(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011084828.1
(22)申请日 2020.10.12
(71)申请人 上海市公共卫生临床中心
地址 201508 上海市金山区漕廊公路2901
号
(72)发明人 朱同玉 赵运泽 陈立光 顾敬敏
程梦珺 吴楠楠 郭晓奎 郭明权
乐率 秦金红
(74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务
所(普通合伙) 31262
代理人 周春洪
(51)Int.Cl.
C12N 7/02(2006.01)
A61K 35/76(2015.01)
A61P 31/04(2006.01)
C12R 1/92(2006.01)
(54)发明名称一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法及应用(57)摘要本发明涉及一种噬菌体制剂中内毒素(LPS)的去除方法及其应用，所述方法包括步骤：用氯仿杀菌、通过离心的方式去除噬菌体制剂中细菌碎片等杂质→活性剂TritonX ‑100将与噬菌体相结合的LPS解离，并使大分子LPS降解成小分子LPS →透析清除游离的小分子LPS →PEG8000浓缩提高噬菌体滴度及去除大分子LPS →氯仿去除引入的杂质→透析去除有机溶剂。其优点表现在：(1)成本低，所用设备简单，常规实验室均能满足。(2)在不影响噬菌体活性的基础上，实现去除噬菌体制剂中LPS含量至5EU/ml以下。(3)回收后活性噬菌体滴度最高可达回收前的120％。(4)对噬菌体或蛋白制剂的内毒素去除具有普遍适用 性。权利要求书1页 说明书10页 附图7页CN 112175915 A 2021.01.05
C N 112175915
A
1.一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法，其特征在于，包括步骤：
(1)加入氯仿到噬菌体母液中裂解细菌释放全部噬菌体；
(2)加入5％TritonX -100将与噬菌体制剂结合的LPS解离、将溶液中游离的大分子LPS 降解为小分子LPS；
(3)透析去除溶液中游离的小分子LPS；
(4)PEG8000浓缩去除大分子LPS和TritonX -100，提高噬菌体滴度；
(5)加入氯仿去除残留的TritonX -100和PEG8000；
(6)透析去除残留的杂质，获得超低内毒素水平的噬菌体制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：加入5％TritonX -100，涡旋振荡，再置于37℃、220rpm恒温摇床中震荡孵育2-3h，孵育完成后，进行10000rpm/min离心15min，取上清。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中加入的PEG8000的浓度为10％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，回收后活性噬菌体滴度最高可达回收前的50％-120％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)制备噬菌体母液；
(2)氯仿除菌：在噬菌体母液中按照1％的比例加入氯仿，涡旋震荡1min，充分混匀，然后冰浴20min，
期间上下颠倒2-3次，冰浴完成后进行8000rpm/min离心10min，取上清液，上清液即为噬菌体扩增除菌液；
(3)TritonX -100解离以及降解LPS ：在噬菌体扩增除菌液中按照5％的比例加入TritonX -100，涡旋震荡，使TritonX -100完全溶解于溶液中，然后置于37℃、220rpm恒温摇床中震荡孵育2-3h，孵育完成后，进行10000rpm/min离心15min，取上清液；
(4)透析：将上清液置于Biotech CE Tubing MWCO:1000kD的透析膜中，置于100倍体积的生理盐水中，在400rpm/min磁力搅拌器上进行透析两次，每次4h；
(5)PEG8000浓缩：将透析后的溶液置于离心管中，按照5.84g/100ml加入固体NaCl，充分溶解，再按照10％比例加入PEG8000使其溶解，使溶液变成均质的溶液，然后置于4℃过夜静置或静置8h，再进行12000rpm/min离心20min，离心后弃去上清，离心管倒置2-3min，按照原溶液的10％加入洗涤液进行重悬，充分清洗管壁，所得的液体即为噬菌体浓缩液；
(6)氯仿抽提：将重悬后的溶液按照1：1的比例加入氯仿溶液，涡旋震荡1min，充分混匀，然后进行5000rpm/min离心5min，取上清重复抽提一次；
(7)透析：将步骤6中所获得的溶液稀释，稀释后移入Biotech CE Tubing MWCO:1000kD 的透析膜中置于100倍体积的生理盐水中进行透析，透析2次，除去溶液中的氯仿溶液。
6.权利要求1-5任一所述的方法在利用细菌制备药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等产LPS的革兰阴性菌。
权 利 要 求 书1/1页CN 112175915 A
一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法及其应用。
背景技术
[0002](一)噬菌体模块：
[0003]细菌耐药性已成为抗感染领域面临的巨大挑战，也是全世界医学领域广泛关注的问题之一。根据中国信息耐药网2019年发布的数据，引起的疾病的病原细菌中70％左右是革兰阴性菌。2019年主要临床分离菌种中前五位的分别为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单
胞菌。其中许多病原菌对不同种类的抗生素均产生了不同程度的耐药性。致使临床效果越来越差、药物副作用也越来越大、成本逐年升高。据世界卫生组织统计，全球每年有70万人死于“超级细菌”感染，其中包括23万名新生儿。针对细菌耐药问题，尽管世界各国都广泛重视抗生素的研发，但近年来新型抗生素的开发速度显著减缓、难度日益加大。针对一些多药耐药细菌，现有抗生素的效果越来越有限。因此，亟须寻其他方法来临床上的难治性细菌感染，目前国内外的研究热点主要集中在噬菌体抗感染。
[0004]噬菌体是一类原核细胞病毒，特异性感染细菌，是天然的抗菌药物，能够裂解细菌，而且效果不因细菌耐药性而改变，为耐药细菌感染提供了新思路。噬菌体一般通过宿主细菌中扩增获得，对革兰阴性细菌来说，噬菌体裂解细菌释放过程中会同时释放大量的内毒素。内毒素水平超标已经成为噬菌体制剂安全性的一大障碍，去除内毒素以获得纯净安全的噬菌体是噬菌体临床应用必须要解决的一大难题。
[0005](二)内毒素模块：
[0006]内毒素(endotoxin)，又叫做脂多糖(LPS)，是革兰阴性菌的细胞壁成分，基本单位大小是10kDa到20kDa，但游离的内毒素可以聚集成不同大小的分子团。
[0007]内毒素非常耐热，在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏其生物活性。内毒素在人体内会导致
广泛的生物学效应。在中等剂量下，内毒素会产生中度发烧并刺激免疫系统。高剂量时，会产生高烧，低血压，弥散性凝血和致命性休克。因此，欧洲和美国药典制定了人体用制剂的内毒素阈值(≦5EU/kg体重*小时。但是目前，在噬菌体制剂中没有一种适应性广且能够工业化生产低内毒素的解决方案。
[0008](三)内毒素去除目前现状：
[0009]目前内毒素去除主要有两大类方法：
[0010]①非选择性去除法：
[0011]1、根据LPS分子量大小采用物理性方法进行去除
[0012]1)超滤法：选用合适的超滤膜可以将溶液中游离的小分子LPS进行去除，主要适用于目标产物分子量大的溶液，但对于与噬菌体相结合的LPS以及大分子LPS效果比较差，并且回收率较低。
[0013]2)密度梯度超速离心法：利用蔗糖密度梯度或氯化铯密度梯度超速离心的方法来分离去除LPS。此法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
[0014]此法的缺点是：因LPS不同的存在形式，分子大小、密度、沉降系数的不同，此方法应用受限。对于设备、人员要求较高，需要具备超速离心机以及专业的人员来操作，操作严格，不易掌握，对于普通实验室很难达到。此方法对于样本的要求也较高，对于噬菌体来说，病毒滴度需要达到较高的滴度才能出现较为明显的目标条带，但大部分噬菌体(病毒)很难达到较高的滴度，所以难以采用此方法进行噬菌体制剂中内毒素的去除。另外一个制约此方案的原因在于，每次处理样品量较少，离心时间较长，过程较为复杂，很难进行工业化生产，尤其对于种类繁多的噬菌体来说。
[0015]3)活性炭吸附：适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中LPS的去除，选择性较差，易吸附有效成分，残余活性炭不易去除。分子筛：利用凝胶分子的空间网状结构进行过滤层析，处理量小，且耗时长，适用于蛋白分子量小溶液。
[0016]2、根据LPS在溶液中带负电的特性进行去除。
[0017]1)荷电微滤：选用带正电荷的膜材质如聚矾、聚丙烯腈等微孔滤膜进行荷电微滤，并筛选合适的PH条件，可提高对LPS分子的去除效果，但前期需要对每一种噬菌体的最适条件进行摸索，操作较为复杂，样本回收率较低，同样很难进行工业化生产。
[0018]2)离子交换：适于从碱性蛋白质中去除LPS，成本低，吸附容量大。但不适合于溶液中存在其他带负电荷物质(如噬菌体)的情况。
[0019]3、根据类脂A(是LPS的生物活性中心，具有亲、疏水双性)的特性进行LPS的去除。双相萃取法：TritonX-114萃取：TritonX-114是一种疏水的表面活性剂，用其采用相分离法去除细胞素C、过氧化氢酶以及血清白蛋白中的LPS，有较好效果。但是Triton X-114毒性较高、易残留，影响产品的性能。
[0020]②选择性去除：
[0021]1、免疫配基：根据抗原-抗体高特异性结合的机制，研究者用抗rHu-TNFa单克隆抗体为配基的吸附柱，用于清除LPS血症中的LPS。免疫亲和具有高度特异性，但是这种配基制备困难，应用范围狭窄，同时还有价格昂贵、洗脱困难的问题。
[0022]2、多粘菌素B(PMX-B)：PMX-B能依靠其环形肽结构降解革兰阴性细菌的细胞壁，其阳离子与类脂A的磷酸基团之间的静电作用力和疏水作用力使其能识别不同来源的LPS分子。采用固定PMX-B的纤维素(或琼脂糖)载体去除LPS，有良好的效果和稳定性。但是PMX-B 的价格昂贵，且有肾毒性和神经毒性，应谨慎应用。
[0023]3、脱氧胆酸盐(DOC)：DOC是一种表面活性剂，可以解离破坏LPS因疏水作用而形成的胶束结构，阻碍LPS的结合实现分离。从而对于溶液中的内毒素具有一定的清除作用，但单独使用对于溶液中的内毒素去除效果一般。
[0024]TritonX-100：Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，是一种亲水的非离子型表面活性剂(或称去污剂)。它能溶解脂质，以增加细胞膜对抗体的通透性，对病毒及蛋白中的LPS具有较好的解离性，使与蛋白结合的LPS解离下来，以及使大分子LPS降解成小分子LPS，但不具有清除LPS的能力。所以，单独使用效果不理想。
[0025]聚阳离子：聚阳离子能以静电作用，范德华力和氢键与LPS分子稳定结合，以其为配基的吸附介质，其吸附LPS分子的过程似于絮凝过程，与蛋白分子的吸附很少。此类配基如聚乙稀亚胺(PEI)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚L-组氨酸(PLH)等，生物相容性要优于PMX-B，吸附能力优于组氨酸。但中的效果来看，LPS去除效果一般，且操作复杂，成本较高，不能用于工业化生产。
[0026](四)低内毒素噬菌体制剂应用市场
[0027]“超级细菌”所引起的多重耐药(multi-drug resistant，MDR)细菌感染，在欧洲，每年约有25000名患者死于多重耐药菌感染，其死亡率超过了50％。在美国，每年由耐药细菌感染所导致的医疗支出高达200亿美元。耐甲氧西林金黄葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MARS)在美国首次出现就导致了每年约19000人的死亡和30-40亿美元的财产损失。新抗生素的发现已经变得很困难，而细菌的耐药的问题却愈演愈烈。根据兰德公司(RNAD Coperation)预测，按照目前的细菌耐药速度，即将到来了的2020年将有250万人死于细菌耐药性(Antimicrobial resistance,AMR)，十年后上升至590万人，
到2050年达到惊人的每年1400万人。而如果按照恶化至100％耐药率的极端情况，2050年的这一数字高达4.44亿。另一方面，这两种情况下AMR对世界经济带来的损失将占GDP的0.06％至3.1％之间每年，导致的累计GDP损失在2.1万亿美元到124.5万亿美元之间。[0028]在抗生素穷途末路的时代，噬菌体在这场战役中能否维持甚至降低细菌耐药性进展的速度和其带来的损失，是所有人拭目以待的。噬菌体由于独特的杀菌机制，在对抗耐药细菌方面显示出了卓越的天赋。因此，世界各国和医药企业对噬菌体的关注和投入日益加大。国内外先后成立多家噬菌体、研发机构和公司。近几年，仅勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim)和Roivant两家公司就在噬菌体抗感染领域投资20多亿美金；Locus Biosciences以8.18亿美元授权强生公司开发商业化工程噬菌体技术平台及管线；Bioharmony Therapeutics与勃林格殷格翰签订了总价值约5亿美元的噬菌体裂解酶在研产品授权协议；iNtRon Biotechnology与Roivant就一项噬菌体裂解酶药物达成了总价值6.67亿美元的授权。国内也出现了一些很有潜力的噬菌体公司。如曾获得包括药明康德、复星医药、博源资本、元禾原点等投资的菲吉乐科拥有两个噬菌体鸡尾酒管线和两个噬菌体裂解酶管线，已有针对植物和动物的噬菌体产品上市。青岛诺安百特、青岛瑞科盟、大连赛姆、大连汉信、南京巨豹等公司已有已上市或正在开发的动物、水产养殖用噬菌体及噬菌体蛋白类药物。虽然，国内外噬菌体相关产品很多，但据真正的临床应用还是有一段距离的。这其中较为主要的瓶颈问题就是噬菌体生物制剂中的内毒素含量，是否能够达到国际要求的标准。
[0029]耐药菌感染的复杂性会给噬菌体带来一定的难度。噬菌体能否和病原菌直接接触，直接关系
到噬菌体的效果。噬菌体在不入血的情况下，其难度在一定程度上源于噬菌体给药途径的选择上。如果噬菌体入血，则要求噬菌体达到国家相关法规下药物入血的标准，而这也是目前噬菌体需要解决的问题。
[0030]总之，目前的方法制备的噬菌体制剂中内毒素指标远高于5EU/ml，噬菌体制剂去除内毒素工艺还需提升，批量化去除噬菌体制剂中的内毒素是势在必行的，是噬菌体走向临床必须要克服的重大难题之一。
[0031]本发明旨在针对现有技术的不足提供一种噬菌体裂解液中细菌内毒素的去除方
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