F/R或7α_F/R(10μM)各1μl，2xDNA聚合酶mix 25μl，pET28a‑LDH或pET28a‑7α质粒模板各0.5μl，补加双蒸水至50μl。PCR程序为：98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸30s，30个循环。用1％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收目标PCR产物，胶回收试剂盒用的是全式金的DNA纯化试剂盒。
[0025]载体pRSF‑7α重组载体的构建：由于LDH基因片段上含有NdeI酶切位点，7α上游的酶切位点也是NdeI，故构建双表达载体时先将7α片段连接上去；pRSFDuet‑1及7α片段用NdeI和XhoI双酶20μl体系：pRSFDuet‑1质粒或7α片段各5μl，10x buffer 2μl，NdeI和XhoI 各0.5μl，双蒸水12μl。37℃水浴酶切1h，80℃灭活15min后加入10x loading buffer 2μl，用1％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切产物，胶回收试剂盒用的是全式金的DNA纯化试剂盒。回收纯化的质粒大片段和7α连接反应：7α片段和质粒片段各3μl，10x T4 buffer 1μl，T4连接酶0.5μl，双蒸水3.5μl。22℃连接1h。3μl连接产物转化Top10感受态细胞，复苏1h涂布含有50μg/ml卡那霉素的LB固体平板，37℃过夜培养。用7α_F/R进行转化子的菌落PCR验证，验证无误的转化子转接LB液体培养基(Kan＝50μg/ml)，37℃培养过夜提取质粒pRSF‑7α待用。
[0026]载体pRSF‑LDH‑7α重组载体的构建：pRSF‑7α及LDH片段用NcoI和HindIII双酶20μl 体系：pRSF‑7α及LDH片段各5μl，10x buffer 2μl，NcoI和HindIII各0.5μl，双蒸水12μl。37℃水浴酶切1h，80℃灭活15min后加入10x loading buffer2μl，用1％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切产物。回收纯化的质粒大片段和LDH连接反应：LDH片段和质粒片段各3μl，10x T4 buffer 1μl，T4连接酶0.5μl，双蒸水3.
5μl。22℃连接1h。3μl连接产物转化Top10感受态细胞，复苏1h涂布含有50μg/ml卡那霉素的LB固体平板，37℃过夜培养。用LDH_F/R进行转化子的菌落PCR验证，验证无误的转化子转接LB液体培养基(Kan＝50μg/ml)，37℃培养过夜提取质粒pRSF‑LDH‑7α待用。
[0027](2)pRSF‑GDH‑7β重组载体的构建
[0028]GDH和7β均为金斯瑞公司全基因合成，重组表达载体分别是pET28a‑GDH和pET28a‑7β，DNA限制内切酶和高保真DNA聚合酶均购自Takara公司，具体载体构建方法如下：[0029]pRSFDuet‑1、pET28a‑GDH和pET28a‑7β载体获得方式同上述步骤(1)。
[0030]目的基因片段G D H和7β的获得：G D H上下游引物分别是G D H_F(5’‑C ATG C C A TG G G C A TG C C AG C T C C C T A T A A‑3’)，下划线为酶切位点N c o I；G DH_R(5’‑CCAAGCTTTTACGAACTCCAGTTGTTC‑3’)下划线为酶切位点HindIII。7β上下游引物分别是7β_F (5’‑CGCCATATGAACCTGCGTGAGAA‑3’)，下划线为酶切位点NdeI；7β_R(5’‑CGCTCGAGTTAGTTG TTGCTATAGAAGCTACC‑3’)下划线为酶切位点XhoI。设置PCR反应体系50μl：GDH_F/R或7β_F/R (10μM)各1μl，2xDNA聚合酶mix 25μl，pET28a‑GDH或pET28a‑7β质粒模板各0.5μl，补加双蒸水至50μl。PCR程序为：98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸30s，30个循环。用1％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收目标PCR产物。
[0031]载体pRSF‑7β重组载体的构建：pRSFDuet‑1及7β片段用NdeI和XhoI双酶切20μl体系：pRSFDuet‑1质粒或7β片段各5μl，10x buffer 2μl，NdeI和XhoI各0.5μl，双蒸水12μl。37℃水浴酶切1h，80℃灭活15min后加入10x loading buffer2μl，用1％的琼脂糖凝胶电泳切
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