(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910614506.4
(22)申请日 2019.07.09
(71)申请人 陕西科技大学
地址 710021 陕西省西安市未央区大学园
(72)发明人 钱卫东 杨敏 王婷 沈兰芳
刘淼 孙照欢 张家宁 王文静
(74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任
公司 61200
代理人 范巍
(51)Int.Cl.
A61K 31/192(2006.01)
A61P 31/04(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了香草酸在抑制多重耐药霍氏
肠杆菌生长中的应用，根据香草酸对耐哌拉西
林、左氧氟沙星、溴格门汀、亚胺培南、
氧氟沙星、呋喃妥因、头孢噻喹、阿奇霉素及萘啶酸的多重
耐药霍氏肠杆菌具有较好的体外杀灭作用，能够
抑制多重耐药霍氏肠杆菌的生长，且最低杀菌浓
度为3.2mg/mL，最小抑菌浓度为1.6mg/mL，本发
明提出了中药有效成分香草酸对多重耐药霍氏
肠杆菌的抑制作用，在医药领域具有广泛的应用
价值。权利要求书1页 说明书4页CN 110215445 A 2019.09.10
C N 110215445
A
1.香草酸在抑制多重耐药霍氏肠杆菌生长中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多重耐药霍氏肠杆菌为人源或动物源霍氏肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述霍氏肠杆菌的耐药性是通过纸片扩散法确定的。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多重耐药霍氏肠杆菌耐受的抗生素选自哌拉西林、左氧氟沙星、溴格门汀、亚胺培南、氧氟沙星、呋喃妥因、头孢噻喹、阿奇霉素、萘啶酸中的多种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多重耐药霍氏肠杆菌选自耐哌拉西林、左氧氟沙星、溴格门汀、亚胺培南、氧氟沙星、呋喃妥因、头孢噻喹、阿奇霉素及萘啶酸的霍氏肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述香草酸对所述霍氏肠杆菌的最低杀菌浓度为3.2mg/mL，最小抑菌浓度为1.6mg/mL。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述香草酸对多重耐药霍氏肠杆菌具有体外杀灭作用，以及抑制多重耐药霍氏肠杆菌的体外生长。
8.香草酸在制备抗多重耐药霍氏肠杆菌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述多重耐药霍氏肠杆菌为人源或动物源霍氏肠杆菌。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述多重耐药霍氏肠杆菌选自对哌拉西林、左氧氟沙星、溴格门汀、亚胺培南、氧氟沙星、呋喃妥因、头孢噻喹、阿奇霉素、萘啶酸中多种抗生素耐药的霍氏肠杆菌。
权 利 要 求 书1/1页CN 110215445 A
香草酸在抑制多重耐药霍氏肠杆菌生长中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及中药有效成分香草酸作为肠杆菌的抑制剂的应用，具体涉及香草酸在抑制多重耐药霍氏肠杆菌生长中的应用。
背景技术
[0002]霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)属于革兰氏阴性肠道杆菌，是引起人类或动物感染性疾病的主要肠道致病菌，对人或动物均可引起腹泻、肠炎、胃肠道感染等。而且近年来霍氏肠杆菌的潜在危害日益加剧，有学者(明德松，朱焱，谢尊金.脑卒中患者痰霍尔曼肠杆菌耐药性及耐药机制的研究[J].中华医院感染学杂志,2011,21(05):1025-1026.)从婴幼儿奶粉中分离到霍氏肠杆菌，婴幼儿感染霍氏肠杆菌后还可引起包括脑卒、早产和体弱婴儿的菌血症等。随着抗生素类药物的过量使用和滥用，一部分致病细菌在药物的长期刺激下，变异成为多重耐药菌株。由于这种耐药性既会被其他细菌所获得，又会遗传给下一代，加快或者改变细菌的进化，导致产生超级细菌。而且抗生素的滥用也会对机体产生极其严重的危害，比如人体器官的病变、导致二重污染、发生过敏反应或产生毒副作用等。 [0003]细菌耐药性问题已是一项亟待解决的全球性难题，在面对细菌耐药性增强的问题上，中草药显示出得天独厚的优势，例如，具有多成分、多靶点、毒副作用小、不易产生耐药性、反复使用依然有效、不易产生过敏现象、对胃肠道无损伤、对肝肾刺激小、来源广泛、价格便宜的优点。因而，安全有效的中草药成为人们寻高效低毒的细菌抑制剂的新途径。[0004]香草酸(4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，vanillic acid)是一种氧化形式的香兰素，属于酚酸类物质。分子式是C8H8O4，分子量是168.15，CAS号是121-34-6，熔点是208-210℃，分子结构是：
[0005]
[0006]香草酸作为景天三七、地骨皮、白花丹及胡黄连等植物的有效成分之一，国内外对其在抗菌消炎、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、调节神经及促凝血活性方面都有一定的研究，但是关于香草酸抑制细菌生长方面的报道较少。文献(李承勇，郝川，史舒，关帅，土继政.香草酸对大鼠膀胱感染性结石的干预研究[J].中国药物与临床,2019,19(05):714-715.)报道了通过体外实验研究香草酸等11种酚类化合物对感染性结石形成的抑制作用，通过与传统抑制物比较发现，香草酸抑制细菌生长和晶体形成的活性最强，对实验中的奇异变形杆菌、克雷伯菌、葡萄球菌、大肠杆菌等均有抑制作用。而关于将香草酸作为抑制霍氏肠杆菌生长的活性成分的报道尚未见到。
发明内容
[0007]本发明的目的在于提供香草酸在抑制多重耐药霍氏肠杆菌生长中的应用，为开发新型抗生素替代物提供实践基础。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0009]利用纸片扩散法确定霍氏肠杆菌对抗生素的耐药性，通过二倍稀释法确定香草酸对霍氏肠杆菌的最低杀菌浓度和最小抑菌浓度。结果表明：非抗生素类化合物香草酸对多重耐药霍氏肠杆菌具有较好的
抑菌作用，可以用于抑制多重耐药霍氏肠杆菌的生长。[0010]优选的，所述多重耐药霍氏肠杆菌为人源或动物源耐哌拉西林、左氧氟沙星、溴格门汀、亚胺培南、氧氟沙星、呋喃妥因、头孢噻喹、阿奇霉素、萘啶酸中多种抗生素的霍氏肠杆菌。
[0011]优选的，所述香草酸对耐抗生素哌拉西林、左氧氟沙星、溴格门汀、亚胺培南、氧氟沙星、呋喃妥因、头孢噻喹、阿奇霉素及萘啶酸的霍氏肠杆菌具有抑制作用。
[0012]优选的，所述香草酸的最低杀菌浓度为3.2mg/mL，最小抑菌浓度为1.6mg/mL。[0013]本发明的有益效果体现在：
[0014]本发明从现存药用植物资源库入手，挖掘潜在的耐药菌抑制剂，基于中药有效成分香草酸对多重耐药霍氏肠杆菌的作用研究，利用香草酸抑制多重耐药霍氏肠杆菌的生长，为多重耐药霍氏肠杆菌抑制剂的研究开发和应用提供新的思路，并为解决抗生素类耐药性提供有益帮助，在医药领域具有广泛的应用价值。
[0015]进一步的，本发明针对临床耐药难题，利用香草酸对多重耐药霍氏肠杆菌的抑制作用，将其作为抗生素的替代品，可缓解或解决多重耐药霍氏肠杆菌的耐药感染问题，降低病死率。
具体实施方式
[0016]下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
[0017]1、霍氏肠杆菌的药敏实验
[0018]本发明以人源霍氏肠杆菌为出发菌株(菌株样本取自疾病预防控制中心)，选用哌拉西林、左氧氟沙星、庆大霉素、溴格门汀、亚胺培南、氧氟沙星、呋喃妥因、头孢噻喹、阿奇霉素、萘啶酸10种常用抗生素的药敏试纸片进行药敏试验。
[0019]挑取培养了18～24h的单菌落均匀溶解于2～5mL无菌生理盐水中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊。无菌吸取50～200μL菌液，用棉签将菌液均匀涂布平板，室温下放置3～5min。然后用无菌镊子按要求将药敏试纸片(直径为6mm)紧贴于平板表面，每种药敏试纸片三个平行。将接种好的平板于36～37℃培养16～24h。用0.02mm精度的游标卡尺测定抑菌圈直径，以抑菌圈的直径来判断人源霍氏肠杆菌对药物的敏感性，抑菌结果根据美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定，判定标准见表1。实验结果见表2，结果显示，1株霍氏肠杆菌(1#菌株)可以耐受9种临床上常见的抗生素，因此将其作为下一步实验的研究对象。
[0020]表1.美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定结果
[0021]
[0022]表2.霍氏肠杆菌的药敏实验抑菌圈直径结果
[0023]
[0024]注：抑菌圈直径的单位为mm，数值均为三个平行的平均值
[0025]2、香草酸对多重耐药菌株的抑制作用
[0026]为了充分考虑用药安全，本发明以香草酸单一活性成分为研究对象，以ATCC700323为参考菌株(参考菌株购买于北纳生物菌种保藏中心，参考菌株对亚胺培南和美罗培能高度敏感)，以1#菌株为实验菌种，进行耐药性抑制作用的研究。挑取培养18～24h 的纯菌落均匀溶解于2～5mL LB液体培养基中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊，并用酶标仪测定其OD600值。用二甲基亚砜配制浓度为30mg/mL的香草酸作为药液，利用试管二倍稀释法将药液、菌液及LB液体培养基加入96孔培养板中培养24h，不同浓度的药液组均为三个平行，确保实验数据的可信度。
[0027]利用酶标仪测定香草酸对霍氏肠杆菌(1#菌株)以及参考菌株ATCC700323的最小抑菌浓度(MIC)。并将MIC浓度下的培养液转接于无菌的LB液体培养基中继续培养，利用酶标仪测定香草酸对霍氏肠杆菌(1#菌株)以及参考菌株ATCC700323的最低杀菌浓度(MBC)，实验结果见表3。
[0028]表3.香草酸对多重耐药霍氏肠杆菌以及参考菌株ATCC700323的抑制结果
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