(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910970876.1
(22)申请日 2019.10.14
(71)申请人 四川大学
地址 610065 四川省成都市武侯区一环路
南一段24号
(72)发明人 孙逊 张志荣 龚涛 白淑婷
侯盈盈
(51)Int.Cl.
A61K 9/19(2006.01)
A61K 47/26(2006.01)
A61K 47/36(2006.01)
A61K 39/39(2006.01)
(54)发明名称
法和用途
(57)摘要
本发明公开了一种含铝佐剂的疫苗的冻干
制剂及其制备的方法和用途。该铝盐疫苗冻干制
剂含有：阴离子聚合物或其衍生物和铝盐复合形
干保护剂，本发明提供的冻干方法避免了疫苗中
氢氧化铝的大量聚集、减少了抗原活性的破坏。
本发明可以提高疫苗在冻干过程和储存过程中
的稳定性，可以使疫苗摆脱冷链运输，降低成本、
节约能源，尤其解决了偏远地区低温冷链难以保
障的技术问题。权利要求书2页 说明书18页 附图9页CN 111658617 A 2020.09.15
C N 111658617
A
1.一种含铝佐剂疫苗的冻干制剂，其特征在于铝盐与阴离子聚合物或其衍生物相互作用形成纳米或微米颗粒，同时吸附抗原和/或疫苗佐剂，还含有冻干保护剂。
2.如权利要求1所述的含铝佐剂疫苗的冻干制剂，其中所述铝盐为硫酸铝，基于重量份计，氢氧化铝：阴离子聚合物或其衍生物：抗原：其他佐剂：冻干保护剂的重量比为 0.152~1.52：0.12~3：0.01~0.1：0~0.1：20~150。
3.如权利要求1-2任一所述的含铝佐剂疫苗冻干制剂，其特征在于，所述的阴离子聚合物包括天然或者内源性、半合成衍生物或全合成的阴离子聚合物材料。
4.如权利要求1-2任一所述的含铝佐剂的疫苗冻干制剂，其特征在于，所述的阴离子聚合物或其衍生物还包括衍生化修饰，包括：PEG，羧基，羧甲基，硫酸根、亚硫酸根、磷酸根或亚磷酸根的修饰。
5.如权利要求1-2任一所述的含铝佐剂的疫苗冻干制剂，其特征在于，所述的阴离子聚合物或其衍生物包括：线性聚合物，交联聚合物，或支化共聚物的一种或多种。
6.如权利要求1-2任一所述的含铝佐剂的疫苗冻干制剂，其特征在于，所述的冻干保护剂包括多糖类、多元醇类、聚合物、氨基酸、表面活性剂、无水溶剂的一种或多种，所述多糖类包括海藻糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、葡聚糖、糊精的一种或多种，所述多元醇类包括甘露醇、甘油，所述聚合物类包括PVP、PEG、PVA中的一种或多种，所述表面活性剂类包括吐温80、泊洛沙姆188、阿拉伯胶中的一种或多种，所述氨基酸类包括L -丝氨酸、精氨酸、氨酸、赖氨酸盐酸盐、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸、苯丙氨酸中的一种或多种，所述无水溶剂包括DMSO。
7.如权利要求1-2任一所述的含铝佐剂疫苗的冻干制剂，其特征在于，所述的抗原选自：蛋白类抗原选自乙型肝炎表面抗原HBsAg、重组PreS1、PreS2、重组核心蛋白、丙型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原、毒素结合蛋白、肺炎链球菌蛋白、AM蛋白、链球菌C5a 肽酶、牵连蛋白结合蛋白、丝氨酸羧酸酯酶、B型脑膜炎球菌外膜蛋白OMP、鸡卵清白蛋白、苍白密螺旋体表面脂蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、转铁蛋白、胰岛素、乳白蛋白、肌白蛋白、豆白蛋白、麦白蛋白、肌红蛋白、胶原蛋白、纤层蛋白的一种或多种；或类毒素类选自白喉类毒素、破伤风类毒素、毒素，或多糖类如A多糖、荚膜多糖、肺炎球菌多糖、伤寒多糖、脑膜炎球菌多糖，或病毒样颗粒如人乳头瘤病毒、轮状病毒的一种或多种，或灭活或减毒类疫苗抗原选自百日咳毒素、甲型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病毒、脊髓灰质炎索尔克株病毒抗原、流感病毒、巨细胞病毒、喷鼻流感抗原、水痘—带状胞疹病毒、腮腺炎抗原、风疹病毒、天花病毒、麻疹、水痘、黄热病、脊髓灰质炎噻宾株、呼吸道合胞病毒；或减弱、杀灭的菌
类如或活分枝杆菌、白喉棒状杆菌、百日咳博得特氏菌、A组链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、侵肺军团菌、弧菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、苍白密螺旋体；或多糖-蛋白复合物如肺炎球菌多糖结合物、脑膜炎球菌多糖-蛋白结合物的一种或多种；或核酸、单链和双链核酸、超螺旋质粒DNA、线性质粒DNA、粘粒、细菌人工染体、酵母人工染体、哺乳动物人工染体、RNA的一种或多种；或合成的多肽类抗选自A组链球菌M肽、TRP2、HGP100、p15E、铜绿假单胞菌合成肽、风疹病毒合成肽的一种或多种；或肿瘤细胞裂解液抗原，细菌裂解液抗原，肿瘤全细胞抗原中的一种或多种。
8.如权利要求1-2任一所述的含铝佐剂疫苗的冻干制剂，其特征在于，所述的佐剂包括：细胞因子GM -CSF、干扰素、白细胞介素IL -2、IL -6、IL -1、IL -12，Toll样受体激动剂选自
CpG-ODN、双链RNA的一种或多种，单磷酸脂质A，多糖类佐剂选自菊粉、壳聚糖、葡聚糖的一种或多种，毒素B亚单位，大肠杆菌不耐热肠毒素，脂多糖，热休克蛋白，皂苷佐剂，Limquiod。
9.如权利要求1-9任一所述的含铝佐剂疫苗的冻干制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
（1）将Hepes缓冲液与阴离子聚合物材料或其衍生物，抗原和/或佐剂混合均匀作为A 相；
（2）硫酸铝水溶液作为B相；
（3）将A和B两相混合，即得半成品；
（4）向半成品中加入冻干保护剂，混合均匀；
（5）将半成品置于-40℃—-80℃预冻4至24h；
（6）冻干机降温至-40℃以下时，抽真空至冻干机体系压力为0.1
~0.01mbar，冻干大于
等于24h。
10.如权利要求1-8任一所述的含铝佐剂疫苗的冻干制剂的应用，包括：预防性和性疫苗的生产制备、运输储存。
一种含铝佐剂疫苗的冻干制剂及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明属于疫苗生产工艺技术领域，具体涉及一种含铝佐剂疫苗的冻干制剂、其制备方法以及其用途。
背景技术
[0002]疫苗的应用极大地降低了常见流行性传染病的发病率和死亡率，使得很多流行性传染病得到了有效的控制。近些年来，随着对免疫系统相关机制更深入地了解，疫苗的发展取得了长足的进步，其不仅在传统防治领域表现愈发出，而且在HIV、癌症等病症上也开始崭露头角。如今疫苗已经成为人类医疗卫生中不可或缺的药物。
[0003]由于疫苗的应用越来越广泛，其生产、运输贮存过程存在的稳定性问题也越受关注。冻干技术为疫苗稳定性提供了更有利的条件。干燥后蛋白药物呈疏松饼状，水分含量低、物理化学性质更稳定，可以延长保存期限，减轻重量降低运输成本等。但是冻干是复杂的相变过程，冻干制品在整个过程存在着各种应力，包括低温应力、冻结应力、干燥应力等，它们常常是导致制品中蛋白质变性的因素。目前使用的冻干工序大都较为复杂，因为冻干技术中的各项参数设置及变化，都会对冻干制品的质量产生明显影响，在冻干过程中，不恰当的温度和时间对疫苗质量会产生不良影响，导致疫苗失去活性。加入多种冻干保护剂以及赋形剂可以防止蛋白药物变性，但是冻干保护剂复杂的成分会容易引起不良反应，复杂的冻干工序也使冻干制剂成本变高。因此虽然已经有一些冻干疫苗制剂上市，但是生产高效、安全、低成本的疫苗冻干制品仍然是一个亟待解决的问题。
[0004]铝佐剂从20世纪初被提出到现在长达八十几年的使用史充分证明了它的安全性和有效性，现在市售的大部分疫苗如乙肝疫苗、HPV疫苗、破伤风疫苗等都含有铝佐剂。铝佐剂通过与抗原的混合将抗原吸附，在体内形成抗原储库从而延长抗原在体内的停留时间；并在局部刺激相关细胞释放炎症因子，促
进抗原提呈细胞进行抗原提呈、诱导产生多种免疫细胞、诱导Th2型免疫应答，比游离的抗原产生更有效的免疫应答(“Munks,M.W.Towards an understanding of the adjuvant action of aluminium”,Marrack et al,Nature reviews.Immunology, 2009年9卷4期，第287-93页,2009年4月)。现在大部分疫苗都使用了铝佐剂。但目前所有上市的含铝佐剂的疫苗，均不能进行冷冻或冻干处理(《疫苗(第6版)》，Stanley Hem et al，人民卫生出版社，上册第一篇第五章，第85页，2017年)，冷冻后会形成摇不散的凝结物，破坏疫苗的结构和免疫原性。因此产品必须在2-8℃下保存，为疫苗的储存和运输带来不便。
[0005]我国幅员辽阔，南北气候差异大，这对冷链长距离运输带来不少挑战，另外冷链运输过程中冷藏车的车况、外界环境气温、路况、航班安排等因素的影响都会使得运输环节出现冷链“断链”等问题，这直接影响到疫苗的稳定性和有效性。而且这种高成本高风险的运输方式还严重的限制了农村等偏远地区对疫苗的使用。
[0006]因此，如何提供一种可以冻干的含铝佐剂的疫苗制剂，避免冷链运输，提高疫苗的稳定性和安全性，降低成本和风险是临床亟需解决的问题。
发明内容
[0007]本发明的目的之一在于提供一种含铝佐剂疫苗的冻干制剂、其制备方法以及其用途，该冻干制剂与未冻干的制剂相比，具有相同的免疫原性，且具有更高的热稳定性，可以降低生产成本，解决疫苗的
冷链运输问题。
[0008]本发明的目的之一在于提供了一种含铝佐剂的疫苗冻干制剂，铝佐剂优选为铝盐佐剂，进一步优选为氢氧化铝佐剂。
[0009]本发明的目的之一在于提供了一种冻干含铝佐剂的疫苗的方法，其特征在于疫苗制剂为纳米颗粒或微米颗粒，其优选为纳米颗粒，优选粒径为500nm～50nm，进一步地优选为 300～50nm，更优选为150nm～80nm。
[0010]本发明的目的之一在于提供了一种冻干含铝佐剂的疫苗的方法，其特征在于疫苗制剂中加入了冻干保护剂。
[0011]所述的冻干保护剂包括，多糖类、多元醇类、聚合物、氨基酸、表面活性剂、无水溶剂，所述多糖类包括海藻糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、葡聚糖、糊精的一种或多种，所述多元醇类包括甘露醇、甘油，所述聚合物类包括PVP、PEG、PVA中的一种或多种，所述表面活性剂类包括吐温80、泊洛沙姆188、阿拉伯胶中的一种或多种，所述氨基酸类包括L-丝氨酸、精氨酸、氨酸、赖氨酸盐酸盐、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸、苯丙氨酸中的一种或多种，所述无水溶剂包括DMSO，优选为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇的一种或多种。[0012]所述冻干保护剂的质量浓度为2％～15％(w/v)，进一步的优选为2％～10％，更优选为 5％。
[0013]所述的铝佐剂纳米粒为铝盐与阴离子聚合物或其衍生物相互作用，复合形成的铝盐纳米颗粒。优选的，本发明利用硫酸铝在碱性条件生成氢氧化铝，氢氧化铝带正电荷，阴离子聚合物或其衍生物带负电荷，阴离子聚合物可通过静电作用对氢氧化铝进行修饰，从而有效地限制氢氧化铝沉淀而过度聚集生长，得到稳定性更好、易于分散的纳米级的氢氧化铝半成品。
[0014]本发明所述的疫苗冻干制剂所用的阴离子聚合物或其衍生物，其特征在于所述天然或者内源性阴离子聚合物材料包括：γ-聚谷氨酸、粘多糖、聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸、透明质酸、软骨素、肝素、肝素钠、岩藻多糖、岩藻半乳聚糖、海藻酸盐、琼脂、吉兰糖胶、印度树胶、卡拉亚胶、黄耆胶、角质素、海藻酸、葡聚糖、硫酸木甘露聚糖、兰胶、黄原胶、角叉菜胶的一种或多种；所述半合成衍生阴离子聚合物材料包括：硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素、交联焦糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基壳聚糖、透明质酸衍生物、硫酸鼠李多糖、硫酸纤维素、硫酸凝胶多糖和磷酸壳聚糖的一种或多种；所述全合成阴离子聚合物材料包括：聚阴离子多肽、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬氨酸接枝聚乙二醇、聚谷氨酸接枝聚乙二醇、聚卡波菲尔、羧乙烯聚合物、马来酸酐共聚物、硫醇化聚丙烯酸酯的一种或多种。
[0015]所述的阴离子聚合物可以进行衍生化修饰，但不限于PEG，羧基，硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、亚磷酸根修饰。
[0016]所述的阴离子聚合物可以是线性聚合物，交联聚合物，或支化共聚物。
[0017]本发明的目的之一提供一种含铝佐剂的疫苗的冻干制剂，其特征在于所述抗原选自：蛋白类抗原包括乙型肝炎表面抗原HBsAg、重组PreS1、PreS2、重组核心蛋白、丙型肝炎
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