(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510549782.9
(22)申请日 2015.08.31
C12Q 1/68(2006.01)
C12Q 1/04(2006.01)
C12R 1/25(2006.01)
C12R 1/245(2006.01)C12R 1/225(2006.01)
(71)申请人江南大学
地址214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道
1800号江南大学
(72)发明人陈卫 赵国忠 王梦颖 韩俊燕
张灏 赵建新 田丰伟 张秋香
张白曦 王刚 刘小鸣 郭敏
(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限
公司 12209
代理人
韩晓梅
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种乳杆菌肠道定植能力的测定
方法，包括如下步骤：⑴收集摄入混合菌液/菌粉
组的提取，得粪便细菌基因组；⑶选择特异性荧
光定量PCR 引物，并检测其扩増特异性；⑷分别采
用上述六种乳杆菌的细菌基因组为模板，分别制
作六种乳杆菌拷贝数与ct 值之间的标准曲线；⑸
荧光定量PCR，得到ct 值，通过换算即可得到单位
粪便样品中各种乳杆菌的量；⑹比较在摄入混合
菌液/菌粉前后的受试者粪便中的乳杆菌含量，
即得菌株在肠道的定植能力。本方法基于荧光定
量PCR，能够在较短的时间完成粪便样品中六种
乳杆菌的快速准确定量，进而比较其肠道定植能
力。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书3页 说明书12页序列表3页 附图10页CN 105039578 A 2015.11.11
C N 105039578
A
1.一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
⑴收集摄入混合菌液/菌粉的受试者在摄入菌前后的新鲜粪便，得粪便样品；
⑵定量称取粪便样品，进行粪便中细菌基因组的提取，得粪便细菌基因组；
⑶选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物，并检测其扩増特异性；
⑷分别采用上述六种乳杆菌的细菌基因组为模板，采用步骤⑶中六对特异性荧光定量PCR引物进行普通
PCR，对得到的产物进行切胶回收，测定回收产物浓度，计算出拷贝数，对产物进行梯度稀释，以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，采用相应的特异性荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR，得到ct值，分别制作六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲线；
⑸以步骤⑵中粪便细菌基因组为模板，分别采用步骤⑶中的六对特异性荧光定量PCR 引物进行荧光定量PCR扩增，得到不同样品荧光定量PCR的ct值，带入步骤⑷中计算出的相应标准曲线方程中计算出拷贝数，通过换算即可得到单位粪便样品中各种乳杆菌的量；
⑹比较在摄入混合菌液/菌粉前后的受试者粪便中的乳杆菌含量，即得菌株在肠道的定植能力。
2.根据权利要求1所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑴中混合菌液/菌粉为含有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的混合菌液/菌粉；
或者，所述步骤⑴的具体步骤如下：分别制备植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌菌粉，平板计数计算菌粉中活菌数，制备含有六种乳杆菌的混合菌液/菌粉，保证其中每种菌的浓度相同，混合菌粉于-20℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑶中选择植物乳杆菌、
干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物的具体步骤如下：
通过NCBI检索得到植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌的16S rRNA序列，通过比对这些序列，到一种乳杆菌与其他乳杆菌有差异的可变区序列，根据这些序列采用premier 5.0软件设计特异性引物，使用该引物能特异性的扩增出该种类的乳杆菌，达到定量检测的目的。
4.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑴的具体步骤为：
以一定量六种不同乳杆菌混合菌粉或菌液喂食受试者，喂食2-4周之后，停止摄入乳杆菌，收集摄入乳杆菌前及停止摄入乳杆菌后不同阶段的受试者新鲜粪便100-200mg，于-80℃冰箱中保存、备用。
5.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑶中特异性荧光定量PCR引物是分别针对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的特异性PCR引物，这六对引物能特异性扩增出该种乳杆菌16S rRNA中的特异性片段，这六对引物分别为SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4、SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9、SEQ10、SEQ11、SEQ12。
6.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑶中对六对特异性荧光定量PCR引物的扩增特异性的检测，步骤如下：第一步：准备六种乳杆菌的纯培养物，进行细菌基因组的提取，细菌基因组提取方法如下：
①取培养过夜后的六种菌液1-2ml至EP管中，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
②加入1-2ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
③加入200ul SDS裂解液，混匀后在65-80℃恒温保温20-30min；
④加入200-300ul酚-氯仿于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000r/min离心5-10min，取上清200ul；
⑤加入400-500ul冰乙醇于200ul上清液中，-20℃静止30-50min之后，12000r/min离心5-10min，弃上清；
⑥加入500ul 70％冰乙醇重悬沉淀，12000r/min离心1-3min，弃上清，常温干燥；
O溶解沉淀，即得乳杆菌基因组，之后于-20℃保存、备用；
⑦用50-100ul ddH
2
第二步：以得到的乳杆菌基因组为模板，采用六对特异性荧光定量PCR引物进行普通PCR，分别对六对特异性荧光定量PCR引物的特异性进行PCR检测；
其中，PCR体系50μL：10×buffer 5μL；DNTPs 5μL；上游引物20μmol/L 1μL；
O 下游引物20μmol/L 1μL；Taq DNApolymerase 250U 0.5μL；模板DNA 1μL；ddH
2 36.5μL；
PCR程序如下：① 94℃预变性3min；② 94℃变性30s；③ 60℃变性30s；④ 72℃延伸30s；⑤ ②～④循环30次；⑥ 72℃延伸2min；对扩增产物进行琼脂糖电泳，如果一种乳杆菌引物只特异性扩增出相应的菌种基因组中的DNA片段，不扩增出其他菌种DNA片段，即表明该特异性荧光定量PCR引物具有较好扩增特异性，能抵抗同属不同种乳杆菌的干扰，能够用于后期定量检测。
7.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑵中的粪便中细菌基因组的提取采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取粪便基因组，具体操作方法如下：
①称取100-200mg粪便样品于裂解介质管中，加入978ul磷酸盐缓冲液和122ul MT缓冲液；
②将裂解介质管在快速核酸提取仪上破碎、混匀，以6m/s的速度处理20s，处理2次；
③将裂解介质管于14000G的转速下离心5-10min，以破碎菌体；取离心的上清转移至干净的2ml离心管中，加入250ul PPS溶液，于手中振荡10次混匀；
④将2ml离心管于14000G的转速下离心5min，之后转移上清至干净的15ml离心管中；
⑤重悬硅土结合液之后加入1ml至上述15ml离心管中；在振荡器上振荡2min使硅土与DNA结合，静置3min使硅土沉淀；
⑥小心地吸除500ul上清，避免接触到硅土结合液；重悬剩余的硅土结合液和残余的上清，转移600ul重悬的液体至过滤管中，14000G离心1min，清空接收管中液体，加入剩余的硅土结合液和残余的上清并离心，清空接收管中液体；
⑦加入500ul采用无水乙醇稀释8倍后的盐酸乙醇洗脱母液，用移液器吹打均匀；之后于14000G条件下离心1min，清空接收管，重复离心一次，以去除剩余液体；
⑧将过滤管换到新的接收管中，室温干燥5min；
⑨加入50-100ul DNA洗脱液溶液，14000G离心1min，得到粪便基因组，于-20℃保存，备用。
8.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑷中以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，PCR体系20ul：2×SYBR染料预混液10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；DNA模板1ul；ddH
O 1ul；PCR程序如下：① 95℃预变
2
性3min；② 95℃变性5s；③ 60℃变性30s；④ 72℃延伸10s；⑤ 步骤②～步骤④循环40次；⑥ 熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s。
9.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑸中荧光定量PCR扩增的具体操作步骤如下：
PCR体系20ul：2×SYBR染料预混液10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；DNA模板1ul；
O 1ul；PCR程序如下：① 95℃预变性3min；② 95℃变性5s；③ 60℃变性30s；④ ddH
2
72℃延伸10s；⑤ 步骤②～步骤④循环40次；⑥ 熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s。
10.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑹的具体判断方法如下：
将停止摄入乳杆菌后2～14天的受试者粪便中各种乳杆菌的量，与摄入乳杆菌之前的水平进行比较，高于之前的菌量即表示定植，由此能够得到每株乳杆菌的肠道定植时间，进一步地能够定量比较每株菌的定植量。
一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，尤其是一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，该方法基于荧光定量PCR、能快速准确测定植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌六种乳杆菌在肠道的定植能力。
背景技术
[0002] 乳酸菌是一能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的总称，乳酸菌中比较重要的属有：乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属、片球菌属、明串珠菌属等，其中，乳杆菌属细菌因其良好的生长发酵特性及益生功能，被广泛应用于食品发酵、工业乳酸生产及医疗保健等领域，与人类每日生
活密切相关。乳杆菌具备了良好的发酵特性及益生功效，不仅能够提高食品的营养价值，改善食品风味，提高其附加值及保藏性，而且能够调节肠道菌、保持微生态平衡、增强机体免疫作用，但乳酸菌在人体内发挥益生功效的前提条件是能够通过上消化道顺利到达肠道，牢固地粘附在肠壁上，不会随着食物的运动和肠道蠕动被逐步排出体外，且能够适应肠道环境，不断繁殖，使自身保持一定数量，即定植于肠道，因此乳杆菌在肠道定植对其益生功效的形成至关重要，乳杆菌的肠道定植能力在很大程度上决定了其益生功效的高低，所以，乳杆菌菌株肠道定植能力的评价对于工业应用菌株整体功能性的评价及筛选具有重要的意义。
[0003] 对于菌株肠道定植能力的测定，目前有以下几种方法：
[0004] 1、传统的平板培养方法
[0005] 该方法是通过对摄入菌株后的动物或人粪便中菌株进行选择性平板培养计数，计算其中菌量。该方法操作繁琐、耗时较长且对选择性培养基的选择精确度有较大的依赖，只能计算活菌数，不能准确反应菌株在肠道的定植状况。
[0006] 2、梯度变性凝胶电泳(DGGE-PCR)技术
[0007] 该方法对摄入益生菌后的实验动物或人体粪便进行如下处理：总基因组的提取→16S rRNA可变
区扩增→梯度变性凝胶电泳→染成像→切胶回收→转化克隆→测序比对，分析数据可得到每个粪便样品中菌系组成及显示条带的菌的相对含量。DGGE-PCR侧重于样品菌多样性的分析，能够反映粪便菌构成与多样性，能够准确定性，但其基于灰度计算的半定量分析方法不能够达到准确定量的目的，且电泳结束后的后期处理繁琐，在测序比对这一步会产生大量的费用，不是一种准确快捷的定植能力测定方法。
[0008] 3、基于16S rRNA特异性探针的荧光原位杂交技术
[0009] 该技术采用基于菌株的特异性探针进行原位杂交，结合流式细胞仪对灌胃菌株后的实验动物粪便中带荧光菌株相对含量进行测定。该方法在一定程度能够在微观分子水平上准确反映菌株在肠道的定植情况，但该方法前期准备工作复杂，需要良好的分子操作能力，且工作效率较低，而该方法最主要的局限在于只能用于动物实验，无法进行人体实验，无法准确反映菌株在人体肠道定植情况。
[0010] 4、实时荧光定量PCR法
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议